DE1795356A1

DE1795356A1 - Verfahren zur Herstellung von Inosin und 5'-Guanylsaeurenukleotiden

Info

Publication number: DE1795356A1
Application number: DE19681795356
Authority: DE
Inventors: Shigeo Abe; Akira Furuya; Ryo Okachi
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1967-09-27
Filing date: 1968-09-18
Publication date: 1972-04-13
Also published as: DE1795356C3; FR1582375A; US3616212A; DE1795356B2; GB1209711A

Description

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Kyowa Hakko Xogyo Co., Lt,d«,_f 5?okyo / Japan

Verfahren zur Hereteilung von Inesin una 5 * -GuanylsäuremiJcleo tiden

Die ?_orii₀gende Brfindun.3 betrifft ein Ye.rfahren zur von laosin und S'-Guanylaäure-Systeranukleotiaen. Insbeaondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von Inosin und 5»-GuanylsäureniUd.eotiden durch Gärung. In gana besonderer Weise betrifft die [Erfindung ein Verfahren «ur H«r~

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stellung von Inosin und 5^!-Guanylsäure:c.ukleotiden_t wie beispielsweise 5'-Guanosin- 1-phosphorsäure (5'-(MP), 5'-Guanosin-2-phosphorsäure (5'-GDP) und 5'-Guanosin-3-phosphorsäure (5'-GlEP), durch Gärung unter Verwendung von Mirkoorganismen, welche besondere Eigenschaften besitzen.

Inosin, welches ein Hypoxanthinribosid ist, findet sich im Fleisch sowie in Fleischextrakten und in Zuckerrüben. Inosin sowie die S'-Gunalylsäurenukleotide haben eine weit verbreitete Verwendung in der Biochemie gefunden„

Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines verbesserten Verfahrens zur Herstellung von Inosin und 5*-Guanylsäurenukleotiden, durch welches die Nachteile der bisher bekannten Methoden überwunden werden. Durch die vorliegende Erfindung wird ein Verfahren zur Herateilung von Inoein und 5'-Guanylsäurenukleotiden durch Gärung unter Verwendung von besonderen Mikroorganismen zur Verfügung gestellt, das in wirksamer und einfacher Weise durchgeführt werden kann. Die Erfindung schafft ein Verfahren zur Herstellung dieser Produkte durch Gärung, das in vorteilhafter und wirtschaftlicher Weise in industriellem Maßstabe unter Erzielung hoher Ausbeiiten zur Durchführung gebracht werden kann. Durch die Erfindung werden Inosin und S'-Guanylsäure-SystemnukleotidB» wie beispielsweise 5'-Guanosin-1-phosphorsäure, 5'-Guanosin-2-phosphorsäure und 5'-Guano ain-3-phosphoraäure, zur Verfügung gestellt.

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Erfindungsgeinäss hat es eich herausgestellt, dass ein Züchten eines Mikroorganismus, der die Fähigkeit besitzt, Inosin zu erzeugen und 5'-Xanthylßäure in 5^f-Guanylsäurenukleotide mit einer hohen Ausbeute in einem Kulturmedium, das 5*-Xanthylßäure enthält, umzuwandeln, die Anreicherung you Inosin und gleichzeitig die Umwandlung von 5'-Xanthylsäure in S'-Guanylsäurenukleotide ermöglicht. Die Produkte können ansohliessend gegebenenfalls aus der Kulturbrühe in hoher Ausbeute abgetrennt werden.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass es Mikroorganismenmutanten gibt, welche die Fähigkeit besitzen, Inosin anzureichern und 5VXanthylsäure in 5*-Guanylsäurenukleotide in hohen Ausbeuten umzuwandeln. Erfindungsgemäes verwendete Mikroorganismenstämme Bind Mutanten, die dadurch erhalten werden, dass Mikroorganismen, welche zu verschiedenen Arten gehören, mit ultravioletten Strahlen oder Strahlen aus einer Kobalt-60-Quelle bestrahlt oder einer chemischen Behandlung unter Verwendung von salpetriger Säure, Dimethylsulfat oder Nitrosoguanidin unterzogen werden, Die erhaltenen Mutanten sind dadurch charakterisiert, dass sie Adeninverbindungen (Adenin, Adenosin oder Adenylöäure) für ihr Wachstum benötigen, wobei das Wachstum dieser Mutanten durch Purinverbindungen beech.leun.lgt wird_o Vie vorstehend erwähnt, haben die-3e Mutanten eine Anreicherung grosser Mengen an Inosin in der Kulturbrühe zur Folge. Darüber hinaus besitzen dia Mutanten die Eigenschaft, 5^f-Xanthylsäure, welche dem Kulturmedium zugesetzt worden ist, in 5 "-Suanylaaur9m1kj.eetide in hoher Ausbeute utnzu-

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wandeln. Mutanten, welche andere Nährmittel erfordern, beispielsweise Aminosäuren, Vitamine, Purine, Pyrimidine oder dergleichen, und die vorstehend angegebenen Eigenschaften besitzen, lassen sich ebenfalls für das erfindungegemässe Verfahren -einsetzen.

Bevorzugte Stämme, die erfindungsgemäss verwendet werden können, sind beispielsweise Brevibacterium ammoniagenes iXG-21 ATCO 21264 und Oorynebacterium glutamicum iXG-31 ATOO 21266.

Man kann jedes synthetische Kulturmedium oder jedes natürliche JTährmedium für die Züchtung verwenden, sofern es die für das Wachstum der eingesetzten Mikroorganismen erforderlichen Nährmittel enthält. Derartige Nährmittel sind bekannt, Beispielsweise seien eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen oder dergleichen erwähnt» Diese Materialien werden von den eingesetzten Mikroorganismen in den entsprechenden Mengen verbraucht. Beispiele für Kohlenstoffquellen, die in dem wässrigen Nährmedium eingesetzt werden können, sind Kohlehydrate, wie beispielsweise Glukose, Fruktose, Maltose, Rohrzucker, Stärke, Stärkehydrolysate, Abfallmelaeeen oder dergleichen. Es.kann auch jede andere geeignete Kohlenstoffquelle verwendet werden, beispielsweise Glyzerin, Mannit, Sorbit, organische Säuren, wie beispielsweise Essigsäure, Milphsäure, Glutaminsäure oder dergleichen. Diese Substanzen können entweder einzeln oder in Mischungen aus zwei oder mehreren Sub-

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stanzen verwendet werden. Als Stickstoffquelle kommen verschiedene Artem von anorganischen oder organischen Salzen oder Verbindungen in Frage, beispielsweise Harnstoff, Ammoniak oder Ammoniumsalze, wie beispielsweise Amraoniumchlorid, Ammoniumsulfat» Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat oder dergleichen· Ausserdem kann man natürliche Substanzen, die Stickstoff enthalten, verwenden» beispielsweise Haisflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Fischmehl, Pepton, Fleischbrühe, Kaseinhydrolysate, lößliche Fischbestandteile, Reiskleieextrakt, Kasaminosau.ro oder dergleichen. Diese Substanzen können ebenfalls entweder allein oder in Kombination aus zwei oder mehreren Substanzen eingesetzt werden. Anorganische Verbindungen, welche dem Kulturmedium zugesetzt werden können, sind beispielsweise Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdlhydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Elsensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid, Zinksulfat oder dergleichen. Darüber hinaus kann es erforderlich sein, dem Kulturmedium bestimmte wesentliche Nährmittel zuzusetzen, die jeweils von dem eingesetzten Mikroorganismus abhängen, beispielsweise Aminosäure und/oder Vitamine, beispielsweise Biotin, Thiaiain, Kobalamin oder dergleichen sowie die vorstehend angegebenen Adaninverbindungen.

In manchen Fällen ist es vorteilhaft, ein grenzflächenaktives Mittel dem Kulturmedium zuzugeben. Grenzflächenaktive Mittel, welch« verwendet werden können, können entweder anionisch, kationisch oder niohtlonlsch sein. Serartige Mittel sind bekannt. Sie be-

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«•Ο —

stehen im allgemeinen aus den Natriumsalsen höheraolekularer Alkylsulfate oder -sulfonate, Polyoxyäthylenglykolderivaten, höheren Fettsäuren mit 12 -20 Kohlenstoff atomen» beispielsweise Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, ölsäure oder dergleichen oder organischen Estern höherer Fettsäuren, wie beispielsweise Sorbitanmonooleat oder dergleichen. Spezifische Beispiele für grenzflächenaktive Kittel, die verwendet werden können, sind beispielsweise in der deutschen Patentschrift . (Patentanmeldung entsprechend US-Serial No. 643 832, eingereicht am 6. Juni 1967) beschrieben. Erfindungsgemäss wird ein Mutantenstamm, der die Fähigkeit besitzt, Inosin anzureichern und gleichzeitig 5'~Xanthylsäure, die dem Medium zugesetzt worden ist, in 5'-Guanylsäurenukleotide umzuwandeln, in einem wässrigen Nährmedium gezüohtet. Die 5^f«Xanthylsäure kann dem Medium zu dem Zeitpunkt zugesetzt werden, zu welchem der Mikroorganismus aufgeimpft wird. Sie kann ferner dann zugegeben werden, wenn das Wachsen dee Mikroorganismus stattgefunden hat. Die Menge an 5'-Xanthylsäure, welche dem Medium zugesetzt wird, schwankt im allgemeinen von ungefähr 5,0 - 30,0 mg/ml. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass die dem Medium zugesetzte Konzentration jeweils in Abhängigkeit von dem eingesetzten Stamm schwankt. Sehr reine S'-Xanthylsäure selbst oder S^Xanthylsäure enthaltende Substanzen sowie Kulturbrühen, welche 5^f-Xanthylsäure enthalten (hergestellt durch Gärung) können als Additive für das Medium verwendet werden, sofern die jeweilige Fora der eingesetz-

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ten Xanthylsäure nicht in nachteiliger Weise das Wachsen der Mikroorganismen, die Anreicherung von Inosin oder die Umwandlung in 5'~Guany3gäurenukleotide "beeinflusst.

Die Gärung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, beispielsweise durch aerobes Schütteln der Kultur oder durch Lüften und Rühren einer Submerskultur bei einer Temperatur von beispielsweise ungefähr 20 - 4O⁰C und bei einem pH-Wert von beispielsweise 5,0 -9,0. Der pH des Mediums kann unter Verwendung von Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Harnstoff, wässrigem Ammoniak, Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd oder dergleichen je nach dem verwendeten Stamm während der Züchtung in entsprechender Weise eingestellt werden. Nach ungefähr 2 - 6-täglgem Züchten unter diesen Bedingungen werden grease Mengen an 5^f-Guanylsäurenukleotlden oder einer Mischung aus 5'-Guanylsäurenukleotiden zusammen mit Inosin in der Kulturbrühe und den Mikroorganismenüellea angereichert. Nach Beendigung des Züchtens können die angereicherten Produkte als einzelne Substanzen oder als Mischung nach üblichen Methoden abgetrennt werden, beispielsweise durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz, durch Ausfällen mit Metallsalzen, durch Adsorption, Extraktion, Chromatographie oder dergleichen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

2 G 9 8 1 6 / 1 7 2'4

Sofern nicht andere angegeben, beziehen eich die Proζentangaben auf das Gewicht pro 1 Wasser.

Beispiel 1

Brevibaoterium ammoniagenes iXG-21 ASCC 21264» erhalten aus Brevibacterium ammoniagenes ASCC 6872 durch Bestrahlung mit UV-Strahlen, wird als Impfstamm verwendet. Er erfordert für sein ^ Wachstum Adenin. Der Mutant wird unter aerobem Schütteln bei 30⁰C während einer Zeitspanne von 24 Stunden in einem Kulturmedium (pH 7»2) gezüchtet, das 2 $> Glukose, 1 $ Pepton, 1 Jt Hefeextrakt und 0,3 i> Natriumchlorid enthält. Auf diese Weise wird eine Impfkultür erhalten.

20 ml-Portionen des nachstehend beschriebenen Impf mediums oder Gärungsmediums werden in konische Kolben mit einem Fassungsvermögen von 2^0 ml gegossen und bei 120⁰C während einer Zeitspanne von 10 Minuten unter erhöhtem Druck sterilisiert„

Ein Gärungsmedium, das folgende Zusammensetzung besitzt, wird hergestellt:

10 i> Glukose
0,6 % Harnstoff
1,0 i>
1,0 #
1,0 9t MgSO₄.7H₂O

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0,01 # OaOl₂.2H₂O
30 .jig/1 Biotin
20 mg/1 Adenin

5 mg/1 Vitamin B₁
10 mg/1 Caloiumpantothenat 100 # Fleischextrakt.

Der pH-Wert des Gärungsmediums wird durch Verwendung einer verdünnten tfatriumhydroxydlösung vor der Sterilisierung auf 7t8 eingestellt.

Vor der Aufimpfung der Impfkultur auf das Gärungsmedium wird 5'-Xanthylsäure (80 #ige Reinheit) dem Gärungsniedium in einer solchen Menge zugesetzt, die dazu ausreicht, eine Konzentration von 20 mg/ml zu ergeben. Die Impfkultur wird auf ein Gärungemedium in einer Menge von 10 Volumen-jG, bezogen auf die Menge des Gärungsmediums, aufgeimpft.

Das Züchten wird dann unter aerobem Schütteln der Kultur bei 30°0 durchgeführt. Kach 72-stündigem Züchten wird der pH-Wert der flüssigkeit auf 7,5 unter Verwendung von verdünntem Ammoniakwasser eingestellt. Die Gärung ist nach einem 120-stündigtn Züchten beendet.

Nach Beendigung der Gärung haben sich 13 mg/ml I no sin, 3*4 fflg/nl 5'-GMP, 2,8 mg/ml 5'-GDP und 7,7 mg/ml 5'-GTP in der Kttltur-

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brühe angesammelt. Zusätzlich wird die Anreicherung von kleinen Mengen an Guano sin, Guanin bzw· Hypoxanthin beobachtet. Sine kleine Menge an restlicher 5'-Xanthy!säure verbleibt in dem Medium.

Beispiel 2

Brevibacteriura ammoniagenes iXG-21 ATGC 21264 wird als*Impfmikroorganismus verwendet. Per Impf stamm wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 zur Erzielung einer Impfkultür gezüchtet.

Das verwendete Gärungsmedium besitzt folgende Zusammensetzung:

13 # verzuckerte Stärke-Flüssigkeit (berechnet als Glukose 0,6 # Harnstoff 0,5 tf

0,5 # ₂^ 0,5 $> MgSO_4e7H₂O 0,01 J* CaOl₂.2H₂O 10 mg/1 PeSO₄.7H₂O 1 mg/1 ZnSO₄.7HgO

5 mg/1 Vitamin B₁ 10 mg/1 öalciumpantothenat 30 mg/1 Adenin 30 ug/1 Biotin 1,0 i> Easaminosäure

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Die Impf kulturbrühe wird in einer Menge von 10 Volumen-^ auf das Gärungsmedium aufgeimpft. Das Züchten wird ansehliessend un~ tar aerobem Schütteln der Kultur bei 35⁰G während einer Zeitspanne von 72 Stunden durchgeführt. Zu diesem Zeitpunkt wird eine gleiche Menge 5'-Xanthylsäure-enthaltende Gärungsflüssigkeit (die 30 mg/ml 5^f-Xanthylsäure enthält) der Kulturbrühe zugesetzt. Zusätzlich werden 3,O mg/ml Nimean S-215 (hergestellt von Nippon Tushi Co. Ltd.), ein grenzflächenaktives Mittel, der Flüssigkeit zugesetzt. Das Züchten wird anschliessend weitere 48 Stunden lang durchgeführt. Während des Züchtens wird eine Ammoniumsulfatlösung in einer solchen Menge zugesetzt, dass eine Endkonzentration von 0,5 1> erreicht wird. Anschliessend wird der pH-Wert auf 7_t 8 unter Verwendung von verdünntem Natriumhydroxyd eingestellt„

Nach Beendigung der Gärung haben sich 6,8 mg/ml Inosin, 7,4 mg/ml 5'-GMP und 3,4 BBg¹ZmI 5'-GXP in der Flüssigkeit angesammelte Darüber hinaus wird die Anreicherung von kleinen Mengen 5'-GDP, Guanin bzw. Guanosin festgestellt. Nur eine kleine Menge an restlicher 5^e-Xanthylsäure verbleibt in der Kulturbrühe„

Beispiel 3

Corynebacterium glutamicum iXG-31 ATCC 21266, ein Mutantenstamm, der durch Behandlung von Corynebacterium glutamicium ATCC 13032 mit Nitrosoguanidin erhalten worden ist, wird als Impfstamm verwendet. Das charakteristische Merkmal dieses Stammes besteht darin,

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dass sein Wachstum beträchtlich durch Adenin» Guanin oder Hypoianthin beschleunigt wird.

Ein Gärungemedium mit folgender Zusammensetzung wird verwendet»

13 i> Glukose 1,0 # 1,0 ?6

1,0 # MgSO₄.7H₂O 1,5 # HH₄Ol 0,5 i> Hefe extrakt 3 # OaCO₅

Das OaOO, wird nach der Sterilisierung zugesetzt. Der pH des Mediums beträgt 7,3.

Die Impfkultur wird auf das Gärungsmedium in einer Menge von ™ Volumen-^ aufgeimpft. Darüber hinaus werden 20 mg/ml 5'-Xanthylsäure dem Medium ssu dem Zeitpunkt der Auf Impfung zugesetzt. Die anderen Bedingungen entsprechen den Bedingungen, wie sie in Beispiel 1 beschrieben werden. Das Züchten wird unter aerobem Schütteln während einer Zeitspanne von 120 Stunden durchgeführt. Während des Züchtens wird eine 20 ^ige Harnstofflösung zur Einstellung des pH-Wertes verwendet.

Als Ergebnis der Gärung werden 9t7 mg/ml Inosin, 6,4 mg/ml

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4,2 Bg/xnl 5'-8EP "bzw. 3,8 mg/ml 5 '-GHDP in der Kulturbrühe beobachtet „ Zusätzlich findet man eine !deine Menge an restlicher 5'-Xanthylsäure in der Flüssigkeit*

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Inosin und 5 * -öuanyleäurentücleatiden, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorganisraue, der Inosin au erzeugen vermag und das Vermögen besitzt, S^Xanthylsäure in 5^f-Quanylsäurenuld.eotide umzuwandeln, unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen tfahrmedlum gezüchtet wird, das 5'-Xanthyl8äure enthält, sowohl Inosin als auch 5'-<*uanylsäurenukleotide in der erhaltenen EulturbrUhe angereichert werden und das Inosin sowie die S'-Guanylsäurenukleotide abgetrennt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus Brevibac terium ammoniagenes AIECO 21264 ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus Corynsbacterium glutamicum AiDOO 21266 ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daea daa Züchten bei einer Temperatur von ungefähr 20 - 40*0 und bei einem pH von ungefähr 5-9 durchgeführt wird.

5» Verfahren naoh Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daati di· S'-Gu&nyleäurenukleotide aus 5^f-ßuanosia-1-pAoephersävrtf_t 5»~

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H'.öiftO OAö

Guan*sin-2-phosphorsäure oder 5'^utaiioein-^phosphorsäure bestehen.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, das« das Hährmedium ausserdem ein grenzflächenaktives Mittel enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die 5*-Xanthylsäure dem Medium zu Beginn des Züchtens zugegeben wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die 5*-XanthylBäure dem Medium nach dem Beginn des Züchtens und während der Zttehtungsperiode zugesetzt wird,,

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an Xanthylsäure, welche dera Medium zugaeetzt wird, ungefähr 5,0 - 30,0 mg/ml betragt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kulturbrühe, welche 5'-Xanthylsäure enthält, dem Medium zugesetzt wird»

11. Verfahren zur Herstellung von Inosin und 5'-Guanyleäurenukleotlden, dadurch gekennzeichnet, dass eine aus Brevibactorlum &πββο~ niagenes ATCC 21264 und Corynebacterium glutam.lo.ium A2?GC 2!266

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niagenes AICC 21264 oder Corynebacterium glutamicum AXCO 21266 bestehender Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Hährmedium gezüohtet wird» das 5*-Xanthyisäure enthält, sowohl Inosin als auch 5'-öuanylsfturemikleotide in der erhaltenen Eulturbrühe angereichert werden und das Inosin sowie die S'-Guanylsäurenukleotide abgetrennt werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Züchten bei einer Temperatur von ungefähr 20 - 40⁰C und bei einem pH von ungefähr 5-9 durchgeführt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die 5«-Guaiiylsäuroixukleotide aus 5'-Guanosin-1 -phosphorsäure, 5^f-Guanosin-2-phosphorsäure oder 5'-Guano8in~3-phoBphorsäure bestehen.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium ausserdem ein grenzflächenaktives Mittel enthält.

15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge der in dem Medium vorhandenen 5'-Xanthylßäure ungefähr 5»O - 30,0 mg/ml beträgt.

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