DE1442248B - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 5'-Inosinsäure - Google Patents
Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 5'-InosinsäureInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 5'-Inosinsäure, wobei in einem
wäßrigen Adenin enthaltenden Nährmedium Adeninauxotrophe Mikroorganismen bei hierfür üblichen
Bedingungen gezüchtet werden.
Die französische Patentschrift 1 274137 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Inosinsäure
unter Verwendung eines Adenin benötigenden Stammes, der zu den Genera Bacillus, Escherichia, Streptomyces,
Saccharomyces, Torula, Aspergillus und Penicillium gehört. Die bei diesem Verfahren erzielte Ausbeute
beträgt jedoch nur 5 bis 95 mg/100 ml (0,05 bis 0,95 mg/ml).
Die französische Patentschrift 1 307 352 hat die Verwendung eines Adenin benötigenden Stammes,
der zu den Spezies Micrococcus glutamicus, Streptomyces griseus und Neurospora crassa gehört, zur
Herstellung von 5'-Inosinsäure zum Inhalt. Bei diesem Verfahren wird jedoch nur eine Ausbeute von 0,45
bis 2,3 mg/ml erzielt.
Die Erfindung hat sich daher die Aufgabe gestellt, ein Verfahren zu entwickeln, bei dessen Durchführung
beträchtlich höhere Ausbeuten erzielt werden.
Ausgehend vom aufgezeigten Stand der Technik ist das erfindungsgemäße Verfahren zur biotechnisehen
Herstellung von 5'-Inosinsäure, wobei in einem wäßrigen Adenin enthaltenden Nährmedium Adeninauxotrophe
Mikroorganismen bei hierfür üblichen Bedingungen gezüchtet werden, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Adenin-auxotrophe Mikro-Organismen Brevibacterium ammoniagenes ATCC
15 187, -ATCC15 188, -ATCC15 189 oder -ATCC
15 190 einsetzt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden beträchtlich höhere Ausbeuten an 5'-Inosinsäure erzielt,
beispielsweise 5,3 bis 5,5 mg/ml.
Die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen sind Mutanten, die zum Wachstum Adenin
erfordern und welche durch Behandlung von Brevibacterium ammoniagenes, z. B. ATCC 6871 und
ATCC 6872, in an sich bekannter Weise mit einem oder mehreren die Mutation hervorrufenden Mitteln,
wie z. B. CO60, Röntgenstrahlen und Gammastrahlen, erhalten werden. Die Mutante Brevibacterium ammoniagenes
ATCC 15 188 erfordert zwar außer Adenin noch Xanthin, dies ist jedoch für das erfindungsgemäße
Verfahren ohne Belang.
Das wäßrige Nährmedium muß die erforderlichen Wachstumsfaktoren als solche oder ein dies enthaltendes
Material, eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle und Mineralien enthalten. Adenin gehört stets zu
den erforderlichen Wachstumsfaktoren. Es kann als solches verwendet werden oder durch Stoffe, die
Adenin enthalten, beispielsweise Hefeextrakt, Fischmehl und Ribonukleinsäure, geliefert werden, wobei
auch Gemische von Adenin und einem oder mehreren Stoffen, die Adenin enthalten, verwendet werden
können.
Als Kohlenstoffquelle kann ein Kohlenhydrat, z. B. Glukose oder irgendeine andere Kohlenstoffquelle,
die der Mikroorganismus in seinem Stoffwechsel verarbeiten kann, beispielsweise Stärkehydrolysate
und Glutaminsäure, eingesetzt werden. Die Stickstoffquelle kann entweder in Form einer organischen
Verbindung, beispielsweise Harnstoff, oder einer anorganischen Verbindung, beispielsweise Ammoniumchlorid,
vorliegen, soweit der Stickstoff in einer für den Mikroorganismus zugänglichen Form zur Verfügung
steht. Als Beispiele für Mineralien werden Kaliumphosphate, Magnesiumsulfat und Calciumchlorid
genannt.
Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen, z. B. durch Schütteln oder durch Belüftung und Rühren,
bei Temperaturen im Bereich von 20 bis 40° C durchgeführt. Der pH-Wert des wäßrigen Mediums wird
mit Neutralisierungsmitteln, wie z. B. wäßrigem Ammoniak, wäßrigem Natriumhydroxyd oder Harnstoff
(der durch Urease in Kulturen in NH3 und CO2
zersetzt werden kann), eingestellt.
In überraschender Weise sammeln sich große Mengen von 5'-Inosinsäure manchmal zusammen mit
einer relativ geringen Menge Hypoxanthin sowohl in dem wäßrigen Medium als in den Zellen gewöhnlich
innerhalb einer Fermentationszeit von 2 bis 8 Tagen an.
Nach Beendigung der Fermentation wird die Inosinsäure durch Ionenaustauschmittel gewonnen, wie
später im Beispiel 1 beschrieben wird, oder durch ähnliche Verfahren unter Verwendung anderer bekannter
Ionenaustauscher oder anderer bekannter Gewinnungsverfahren, wie z. B. Extraktion, Adsorption
und Ausfällung.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. Die Prozentangaben stellen, falls
nicht anders angegeben, Gewichts-Gewichts-Prozent dar. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Ein wäßriges Nährmedium für die Herstellung einer Impfkultur, bestehend aus
Bestandteile
Glukose
Pepton
Rindfleischextrakt (Adenin-haltig)
Natriumchlorid
Biotin
Wasser (destilliert)
Gehalt
2%
1%
1%
0,3% 20 mcg/1
Rest
0,3% 20 mcg/1
Rest
dessen pH-Wert vorher mit 5 n-NaOH auf 7,2 eingestellt
wurde, wurde sterilisiert. Eine 30-ml-Menge des sterilisierten wäßrigen Nährmediums wurde in
jeden einer Anzahl 500-mI-Erlenmeyer-Kolben gegeben.
Das Medium in jedem dieser Erlenmeyer-Kolben wurde mit einer Kultur aus Brevibacterium
ammoniagenes ATCC 15 187(eineAdenin benötigende Mutante von Brevibacterium ammoniagenes ATCC
6872) beimpft. Das beimpfte Medium wurde 24 Stunden bei einer Temperatur von 30° auf einer Schüttelmaschine
geschüttelt.
Die sich ergebende Impfkultur wurde in einer Menge von 10 Volumprozent in ein sterilisiertes
wäßriges Fermentationsnährmedium gegeben.
Das wäßrige Fermentationsnährmedium bestand aus
| Bestandteile | Menge |
| Glukose NH4Cl KH,PO4 K,HPO4 |
70 g 13g 10g 10 g |
Fortsetzung
Bestandteile
MgSO4 -7H2O
Maisquellwasser (Adenin - haltig) Wasser (destilliert)
Menge
0,4 g
6g
ergänzend auf 11 Gesamtvolumen
Das Fermentationsnährmedium wurde vor dem Sterilisieren auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt.
Ein 30-ml-Anteil des sterilisierten wäßrigen Fermentationsnährmediums,
zu dem 10 Volumprozent Impfkultur zugefügt waren, wurde in jeden einer Anzahl von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben. Danach
wurde zu dem Inhalt jedes Kolbens 10 g CaCO3
zugefügt, das gesondert sterilisiert worden war. Das sich ergebende Medium wurde 96 Stunden bei 30° C
auf einer Schüttelmaschine geschüttelt. Danach hatten sich 9,8 mg 5'-Inosinsäure pro Milliliter Fermentationsfiüssigkeit
gebildet.
Gewinnung der 5'-Inosinsäure
Die Fermentationsflüssigkeit wurde abfiltriert und der pH-Wert des Filtrats mit HCl auf 1,4 eingestellt.
Das so behandelte Filtrat wurde durch eine Kolonne eines sulfonierten Polystyrolkationenharzaustauschers
(Η-Form) geschickt. Sofort nachdem das Filtrat unter die Oberfläche der Kolonne abgesunken war,
wurde destilliertes Wasser in die Kolonne eingeführt. Das Filtrat wurde mit den Fraktionen, die folgten und
ebenso Inosinsäure enthielten, vereinigt. Der pH-Wert der kombinierten Fraktionen wurde mit Natriumhydroxyd
auf 7,2 eingestellt. Die eingestellten Fraktionen wurden im Vakuum bei etwa 50 mm Hg
und etwa 30° konzentriert und das konzentrierte Produkt auf etwa 0 bis 2° abgekühlt. Durch diese
Arbeitsweise konnten 5,2 g kristallines Natrium-5'-inosinat gewonnen werden.
Als Kationenharzaustauscher kann irgendeines der im Handel erhältlichen Produkte verwendet werden,
wie z. B. Diaion SK Nr. 1 (Mitsubishi Kasei Kogyo Co.) oder Amberlite IR-120 (Rohm & Haas). (Das
Verfahren zur Herstellung ist in der USA.-Patentschrift 2 366 007 beschrieben.)
B e i s ρ i e 1 2
Ein wäßriges Fermentationsnährmedium, bestehend aus
Bestandteile
Glukose
(NHJ2SO4
KH2PO4
K2HPO4
MgSO4 · 7 H2O ...
NZ-Amin
Adenin
Wasser (destilliert)
Menge
In jeden Kolben einer Anzahl von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben wurde eine 30-ml-Menge des kombinierten
Mediums gegeben. Danach wurde zu dem Inhalt jedes Kolbens 10 g gesondert sterilisiertes
CaCO3 zugefügt. Das sich ergebende Medium wurde 103 Stunden bei einer Temperatur von 30° auf einer
Schüttelmaschine geschüttelt, während der pH-Wert durch absatzweise Zugabe von Harnstoff auf etwa 7,2
gehalten wurde.
Es wurden 8,5 mg/ml Inosinsäure und 0,2 mg/ml
Hypoxanthin im Medium gebildet.
B e i s ρ i e 1 3
30-ml-Anteile des sterilisierten wäßrigen Nährmediums
für die Herstellung einer Impfkultur, entsprechend Beispiel 1 und zusätzlich 10 mg/1 Xanthin
enthaltend, wurden in eine Anzahl von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und mit Brevibacterium ammoniagenes
ATCC 15 188 (eine Adenin und Xanthin benötigende Mutante von Brevibacterium ammoniagenes
ATCC 6872) beimpft. Das beimpfte Medium wurde 24 Stunden bei einer Temperatur von 30°
auf einer Schüttelmaschine geschüttelt. Die erhaltene Impfkultur wurde in einer Menge von 10 Volumprozent
in sterilisiertes wäßriges Fermentationsnährmedium entsprechend Beispiel 2 gegeben.
Eine 30-ml-Menge des mit der Impfkultur versetzten Fermentationsnährmediums wurde in jeden Kolben
einer Anzahl von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben. Danach wurde zu dem Inhalt jedes Kolbens 10 g
getrennt sterilisiertes CaCO3 zugefügt. Das erhaltene Medium wurde 96 Stunden bei einer Temperatur
von 30° auf einer Schüttelmaschine geschüttelt, wobei der pH-Wert auf etwa 7,2 durch absatzweise Zugabe
von Harnstoff gehalten wurde.
Es wurden 10,2 mg/ml 5'-Inosinsäure und 0,8 mg/ml Hypoxanthin in dem Medium gebildet.
30-ml-Mengen sterilisiertes wäßriges Nährmedium für die Herstellung · einer Impfkultur, entsprechend
Beispiel 1, wurden in eine Anzahl von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und mit Brevibacterium ammoniagenes
ATCC 15189 (eine Adenin benötigende Mutante von Brevibacterium ammoniagenes ATCC
6871) beimpft. Das beimpfte Medium wurde 24 Stunden bei einer Temperatur von 30° auf einer Schüttelmaschine
geschüttelt. Die erhaltene Impfkultur wurde in einer Menge von 10 Volumprozent in sterilisiertes
wäßriges Fermentationsnährmedium gebracht.
Das Fermentationsmedium bestand aus
10% 0,3% 0,3% 0,2% 0,025% 0,6% 4 mg/1 Rest
dessen pH-Wert vorher auf 7,2 eingestellt worden war, wurde sterilisiert. Die Impfkultur (hergestellt
nach Beispiel 1) wurde in einer Menge von 10 Volumprozent in das sterilisierte wäßrige Fermentationsnahrmedium
gebracht.
Bestandteile
Glukose
(NHJ2SO4
KH2PO4
K2HPO4
Maisquellwasser (Adenin-haltig)
NZ-Amin
Adenin
Wasser (destilliert)
Menge
10%
0,3%
0,3%
0,3%
0,5%
0,5%
10 mg/ml Rest
10 mg/ml Rest
Sein pH-Wert wurde vor dem Sterilisieren auf 7,0 eingestellt.
Eine 30-ml-Menge des mit der Impfkultur versetzten
Fermentationsnährmediums wurde in jeden Kolben einer Anzahl von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben
gegeben. Danach wurde zu dem Inhalt jedes Kolbens gesondert sterilisiertes CaCO3 zugefügt. Das erhaltene
Medium wurde 120 Stunden bei einer Temperatur von 30° auf einer Schüttelmaschine geschüttelt,
während der pH-Wert durch absatzweises Zugeben von Harnstoff auf etwa 7,0 gehalten wurde.
Es wurden 11,5 mg/ml 5'-Inosinsäure in dem Medium erzeugt.
30-ml-Mengen sterilisiertes wäßriges Nährmedium für die Herstellung einer Impfkultur, entsprechend
Beispiel 1, wurden in eine Anzahl von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und mit Brevibacterium ammoniagenes
ATCC 15190 (eine Adenin erfordernde Mutante von Brevibacterium ammoniagenes ATCC
6871) beimpft. Das beimpfte Medium wurde 24 Stunden bei einer Temperatur von 30° auf einer Schüttelmaschine
geschüttelt. Die erhaltene Impfkultur wurde in einer Menge von 10 Volumprozent in sterilisiertes
wäßriges Fermentationsnährmedium, entsprechend Beispiel 1, gebracht.
Eine 30-ml-Menge des mit der Impfkultur versetzten Fermentationsnährmediums wurde in jeden
Kolben einer Anzahl von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gebracht. Danach wurden zu dem sterilisierten Inhalt
jedes Kolbens 10 g getrennt sterilisiertes CaCO3 zugefügt.
Dann wurde das erhaltene Medium 103 Stunden bei einer Temperatur von 30° auf einer Schüttelmaschine
geschüttelt.
Es wurden 5,3 mg/ml 5'-Inosinsäure und 0,4 mg/ml
Hypoxanthin in dem Medium gebildet.
30-ml-Anteile sterilisiertes wäßriges Nährmedium
für die Herstellung einer Impfkultur, entsprechend Beispiel 1, wurden in eine Anzahl von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben
gegeben und mit Brevibacterium ammoniagenes ATCC 15190 (einer Adenin erfordernden
Mutante von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871) beimpft. Das beimpfte Medium wurde 24 Stunden
bei einer Temperatur von 30° auf einer Schüttelmaschine geschüttelt. Die erhaltene Impfkultur wurde
in einer Menge von 10 Volumprozent in sterilisiertes wäßriges Fermentationsmedium gebracht.
Das Fermentationsmedium bestand aus
Das Fermentationsmedium bestand aus
| Bestandteile | Menge |
| Glukose | 10% 0,6% 0,7% 0,7% 0,6% 20 mcg/1 0,1% 0,5% Rest |
| Harnstoff | |
| K2HPO4 | |
| KH2PO4 | |
| MgSO4 ■ 7 H2O 15 Biotin |
|
| CaCl2 · 2 H2O Hefeextrakt Wasser (destilliert) |
wobei der pH-Wert vor dem Sterilisieren auf 7,8 eingestellt
wurde.
Eine 30-ml-Menge des mit der Impfkultur versetzten Fermentationsnährmediums wurde in jeden Kolben
einer Anzahl von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben. Danach wurde zu dem sterilisierten Inhalt jedes Kolbens
10 g getrennt sterilisiertes CaCO3 zugefügt. Das erhaltene Medium wurde 96 Stunden bei einer
Temperatur von 30° auf einer Schüttelmaschine geschüttelt.
Es wurden 6,2 mg/ml 5'-Inosinsäure und 0,3 mg/ml
Hypoxanthin in dem Medium erzeugt.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 5'-Inosinsäure, wobei in einem wäßrigen Adenin enthaltenden Nährmedium Adenin - auxotrophe Mikroorganismen bei hierfür üblichen Bedingungen gezüchtet werden, dadurch gekennzeichnet, daß man als Adenin-auxotrophe Mikroorganismen Brevibacterium ammoniagenes ATCC 15187, -ATCC 15188, -ATCC 15189 oder -ATCC 15190 einsetzt.
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