DE1795356C3

DE1795356C3 - Verfahren zur Hersteilung von Inosin und 5'-Guanosinmono-,di-undtriphosphorsäure auf fermentativem Wege

Info

Publication number: DE1795356C3
Application number: DE1795356A
Authority: DE
Inventors: Shigeo Tokio Abe; Akira Furuya; Ryo Okachi
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1967-09-27
Filing date: 1968-09-18
Publication date: 1975-05-22
Also published as: FR1582375A; DE1795356A1; US3616212A; DE1795356B2; GB1209711A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung Von lnosin und 5'-Guanosinmono-. -di- und -triphosphorsäure auf fermentativem Wege durch Züchten eines Mikroorganismus und anschließende Isolierung der genannten Produkte aus dem Kulturmedium.

lnosin, ein Hypoxanthinribosid. findet sich im Fleisch sowie in Fleischextrakten und in Zuckerrüben, lnosin hat ebenso wie die 5'-Guanylsäurenukleotidc S'-Guanosinmono-, -di- und -triphosphorsäure eine weit verbreitete Verwendung in der Biochemie gefunden, lnosin kann beispielsweise aus Adenosin durch chemische Desaminierung mit Nitrit oder durch enzymatische Desaminierung hergestellt werden (vgl. die deutsche Auslegeschrift I 134 995 und »Hoppe-Seyler's Z. für physiologische Chemie«, 324 [1961], S. 163 bis 168). lnosin kann auch auf fermentativem Wege durch Züchten von Mikroorganismen der Gatitung Bazillus substilis in üblichen Nährmedien, die «infache Purine als Zusatz enthalten, hergestellt werden (vgl. die französischen Patentschriften 1 32I 318 und I 461 183). Das 5'-Guanosinmonophosphat (GMP) kann durch enzymatische Hydrolyse von Hefenukleinsäure (vgl. französische Patentschrift I 369 382), durch Phosphorylierung von Guanosin (vgl. Französische Patentschrift I 369 079) oder durch Züchten von Mikroorganismen (vgl. französische Patentschrift 1 372 054) hergestellt werden. Auch ist die Herstellung von 5'-Guanosindiphosphat (GDP) und von 5'-Guanosintriphosphat (GTP) durch Züchten von Mikroorganismen in Gegenwart von 5'-Guanylsäure oder in Gegenwart von Guanin bekannt (\gl. französische Patentschriften I 343 794 und I 440 633).

Demgegenüber ist es nach dem erfindungsgemiißen Verfahren möglich, auf fermentativem Wege gleichzeitig lnosin. das in großem Umfange als Medikament verwendet wird, und 5'-Guanosinmono-, -di- und -triphosphorsäure. die wichtige Nahrungsjnittei/usätze darstellen, im Rahmen eines einzigen, technisch ein- ^fi5 fachen Verfahrens dadurch her/uslellen. daß man die Summe Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21264 oder Corynebacterium glutamicum ATCC 21266 in einem Nährmedium, das pro ml 5 0 bis 30,0 mg y xan'hvlsäure enthält, züchtet und d.e genannten Produkte'aus dem Kulturmedium isoliert.

Die in dem eriindungsgemaßen Verfahren als Ausaangsmaterial eingesetzte 5'-Xanthylsäure kann in erheblichen Mengen großtechnisch auf fermentativem Wece hergestellt werden (vgl. d.e br.t.sche Patentschrift I 170 970) und ist daher leicht zuganglich. Nach diesem Verfahren können die bisher als technisch wertlos verworfenen Abfallmelassen in 5'-Xanthylsäure überführt werden, aus der ihrerseits ..sch dem erfindungsgemäßen Verfahren Inos.n und C ouanylsäurenukleotide hergestellt werden können

Bei den errindunesgemäß verwendeten Miuroorganismenstämmen Brevibacterium ammoniagenes ATCC ->P64 und Corynebacterium glutamicum A ICC 21266 handelt es sich um Mutanten, die durch Behandlung von Stämmen dergleichen Art mit üblichen mutagenen Mitteln erhalten worden sind. Sie sind dadurch charakterisiert, daß sie für ihr Wachstum Adenin. Adenosin oder Adenylsäure benötigen und außerdem wird das Wachstum durch Purinverbindungen beschleunigt.

Man kann jedes synthetische Kulturmedium oder jedes natürliche Kulturmedium für die Züchtung verwenden sofern es die für das Wachstum der eingesetzten Mikroorganismen erforderlichen Nährstoffe enthält Derartige Nährstoffe sind bekannt. Beispielsweise seien eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Verbindungen erwähnt. Diese Materialien werden von den errindungsgemaß eingesetzten Mikroorganismen in den entsprechenden Mengen

verbraucht. . .

Beispiele für Kohlenstoffquellen, die in dem wäßrigen Nährmedium eingesetzt werden können, sind Kohlehydrate, wie beispielsweise Glukose Fruktose, Maltose Rohrzucker. Stärke, Stärkehydrolysate und Abfallmelassen. Es kann auch jede andere geeignete Kohlenstoffquelle verwendet werden, beispielsweise Glyzerin, Mannit, Sorbit, organische Säuren, wie beispielsweise Essigsäure, Milchsäure, Glutaminsäure od. dgl. Diese Substanzen können entweder einzeln oder in Mischungen aus zwie oder mehreren Substanzen verwendet werden.

Als Stickstoffquelte kommen verschiedene Arten von organischen oder anorganischen Salzen oder Verbindungen in Frage, beispielsweise Harnstoff, Ammoniak oder Ammoniumsalze, z. B. Ammoniumchlond, Ammoniumsulfai, Ammoniumnitrat und Ammoniumphosphat. Außerdem kann man natürliche Substanzen, die Stickstoff enthalten, verwenden, z. B. Maisquellwasser. Hefeextrakt. Fleischextrakt, F-ischmehl Pepton, Fleischbrühe, Caseinhydrolysate, lösliche Fischbestandteile, Reiskleieextrakt und Casaminosäure. Diese Substanzen können ebenfalls entweder allein oder in Kombination aus zwei oder mehreren Substanzen eingesetzt werden.

Anorganische Verbindungen, welche dem Kulturmedium zugesetzt werden können, sind beispielsweise Magnesiumsulfat. Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogcnphosphat. Eisensulfate anganchlorid. Calciumchlorid, Natriumchlorid und Zinksulfat, wobei Mangan(ll)-ioncn im Überschuß die erfindungsgemäße Umwandlung von 5'-Xanthylsaure in die angegebenen S'-Guanylsäurenukleotide verhindern. Dieser unerwünschte Effekt kann jedoch durch Zusatz eines grenzflächenaktiven Mittels wieder aufgehoben werden.

Darüber hinaus muß das Nährmedium neben den vorstehend angegebenen Adeninverbindungen bestimmte weitere wesentliche Nährstoffe enthalten, wie Biotin oder Pantothenat.

In manchen Fällen ist es vorteilhaft, ein grenzflächenaktives Mittel dem Kulturmedium zuzugeben. Beispielsweise kann der inhibierende Effekt von Mn²'-lonen auf die Umwandlung der 5'-Xanthylsäure in die S'-Giianylsäurenukleotide nach dem erfindungsgemäßen Verfahren dadurch aufgehoben werden, daß man dem Kulturmedium ein grenzflächenaktives Mittel zusetzt, so daß das erfindungsgemäße Verfahren auch mit einem Mn^2l-lonen enthaltenden Nährmedium durchgeführt werden kann (vgl. das weiter unten folgende Beispiel 2). Grenzflächenaktive Mittel, welche verwendet werden können, können entweder anionisch, kationisch oder nicht-ionisch sein. Derartige Mittel sind bekannt. Sie bestehen im allgemeinen aus den Natriumsalzen höhermolek-ilarer Alkylsulfate oder -sulfonate, Polyoxyäthylenglykolderivaten, höheren Fettsäuren mit 12 bis 20 Kohlenstoffatomen, beispielsweise Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Ölsäure oder organischen Estern höherer Fettsäuren, wie beispielsweise Sorbitanmonooleat.

Die 5'-Xanlhylsäure kann dem Medium zu dem Zeitpunkt zugesetzt werden, zu welchem der Mikroorganismus überimpft wird, sie kann aber auch dann zugegeben werden, wenn das Wachsen des Mikroorganismus stattgefunden hat. Die Menge an 5'-Xanthylsäure, welche dem Medium zugesetzt wird, schwankt zwischen 5,0 und 30.0 mg/ml. Reine 5'-Xanthylsäure selbst oder 5'-Xanthylsäure enthaltende Substanzen sowie Kulturbrühen, welche 5-Xanthylsäure enthalten (hergestellt durch Fermentation, vgl. britische Patentschrift I 170 970). können als Additive für das Medium verwendet werden, sofern die jeweilige Form der eingesetzten 5'-Xanthylsäure nicht in nachteiliger Weise das Wachsen der Mikroorganismen, die Anreicherung von Inosin oder die Umwandlung in S'-Guanylsäurenukleotide beeinflußt.

Die Gärung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, beispielsweise durch aerobes Schütteln der Kultur oder durch Lüften und Rühren einer Submerskultur bei einer Temperatur von 20 bis 40 C und bei einem pH-Wert von 5 bis 9. Der pH-Wert des Mediums kann unter Verwendung von Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Harnstoff, wäßrigem Ammoniak, Natriumhydroxyd oder Kaliumhydroxyd während der Züchtung in entsprechender Weise eingestellt werden. Nach 2- bis 6tägigem Züchten unter diesen Bedingungen werden große Mengen an S'-Guanosinmono-, -di- und -triphosphorsäure zusammen mit Inosin in der Kulturbrühe und den Mikroorganismenzellen angereichert. Nach Beendigung des Züchtens können die angereicherten Produkte als einzelne Substanzen oder als Mischung nach üblichen Methoden abgetrennt werden, beispielsweise durch Behandlung mit einem lonenaustaustherharz, durch Ausfällen mit Metallsalzen, durch Adsorption, Extraktion oder Chromatographie.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht pro Liter Wasser.

Beispiel 1

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21264, erhalten aus Brevibactcrium ammoniagenes ATCC 6872 durch Bestrahlung mit UV-Licht, wurde als Impfstamm verwendet. Er erfordert für sein Wachstum Adenin. Die Mutante wurde unter aerobem Schütteln bei 30 C 24 Stunden lang in einem Kulturmedium (pH 7,2) gezüchtet, das 2% Glukose, 1% Pepton, 1% Hefeextrakt und 0,3% Natriumchlorid enthielt. Auf diese Weise wurde eine Impfkultur erhalten.

20 ml-Portionen des nachstehend beschriebenen Impfmediums wurden in konische Kolben mit einem

ίο Fassungsvermögen von 250 ml gegossen und bei 120 C 10 Minuten lang unter erhöhtem Druck sterilisiert.

Ein Nährmedium der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt:

10	O/	Glukose
0,6	0/ / Il	Harnstoff
1,0	(I/	Κ,ΗΡΟ,
1,0	I (I	KHoPO₁
1,0	II/	MgSO, · 7 H₂O
0,01		CaCl₂ - 2 H₂O
JO		Biotin
20	mg; I	Adenin
5	mg/l	Vitamin B,
10	mg 1	Calciumpanthothenat
1.0	O -	Fleischextrakt

Der pH-Wert des Nährmediums wurde durch Verwendung einer verdünnten Natriumnydroxydlösung vor der Merilisierung auf 7.8 eingestellt.

Vor dem Überimpfen der Impfkultur in das Nährmedium wurde 5'-Xanthylsäure (80%ige Reinheit) in einer solchen Menge zugesetzt, die ausreichte, um eine Konzentration von 20 mg/ml zu ergeben. Die Impfkultur wurde in das Nährmedium in einer Menge von 10 Volumprozent, bezogen auf die Menge des Nährmediums, überimpft.

Das Züchten wurde dann unter aerobem Schütteln der Kultur bei 30 C durchgeführt. Nach 72stündigem Züchten wurde der pH-Wert der Flüssigkeit unter

Verwendung von verdünntem Ammoniakwasser auf 7,5 eingestellt. Die Fermentation war nach 120stündigem Züchten beendet.

Nach Beendigung der Fermentation hatten sich 13 mg/ml Inosin, 3.4 mg/ml 5'-GMP, 2,8 mg/ml

5'-GDP und 7,7 mg/ml 5'-GDP in der Kulturbrühe angereichert. Zusätzlich wurde die Anreicherung von kleinen Mengen an Guanosin, Guanin bzw. Hypoxanthin beobachtet. Eine kleine Menge an restlicher 5'-Xanthylsäure verblieb in dem Medium.

Beispiel 2

Brexibacterium ammoniagenes ATCC 21264 wurde als Impfmikroorganismus verwendet. Der Impfstamm wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel I zur Erzielung einer Impfkultur gezüchtet.

Das verwendete Nährmedium hatte die folgende Zusammensetzung:

13 "„

0.6 °„
0.5 "„
0.5 "„
0.5 "„
0,01"„
10 mg/1
I mg/1
5 mg, I

verzuckerte Stärke-Flüssigkeit

(berechnet als Glukose)

Harnstoff

KH₂PO₄

K₂HPO₁

MgSO₁ · 7 H,O

CaCI., · 2 H₂O

1-eSO', · 7 H₂O

ZnSO₁ · 7 H₂O

MnCl₂ · 4 H₂O

5	mg/1	Vitamin B₁
10	mg/1	Calciumpanthothenat
30	mg/1	Adenin
30	μ£/ι	Biotin
1.0	%	Casaminosäure

Die Impfkulturbrühe wurde in einer Menge von 10 Volumprozent in das Nährmedium überimpft. Das Züchten wurde anschließend unter aerobem Schütteln der Kultur bei 35 C 72 Stunden lang durchgeführt. Zu diesem Zeilpunkt wurde eine gleiche Menge, 5'-XanlhyIsäure enthaltende Nährflüssigkeit (die 30 mg/ml 5'-Xanthylsäure enthielt) der Kulturbrühe zugesetzt. Zusätzlich wurden 3.0 mg/ml Polyoxyäthylenstearylamin (ein grenzflächenaktives Mittel) der Flüssigkeit zugesetzt. Das Züchten wurde anschließend weitere 48 Stunden lang durchgeführt. Während des Züchtens wurde eine Ammoniumsulfatlösung in einer solchen Menge zugesetzt, daß eine Endkonzentration von 0,5% erreicht wurde. Anschließend wurde der *° pH-Wert unter Verwendung von verdünntem Natriumhydroxyd auf 7,8 eingestellt.

Nach Beendigung der Fermentation hatten sich 6,8 mg/ml lnosin, 7,4 mg/ml 5'-GMP und 3,4 mg/ml 5'-GTP in der Flüssigkeit angereichert. Darüber hinaus »5 wurde die Anreicherung von kleinen Mengen 5'-GDP, Guanin bzw. Guanosin festgestellt. Nur eine kleine Menge an restlicher 5'-XainthyIsäure verblieb in der Kulturbrühe.

30 Beispiel 3

Corynebacterium glutamicum ATCC 217.66, ein Mutantenstamm, der durch Behandlung von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 mit Nitrosoguanidin erhallen worden war. wurde als Impfstarnm verwendet. Das charakteristische Merkmal dieses Stammes bestell darin, daß stin Wachstum durch Adenin, Guanin oder Hypoxanthin stark beschleunigt

Es wurde ein Nährmedium der folgenden Zusammensetzung verwendet:

!3.0",, Glukose
|.0"„ ΚΗ,ΡΟ,
1.0";, Κ,ΗΡΟ,

MgSO, · 7 H₂O

NH₁CI

Hefeextrakt

1,0'

1.5"
0,5'

3,0",, CaCO₃

Das CaCO₃ wurde nach der Sterilisierung /ugeset/.t. Der pH-Wert des Mediums betrug 7,3.

Die Impfkultur wurde in das Nährmedium in einer Menge von IO Volumprozent überimpft. Darüber hinaus wurden 20 mg/m! 5'-Xanlhylsäure dem Medium zu dem Zeitpunkt der Überimpfung zugeselz!. Die anderen Bedingungen entsprachen den Bedingungen, wie sie in Beispiel 1 beschrieben worden sind. Das Züchten wurde unter aerobem Schütteln 120 Stunden lang durchgeführt. Während des Züchtens wurde zur Einstellung des pH-Wertes eine 20"„ige Harnstofflösung verwendet.

Als Ergebnis der Fermentation wurden 9,7 mg ml lnosin, 6.4 mg/ml 5'-GMP, 4,2 mg/ml 5'-GDP bzw. 3,8 mg/ml 5'-GTP in der Kulturbrühe beobachtet. Zusätzlich fand man eine kleine Menge an restlicher 5'-Xanthylsäure in der Flüssigkeit.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von lnosin und 5'-Guanosinmono-, -di- und -triphosphorsäure auf fermentativem Wege durch Züchten eines Mikroorganismus und anschließende Isolierung der genannten Produkte aus dem Kulturmedium, d adurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21264 oder Corynebacterium glutamicum ATCC 21266 verwendet wird und die Züchtung in einem Nährmedium durchgeführt wird, das pro ml 5,0 bis 30,0 mg 5'-Xanthylsäure enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium außerdem ein grenzflächenaktives Mittel enthält.