DE1695325A1

DE1695325A1 - Verfahren zur Herstellung von Nicotinamidadenindinucleotid

Info

Publication number: DE1695325A1
Application number: DE1967K0062992
Authority: DE
Inventors: Kioshi Nakayama
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1966-07-29
Filing date: 1967-07-28
Publication date: 1972-04-20
Also published as: US3709786A; DE1695325B2; FR1552859A; GB1190079A

Description

Ή 'i\-[ inlu γ

Kyowa Hakko Kogyo Go., ltd., Tokyo _f Japan

Verfahren zur Herstellung ton ITieotinamidadenindinucleotid

Zus aimaenf as sung:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Eficotinamidadenindinucleotid, wobei ein Mikroorganismus, der imstande ist, liicotinamidadenindinucleotid zu produzieren, in einem wäßrigen Iiährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart von mindestens einer der Substanzen Adenin, Adenosin, AdenosinmonopliO'Sriihat, Adenosind!phosphat oder Adenosintriphosphat zusammen mit oder ohne eine zweite Substanz, die Nicotinsäure* Nicotinamid, Mcötinsäure-mononualeotid, Nicotinamidmononucleotid, EiGatinaäuröribOSid, McOtinamidribosid oder Nicotinsäureadenindinucleötid sein kann, gezüchtet wird. Derivate und verschiedeiie Gemische dieser Verbindungen können verwendet werden. 2f§0177iS58
Neue Unterlayen

Die Erfind-mag "betrifft ein Verfahren zur Herstellung von liicotinamidadenindinucleotid in hohen Ausbeuten, insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von liicotinamidadenindimicleotid durch Fermentation in Gegenwart von mindestens einer der Substanzen Adenin, Adenosin, Adenosinmonöphosphat, Adenosindiphosphat oder Adenosintriphosphat zusammen mit oder ohne eine zweite Substanz, die Nicotinsäure, Nicotinamid, Ificοtinsäuremonocleotid, ITicotinamidmononucleotid, Ificotinsäureribosid, lTicotinamidribosid oder liieotinsäureadenindinucleotid sein kann, oder von Derivaten aller dieser Substanzen.

NicotinamidadenindinueleOtid findet sich in Hefen, Schimmelpilzen oder Bakterien. Daher ist ein Verfahren zur Herstellung von ITicotinamidadenindinucleotid durch Extraktion des rohen Zellmaterials von Bakterienzellen und dessen Reinigung bereits bekannt. Dieses Verfahren besitzt jedoch lachteile.

IJicotinamidadenindinucleotid ist eine Verbindung, die eine wichtige Rolle bei biochemischen Reaktionen spielt und die auch für die alkoholische Gärung der Glukose ausschlaggebend ist. Micotinamidadenindinucleotid, auch beiannt als Goenzym I, Dehydrogenase I, Diphosphopyridinnucleotid oder Cozymase besitzt folgende Strukturformel:

205817/1555

CH

I " ■ Γ H-C-OH

i 0

H-C-OH

I Γ

H - C ·

i I Ii

CH₀-O-P-O-P-O-CH₀ i

^ it tr ^ ^

0

Eines der 2iele der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von liicotinamidadenindinucleotid mittels einer I*ermentationsarbeitsweise in industriellem Maßstab.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein "Verfahren zur Herstellung von Hicotinamidadenindinucleotid in hohen Ausbeuten.

Weitere Ziele und Anwendungsbereiche der Erfindung werden nachfolgend näher aufgezeigt. Es wird jedoch darauf hingewiesen, daß die Beschreibung und die spezifischen Eeispiele bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung betreffen, die als Erläuterung aufgeführt sind, da verschiedene Abwandlungen und Modifikationen innerhalb des Brfindungsbereich.es sich für den Fachmann hieraus ergeben.

Erfindungsgemäß wurde ein Verfahren zur Herstellung von Hicotinarcidadenindinucleotid in hohen Ausbeuten entwickelt, indem man zu einem Züchtungsmedium, das einen zur Produktion

... , oao ORIGINAL'

2GS817/1S55

von ÜTieotinamidadenindinucleotid befähigten Mikroorganismus enthält, mindestens eine der Substanzen Adenin, Adenosin, Adenosinmonophosphat, Adenosindiphosphat oder Adenosintriphosphat, zusammen mit oder ohne eine zweite Substanz, die Nicotinsäure, Nicotinamid, lTicotinsäure-mononucleotid, Uicotinamidmononucleotid, Itficotinsäureribosid, Ficotinamidribosid oder Mxcotinsäureadenindinucleotid sein kann, oder Derivate dieser Substanzen hinzufügt.

Es ist bereits bekannt, daß man den Gehalt an Nicotin— amidadenindinucleotid durch Zusatz von Nicotinsäure oder Nicotinamid zu tierischem Gewebe oder Blut heraufsetzen kann. Erfindungsgemäß hat sich jedoch herausgestellt, daß die produzierte Menge an Nicötinamidadenindinucleotid erhöht werden kann durch Zusatz der, oben angegebenen Adeninverbindungen zum . > Züchtungsmedium, einschließlich ihrer Derivate und substituierten Derivate, entweder einzeln oder zusammen mit den oben angegebenen Nicotinsäureverbindungen, einschließlich ihrer Derivate oder substituierten Derivate.

Die oben angegebenen Verbindungen können dem Züchtungsmedium zu jeder Zeit während der Züchtung zugegeben werden. Falls sowohl die Adeninverbindungen als auch die Nicotinsäure— verbindungen dem Züchtungsmedium zugesetzt werden, können sie zusammen oder einzeln und - wiederum - zu jedem Zeitpunkt während der Züchtung hinzugesetzt werden. Wenn diese Verbindungen aufgrund der speziellen Merkmale des verwendeten Mikroorganismus

2098.17/1555

produziert werden., erleichtern die sich ergebenden Verbindungen wirksam die Bildung von Nicotinamidadenindinucleotid.

Im allgemeinen variiert die Menge der Ad endverbindungen oder der Adenin-Hicotinsäure-G-emische, die zu dem Züchtungsmedium hinzugesetzt werden, in Abhängigkeit von dem speziell verwendeten Mikroorganismus. Vorteilhafterweise variiert die Menge dieser Verbindungen, die zu dem Züchtungsmedium hinzugefügt werden, von etwa 50 mg/l - 10 g/l. Selbstverständlich können diese Verbindungen dem Züchtungsmedium in der Form ihrer Derivate, z.B. in Form geeigneter Salze, wie z.B. Adeninhydrochlorid,. Adeninsulfat usw., zugesetzt werden. Die bei dem Verfahren der Erfindung verwendeten Adenin- und Nieοtinsäureverbindungen hemmen bisweilen das Wachstum der Mikroorganismen, wenn hohe Konzentrationen dieser Verbindungen zu Beginn der Züchtung hinzugesetzt werden. In diesem Falle werden diese Verbindungen vorzugsweise zugefügt, nachdem der Mikroorganismus { tatsächlich angewachsen ist.

Jeder zur Produktion von Hicotinamidadenindinueleotid befähigte Mikroorganismus kann Verfahrensgemäß verwendet werden. Als typische Mikroorganismen seien Hefen, Bakterien, Strahlen- und Schimmelpilze genannt. Zu den Mikroorganismen, die zur Erhöhung der erzeugten Menge an ITicotinamidadenindinucleotid be-, sonders wirksam sind, gehören Hefen z.B. von der G-attung der Saccharomyces, Candida, iorula» Sohizosaccharomyces, Torulopsis, Hansenula, lindomyces, Hhodotorula, Zygosacoharomyces usw.,

209817/1555

sowie Bakterien der Gattungen Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter, lactobazillus und* Streptococcus. Yfie in Tabelle gezeigt wird, sind die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen weit verbreitet.

Tabelle 1

Mikroorganismus

nicotinamid adenindinucleotid

III

IV

Aerobacter aerogenes ATGO 8308 +

Aerobacter aerogenes ATCO 1524-7 +

Agrobacterium tumefaciens

ATCG 4720 +

Agrobaeterium tumefaciens ATCG 4452

Arthrobacter ureafaclens :

ATCG 7562 +

Arthrobacter citreus ATCO 11624 +

Arthrobacter globiformis

ATCC 8010

Arthrobacter turnecens ATCG 6947 Azotobacter indicus ATCC 9037

Bacillus cereus ATOO 7004 Brevibacterium aoetylicum

ATCC 954 + i ++

Brevibacterium ammoniagenes

ATCC 6871

209817/1SSS

Brevibacterium aramoniagenes

ATCC 6872

Brevibacterium helvolum

ATCC 11822

Brevxbacterium imperiale

ATCC 8565

Brevibacterium linens ATCC 9175

Brevibacterium vitarumen

ATCC 10234

Gorynebaeteriura michiganese

ATCG 10202

Gorynebacterxum rathayi

ATCG 15659

Corynebac-teritun tritici

ATCC 110402

Flavobacterium arborescens

ATCC 4558

Staphylococcus epidermidis

ATCC 155

Hicrococcus lysodeikticus

ATCC 4698

Micrococcus sodonensis

ATCC 15952

Micrococcus varians ATCC 599

Pseudomonas aeruginosa

ATCC 15246.

irseudomonas put id a ATGC 4559

i?seudomonas boreopolxs

ATGG 15452

x^Jroteus vulgaris ATGC 19181

209817/1B55

Serratia marcescens

ATCG 19180 +

Sarcina lutea ATGC 15176 +

Streptococcus faecalis

ATCC 11420 „ +

Xanthomonas citri ATCC 15923 . +

Candida utilis ATCC 16321 +

Candida utilis ATGC 9950 + ++

Saccharomyces cerevisiae

ATCC 15248 + ++

Saccharomyces cerevisiae

ATCC 7754 + +

Saccharomyces carlsbergensis

ATCC 9080 + ++

Torula utilis ATCC 15239 + ++

Z-vgosaccharomyces major

ATCG 15249 + +

Candida tropicalis ATCC 15114 +

Aspergillus niger IiHRL 337

(ATCC 10254) +

Ustilago supherogena ATCC 12421 +

Penicillium chrysogenus

ATCC 15241 +

Streptomyces albus ATCC 618 +

Streptomyces aureus ATGC 3309 +

Streptomyces antibioticus

ATCC 10382 +

209817/1S6S

Streptomyces flavoviirens

AIGG 3320

Streptomyces vinaceus

EHRL-B 1381

II III

IV V

kein Zusatz von Adenin 100 /ug/ml Adenin zugesetzt
300 /ug/ml Adenosintriphosphat zugesetzt 50 /Ug/ml Adenin und 100 /ug/ml Nicotinamid zugesetzt

150 /Ug/ml Adenosintriphosphat und 100 /ug/ml Nicotin— ' . ' amid zugesetzt.

Das Fermentationsmedium ist entweder ein synthetisches oder ein natürliches Itfährmedium, das die zum Wachstum der verwendeten Mikroorganismenstämme notwendigen liährstoffe enthält. Solche Züchtungsmedien enthalten im allgemeinen eine Kohlenstoff quelle, z.B. Kohlehydrate, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen und dgl., die in speziellen Mengen von dem verwendeten Mikroorganismus verwertet werden.

Zu den Kohlehydraten gehört z.B. Glucose, Fructose, Maltose, Sucrose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen und dgl.. Geringe Mengen anderer Kohlenstoffquellen, wie z.B. Glycerin, Mannit, Sorbit, organische Säuren, Kohlenwasserstoffe usw. können in dem Medium zusammen mit den Kohlehydraten verwendet werden. Die Kohlehydrate können entweder einzeln oder im Gemisch von zweien oder mehreren verwendet werden, und eine

209817/1555

1895325

- ίο -

beliebige geringe Menge anderer Kohlenstoffquellen kann ebenfalls entweder einzeln⁰ oder im G-emisch von zweien oder mehreren vorliegen.

Zu den anorganischen Verbindungen gehören Stoffe wie: Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisensulfat oder andere Eisensalze, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid, Calciumchlorid usw.. Als Stickstoffquelle können verwendet werden verschiedene Arten anorganischer oder organischer Salze bzw. Verbindungen, wie Harnstoff, oder Ammoniumsalze, z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphaii usw., oder eine oder mehrere Aminosäuren in Kombination vermischt, oder natürliche Substanzen, die Stickstoff enthalten, z.B. Ilaisqiueilwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Fischmehl, iepton, Bouillon, Gas einhyd ro lysate, I?ischpref3säf te, Reiskleieextrakt usw.. Diese Substanzen können ebenfalls entweder einzeln oder in Kombination von zweien oder mehreren Anwendung finden. Es kann weiterhin notwendig sein, bestimmte wesentliche Nährstoffe zu dem Züchtungsmedium hinzuzufügen, und zwar in Abhängigkeit von dem speziell verwendeten Mikroorganismus, wie Aminosäuren, z.B. Asparaginsäure, !Threonin, Methionin usw. und/oder Vitamine, beispielsweise Biotin, Thiamin, Gobalamin und dgl..

Die Züchtung wird durchgeführt unter aeroben Bedingungen, z.B. als aerobe öchüttelkultur oder unter führen einer Submerskultur, vorzugsweise bei einer Inkubationstemperatür von etwa 20° - 40°G und einem pH von 5 - 9» Bemerkenswert große Mengen

209817/1555

an nicotinamidadenindinucleotid finden sich im Züchtungsmedium angereichert.

Andere Ί¹ em ρ er a tür- und pH—Bedingungen können ebenfalls, jedoch, mit niedrigeren Ausbeuten, verwendet v/erden.

iCach Beendigung der Züchtung kann das liicotinamidadenindinucleotid durch übliche Maßnahmen von der Züchtungsflüssigkeit abgetrennt werden, z.B. durch Ionenaustauscherharz-Behandlung, Ausfällung mit Hetallsalzen, Bxtraktionsverfahren, herkömmliche Adsorptionsverfahren, Chromatographie und dgl..

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, schränken sie jedoch nicht ein. Wenn nicht anders vermerkt, beziehen sich die Prozentansaben auf das Gewicht.

Beispiel 1

Corynetacteriura sp. i^sjo. 5485, Ai¹CG 21084 wird als Einsaat-

bakterium verwendet, ßs wird 24 Stunden bei 30 C in einem Ein-

saatmedium gezüchtet, das aus 2 ρ Glucose, 1 ⁰^ Pepton, 1 ^c/o Hefeextrakt, υ,3 ;-» Ivatriumelilorid und 30 mcg/liter Biotin besteht.

Das verwendete Züchtungsmedium hat folgende Zusammensetzung: "

50 g Glucose U,5 g HgSO₄'7H₂O

6 g Harnstoff ■- 10 g Hefe extrakt

2 g Κ,^ΗΡΟ, 30 Hikrogramm Jfliotin/Liter des

Züchtungsmediums.

BAD ORIGINAL 209817/1555

1 ml einer 12 folgen Harnstofflösung wird getrennt steril lisiert und zu 19 ml des Züchtungsmediums, welches vorher in einem Autoklaven 10 Minuten lang bei 1 kg/cm sterilisiert worden warι hinzugefügt.

Die Einsaatkultur wird in das Züchtungsmedium in einer Menge von 10 Yol-fo desselben eingeimpft. Das G-emisch aus den

ψ Medien wird dann in 20 ml-Anteilen jeweils in 250 ml-Kolben von konischer Form gegossen. Hach dem Sterilisieren unter Druck wird die Züchtung unter aerobem Schütteln der Kultur bei 30 G durchgeführt. Nach 24-stündiger Züchtung wird Adenin zu der Züchtungsflüssigkeit hinzugefügt, um eine Konzentration von 2 mg/ml zu erhalten, und dann wird die Züchtung 72 Stunden lang weitergeführt. 210 mcg/ml Nicotinamidädenindinucleotid hat sich in der Züchtungsflüssigkeit angereichert. Das Nicotinamidadenindimxcleotid wird durch eine lonenaustauscherharz-Behandlung gewonnen.

Die gleiche Züchtung, wie oben erwähnt, wird durchgeführt mit der Abwandlung, daß kein Adenin nach 24 Züchtungsstunden hinzugefügt wird. In diesem Falle beträgt die in der Züchtungsflüssigkeit angereicherte Menge an liicotinamidadenindinueleotid 37 mcg/ml.

Beispiel 2

Die Züchtung wird in der gleichen Art und unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt mit der Abwandlung, dai3 anstelle von Adenin Ade no sin zugesetzt wird, um eine

209817/1555

BAD

-1695326

Konzentration von 2 mg/ml im Medium zu erhalten* Die erzeugte Menge an ITicotinamidadenindinucleotid beträgt 183 mcg/ml.

Beispiel 3

Die Züchtung wird in der gleichen Weise und unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt mit der Abwandlung, daß anstelle von Adenint 5'-*Adenylsäure (Adeno- * sinmonophosphat) verwendet wird. Die erzeugte Menge an Nicotin-· amidadenindinucledtid beträgt 173 meg/ml.

Beispiel 4 . -

Dieses Beispiel entspricht der gleichen Arbeitsweise wie in Beispiel 1 mit der Abwandlung, daß anstelle von Adenin Adenosind!phosphat verwendet wird. Die erzeugte Menge an Mico~ tinamidadenindinucleotid beträgt 172 mcg/ml*

Beispiel 5

Dieses Beispiel entspricht der gleichen Arbeitsweise wie ^ Beispiel 1 mit der Abwandlung, daß anstelle von Adenin Adenosintriphosphat verwendet wird· Die erzeugte Menge an Nicotinamidadenindinucleotid beträgt 187 mcg/ml.

Beispiel 6 . - -

Hefe, die in Koji-Flüssigkeit von 10° Baume bei 30°ö über Macht vorgezüchtet wurde, wird in einen konischen 250 ml- ■ Kolben.in 50 ml Koji-Plüssigkeit von 10° BaumS in einer Menge von 1 °/o eingeimpft, und es wird eine zweitägige Standkultur durchgeführt. Die Menge an erzeugten Zellen und der

-209817/ISSiT"

Itficotinamidadenindihucleotid-Gehalt in den Zellen wird in Tabelle 2 verglichen, und zwar für die Fälle, bei denen 50 meg/ ml Adenin hinzugefügt wurde und bei denen zum Zeitpunkt der Beimpfung kein Adenin zu dem Züchtungsmedium zugesetzt wurde.

	Tabelle	9080	2	0,9	iii c ο t inamid- adenin- dinucleotid (mg/trockene Zellen, 1g)
		J5239		1,1	3,2
Hefen			Zellmenge (Trocken-Grewe g/l)	3,3	5,2
Candida utilis ATCO 16321	15249	I	3,3	1,5
	15114	II	2,4 2,5	3,0
		I	2,3	2,1 3,4;
Sacoharomyces cerevisiae ATCC 15248		II	2,1	1,2
	I II	1,0 1,0	3,2
Saccharomyees ATCG G arlsb ergensis	I	0_s8	0,4 2,0
Torula utilis ATCC	II	0,7	1,2 „
	i II		3,0%
Zygosaccharo- _ATQQ myces major -	. I
Candida tropicalls .■ · . ATCC	II

I : kein Adenin-Zusatz
II I Ädenin-Zusatz

209817/.155S

Beispie! 7

Dieses Beispiel entsprich.t der gleichen Arbeitsweise wie Beispiel 1 mit der Abwandlung, daß als Mikroorganismus anstelle von Corynebacterium sp. ITo. 3485, ATOG 21084 Arthrobacter sp. ΐίο. 3486, ATGG 21085 verwendet wird. Weiterhin wird anstelle von. .Adenin- Adenosintriphosphat verwendet. Die erzeugte Menge an iTicOtinämidadenindinuoleotid beträgt " 270 mcg/ml.

Wenn zur Kontrolle kein Adenosintriphosphat zum Medium hinzugefügt wird, beträgt die angereicherte Menge an Nieotinamidadenindinucleotid 34 mcg/ml.

Beispiel 8

Als üinsaatbakterium wird Corynebacterium sp. ITo. 3485, A'fGG 21084 verwendet. Es wird 24 Stunden lang bei 3O⁰C in einem Üinsaatmedium gezüchtet, das 2 ^c _t ^:i Glucose, 1 ^cJo Pepton, 1 ^cp Hefeextrakt, U,3 /j liatriumchlorid und 30 mcg/l Biotin enthält.

Das verwendete Züchtungsmedium hat folgende Zusammensetzung:

50 g Glucose
6g Harnstoff
2 g K₂HPO₄

2 g KH₂PO₄

0,5 g MgSO₄.7H₂O
10 g Hefeextrakt
50 Hikrojramm Biotin/Liter Züchtungsmedium.

20 981 7/1 BS 5.

1695325 -ιοί ml einer 12 Jjigen-Harnstofflösung wird getrennt sterilisiert und zu 19 ml des Züchtungsmediums, welches vorher in einem Autoklaven 10 Minuten lang bei 1 kg/cm" sterilisiert worden war, hinzugefügt. JJie j^inr-aatkultur wird in das Züchtung s ία ed ium in einer Menge von 1G Vol.-5b desselben eingeimpft. Dan G-emisch aus den Medien wird dann in 20 ml-Anteilen jeweils in konische 250 ml-Kolben gegossen. Nach dem sterilisieren unter Druck wird die Züchtung unter aerobem .'.Schütteln der Kultur bei '5O⁰G durchgeführt. Nach 72—st-ündiger Züchtung werden die in Tabelle 3 aufgezeigten Verbindungen dem Züchtungsrnediurn zugesetzt, um eine Konzentration von 2 mg/ml zu erhalten. Jiach weiteren 48 Züchtungsstunden hat sich lJicotinamidadenindinucleotid in der Züchtungsflüssigkeit angereichert und wird durch eine lonenaustauscherharz-Behandlung gewohnen. Die Mengen an erhaltenem Produkt gehen aus Tabelle 3 hervor.

20 98-1 7/IS 55

Tabelle 3

Zugesetzte Verbindungen

nicotinamidadenindinucleotid

.Nicotinsäure + Adenin

" + Ade no s in ¹¹ + Aüenofiinmonophosphat ¹¹ + Au e no s indi phosphat ¹¹ + Adenosintriphosphat

Nicotinamid + Adenin

¹¹ + Adenosin

¹¹ + Ade no sinmonophosphat

" + Adenosindiphosphat

¹¹ + Adenosintriphosphat

xlicotinsäuremononucleobid + Adenin " + Adenosin ¹¹ + Adenosinmonophosphat " + Adenosindiphosphat ¹¹ + Adenosintriphosphat

rTicotinamidmononucleotid + Adenin ¹¹ + Adenosin ¹¹ + Adenosinmonophosphat ¹¹ + Adenosindiphosphat " + Adenosintriphosphat

Nicotinsäureribosid + Adenin ¹¹ + Adenosin ¹¹ + Adenosinmonophosphat ¹¹ + Ad eno s indi phosphat ¹¹ + Adenosintriphosphat 510 /ug/ml 520

320 330

610 570 430 350 420

410 420 330 370 350

290' 230 25O 250 250

480 480 320 345 345

(Fortsetzung von Tabelle 3)

lficotinanidribosid + Adenin 300 /

¹¹ + Adenosin 54-5

¹¹ -+ Ad enos inmono phosphat VIv

¹¹ + Adenosindipnosphat 37¹J

" . + Adenosintriphoaphat 390

ificotinsäureadenindiniicleotid + Adenin 320

¹¹ + Adenosin 320

¹¹ + Ade no s inmono pho s phat 270

¹¹ + Adenosindiphosphat 240

¹¹ + Adenosintriphosphat 270

kein Zusatz 37

Beispiel 9

Dieses Beispiel entspricht der gleichen Arbeitsweise wie Beispiel β mit der Abwandlung, daß Arthrobacter sp. NO. 3^-36, ATGG 21085 als Mikroorganismus verwendet wird, üie In dem Züchtungsmediuüi angereicherten Mengen an iiicotinamidadenindinucleotid sind aus i'abelle 4 ersichtlich.

BAD ORIGINAL

209817/1555

gabeile 4

Verbindungen

+ Adenin

dicotinaniid + Adenin Nicotinsäure + Adenosintriphosphat L^ricotin;iMiid + Adeiz.osintriphosph.at Icein /Ju;--atz

Eicotiiiamid-

adenin-

dinucleotid

550 /ug/ral 480 470 550 34

Beispiel 10
Hefe, die in einer Koji-Plüssiglceit von 10° Baumo bei

30* G über ,.acht vorp-ezüchtet wurde, wird in einen 250 ml-Kolben in 50 nl Jvo ji-Plüssigkeit von 10° Baume" in einer Menge von 1 "p eingeimpft, und es wird eine z\ireitägige Standkultur durcj'i.qef"üiirt. Die Menge an erzeugten Zellen und der nicotin— araidadeiiindir.ncleotid-Gehalt in den Zellen wird in der nächst enenaeji Tabelle 5 verglichen, und zwar für den Fall, wo 100 meg/ml L'icQtinanid und Adenin zum Züchtungsmedium hinzugefügt wurde, und für den Fall, wo diese Verbindung 24 Stunden nach dem Animpfen nicht zu. dem Hedium hinsugefügt wurde.

BAD

209817/1555

Tabelle 5

	Hefen	ATOC	16321	Zellmenge	0,9	: Nicotinamid—
! I	Candida utilis			(Trocken-Gew., g/1)	1,0	adenin™ dinucleotid (mg/g Zellen)
	ATGC	15248	I	3,3 3,5	3,2
Saccharomyces cerevisiae	ATCC	9080	II	2,4 2,7	6,4
Saccharomyces carlsbergensis	ATCC	15239	II	.2,3	1,5 3,5
Torula utilis			I II	2,0	2,1 4,0
	ATCC	15239	I	1,0 1,2	1,2
Zygosaccharomyces major	ATCC	15114	II	0,8 0,7'	8,1
Candida tropicalis			I II		0,4 5,1
			I ^: II	1,2 5,2

: Kein Zusatz zu Adenin und Nicotinamid II : Adenin und Nicotinamid zugesetzt

209817/T555

Claims

P ate η ta η s ρ rü c Ii e ϊ

1. Verfahren zur Herstellung von Nicotinamidadenindinucleotid durch-Züchten eines zur Produktion von Nicotin— amidadenindinueleotid tjef.aub.igt.en Mikroorganismus in einem wäßrigen Hährmedium unter aerotien Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß man zu dem Medium eine Ad eninv er "bindung, die " Adenin, Adenosin, Adenosinmonophosphat, Adenosindiphosphat, Adenosintriphosphat» ein Derivat dieser VerlDindungen oder ein Gemisch daraus sein kann, hinzufügt,

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Micotinsäureverbindung, die Nicotinsäure, Nicotinamid, Hicotinsäure-mononucleotid, Kicotinamidmononucleotid, Hicotinsäureribosid, iiicotinamidribosid oder Uicotinsäureadenindinucleotid sein kann, sowie Derivate dieser Verbindungen und Gemische derselben zu dem Medium hinzufügt.

3. Verfahren zur Herstellung von Eicotinamidadenindinucleotid, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus, der imstande ist, Itficotinamidadenindinucleotid zu produzieren, in einem wäßrigen lährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart von einer Adendverbindungj die Adenin» Adenosin, Adenosinmonophosphat, Adenosindiphosphat oder Adenosintriphosphat, ein Derivat dieser Verbindungen sowie

Unterlagen (Art. 7 § I Abs. 2 Nr. I Satz 3 des Ändetuiiiafle3. v. 4.3. USZi

2 0 981 7 7.1!» 5 5

ein Gemisch derselben sein kann, züchtet, das l\Tic ο t inamid adenindinucleotid in der sich ergebenden Züchtungsflüssigkeit und in den Bakterienzellen anreichert und dann daraus das licotinamidadenindinucleotid gewinnt,

4· Verfahrennach Anspruch 5* dadurch gekennzeichnet, ^ daß man eine Ficotinsäureverbindung, die nicotinsäure, nicotinamid, Ifieotinsäure-mononucleotid, Ilicotinamidmononucleotid, Hi c ο -bins äure rib ο s id, Micotinamidribos id _f Nicotinsäure adenindinucleotid, ein Derivat dieser Verbindungen oder ein Gemisch daraus sein ,kann, ebenfalls zu dem Züchtungsmedium hinzufügt,

5. Verfahren nach Anspruch 3,- dadurch gekennzeichnet, daß in dem Medium etwa 50 mg - 10 g/l der Ad endverbindung vorliegen·

fe 6_e Verfahren nach Anspruch 4 _f dadurch gekennzeichnet _r

daß in dem Medium etwa 50 mg - 10 g/l des Gemisches der Ad endverbindung und der Hicotinsäureverbindung vorliegen,

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Mikroorganismus ein Bakterium ist, das zu einer der Gattungen Brevibacterium, Corynebaeterium, Arthrobacter, lactobacillus oder Streptococcus gehört,

,..-.,,,, 9· , -Verfahren nach Anspruch 5 oder 6_} dadurch gekenn~ zeichnet, daß man die Züchtung bei einer Temperatur von

209817/1555

. - 23 -

20 — 40°C und einem pH von 5 - 9 durchfuhrt.

9. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4,' dadurch gekennzeichnet, dai3 man als Mikroorganismus eine Hefe verwendet, die zu einer der Gattungen Saccharomyces, Candida, Torula, Schizosaccharomyces, Torulopsis, Hansenula, Endomyces, Rhodotorula oder Zygosaccharomyces gehört.

ORiQiNAL INSFSCTSD

2 0 9817/1555