DE1517860C - Verfahren zur biotechnischen Herstel lung von Inosinsaure - Google Patents
Verfahren zur biotechnischen Herstel lung von InosinsaureInfo
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Description
Bezüglich der erfindungsgemäß verwendeten, gleich-
- zeitig Adenin und Biotin zu ihrem Wachstum benöti-
35 genden Mutanten Brevibacterium thiogenitalis ATCC
Nr. 21017 — ATCC Nr. 21015 und — ATCC
Inosinsäure spielt eine große Rolle als Vorstufe in Nr. 21016 ist zu sagen, daß die Zahlen hinter der Be-
der Biosynthese von Purinnucleotiden und ist in der zeichnung »ATCC« die Zugangsnummern bei der
Lage, den Geschmack und das Aroma von Nahrungs- American Type Culture Collection (ATCC), Rockville,
und Genußmitteln zu steigern. . 30 Maryland, USA., sind.
In der französischen Patentschrift 1 321 118 wird ein Für die Großproduktion von Inosinsäure durch
mikrobiologisches Verfahren zur gleichzeitigen Her- Züchtung der genannten gleichzeitig Adenin und
stellung von Inosin und Guanosin geschildert. Die Biotin benötigenden Mutanten gemäß der Erfindung
französische Patentschrift 1 395 940 beschreibt ein wird im allgemeinen vorzugsweise ein flüssiges Nährmikrobiologisches
Verfahren, bei dem Inosinsäure 35 medium verwendet.
durch Umwandlung von Hypoxanthin unter dem Die Züchtung wird im allgemeinen entweder ohne
Einfluß von Mikroorganismen gewonnen wird. In der Bewegung oder im Submersverfahren unter Belüftung
belgischen Patentschrift 648 914 wird das gleiche und/oder Bewegung durchgeführt, wobei ein Nähr-
Verfahren dahin abgewandelt, daß zunächst das medium verwendet wird, das unbedingt gleichzeitig
Hypoxanthin ebenfalls auf mikrobiologischem Wege 40 eine Adeninquelle und eine Biotinquelle enthalten
gewonnen und dann mikrobiologisch in Inosinsäure muß. Außerdem enthält das Medium Quellen für
umgewandelt wird. Die vorliegende Erfindung betrifft assimilierbaren Kohlenstoff und verwertbaren Stick-
demgegenüber ein Verfahren, bei dem auf mikro- stoff.
biologischem Wege die Inosinsäure unmittelbar als Als Adeninquellen eignen sich beispielsweise Adenin
Hauptprodukt des Verfahrens entsteht. 45 selbst, Verbindungen, die eine Adeninkomponente in
Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein ihrem ,Molekül enthalten und sich leicht in Adenin
Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Inosin- umwandeln lassen, oder natürliche Stoffe, die diese
säure durch Züchten von Mikroorganismen in einem Verbindungen enthalten. Geeignet sind beispielsweise
Kohlehydrate, Stickstoffsubstanzen, Mineralsalze, Adenin, Adenosin, 3'-Adenylsäure, Fleischextrakt, ■
Aminosäuren, Biotin und Adenin enthaltenden Nähr- 50 Maisquellwasser, Polypepton und Hefeextrakt,
medium bei üblichen pH-Werten und Temperaturen, Als Biotinträger können Biotin selbst oder natürliche
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikro- Stoffe, die Biotin enthalten, verwendet werden.
Organismen Brevibacterium thiogenitalis ATCC 21015, . Geeignet sind beispielsweise Fleischextrakt, Polypepton
— ATCC 21016 oder —ATCC 21017 einsetzt und und Hefeextrakt. Natürliche Stoffe, die Adenin sowie
das Nährmedium an Mineralsalzen auch primäres, 55 Biotin enthalten, z. B. Fleischextrakt usw., können als
sekundären und/oder tertiäres Calciumphosphat in Quelle sowohl für Adenin als auch Biotin verwendet
einer Menge von 0,2 bis 5,0 Gewichts-/Volumprozent werden.
enthält. Die Adenin- und Biotinqiiellen müssen dem Nähr-
Die genannten Mutanten, die von Brevibacterium medium in einer Menge zugesetzt werden, die für das
thiogenitalis ATCC 19240 erzeugt wurden, können 60 Wachstum des erfindungsgemäß verwendeten, gleich-
nicht auf einem Minimalkulturmedium, beispielsweise zeitig Adenin und Biotin benötigenden Mutanten
der nachstehend genannten Art, wachsen, auf dem genügt. Der Adeninträger wird dem Nährmedium im
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 zu wachsen allgemeinen in einer solchen Menge zugesetzt, daß die
vermag,, jedoch wachsen diese Mutanten auf einem Konzentration im Kulturmedium etwa 5 bis 500 mg/1,
Minimal-Kulturmedium, dem eine Adeninquelle und 65 gerechnet als Adenin, beträgt. Die Biotinquelle wird
eine Biotinquelle zugesetzt ist. Diese Mutanten dem Nährmedium vorzugsweise in. einer solchen
benötigen gleichzeitig Adenin und Biotin zum Wachs- Menge zugesetzt, daß die Konzentration etwa 0,5 bis
turn. 500 mg/1, gerechnet als Biotin selbst, beträgt.
Als Träger für verwertbaren Kohlenstoff können beispielsweise Stärke, Dextrin, Saccharose, Lactose,
Maltose, Glucose, Glycerin usw. allein oder zu mehreren verwendet werden. Verschiedene organische
Verbindungen oder organische Stoffe, z. B. organische Ammoniumsalze, organische Nitrate, Harnstoffe usw.,
eignen sich nicht nur als Kohlenstoffquelle, sondern auch als Quellen für verwertbaren Stickstoff mit der
gleichen Wirkung wie anorganische Stickstoffquellen, z. B. anorganische Ammoniumsalze, wie 'Ammoniumsulfat,
Ammoniumcarbonat, Ammoniumphosphat oder verschiedene Arten von Nitraten, wie Natriumnitrat,
Kaliumnitrat usw. Ferner kann eine geringe Menge anorganischer Salze, z. B. Natriumchlorid, Phosphate,
Salze von Metallen, wie Calcium, Zink, Mangan oder Eisen, dem Medium zugesetzt werden. Gegebenenfalls
können auch andere übliche Wuchsstuffe, z. B. Vitamine, zugesetzt werden.
Das Medium muß auch primäres, sekundäres oder tertiäres Calciumphosphät oder ein Gemisch dieser
Calciumphosphate in einer Menge von 0,2 bis 5,0, . vorzugsweise 0,5 bis 3,0 Gewichts-/Volumprozent
enthalten, weil eine größere Menge Inosinsäure im Medium angereichert wird, wenn die erfindungsgemäß
verwendeten, gleichzeitig Adenin und Biotin benötigenden Mutanten in einem solchen Medium gezüchtet
werden, als wenn die Züchtung in einem gewöhnlichen Nährmedium vorgenommen wird, wie sich deutlich aus
der folgenden Tabelle 3 ergibt. .
In Tabelle 1 sind die Inosinsäuremengen in dem Fermentationsmedium des gleichzeitig Adenin und
Biotin benötigenden Mutanten Brevibacterium thiogenitalis
ATCC Nr. 21015 genannt, wenn dieser Mutant im Nährmedium A (10% Glucose, 0,8% K2HPO4, 0,8% KH2PO4, 1% Harnstoff und 1%
Hefeextrakt) und im Nährmedium B, das durch Zusatz von 1% sekundärem Calciumphosphät zum Kulturmedium
A erhalten wird, gezüchtet wird.
| A B |
Tabelle | 1 | Angereicherte Menge an Inosinsäure ^g/ml) |
|
| 1160 5160 ' |
||||
| Nährmedium Nährmedium |
||||
Das primäre, sekundäre oder tertiäre Calciumsalz der Phosphorsäure kann dem beim Verfahren gemäß
der Erfindung verwendeten Nährmedium als einzige Phosphatquelle zugesetzt oder zusammen mit gewöhnlichen
Phosphatquellen verwendet werden.
Das Wachstum der erfindungsgemäßen Mutanten und ihre Fähigkeit, Inosinsäure zu bilden, wird durch
die Anwesenheit von Aminosäure im Nährmedium gesteigert.
Als Aminosäureträger eignen sich Aminosäure selbst, z. B. Histidin, Methionin, Phenylalanin,
Tryptophan, Asparaginsäure, Lysin, Threonin, Valin, Alanin, Cystin und Leucin, Peptid, oder natürliche
Substanzen, die eine solche Aminosäure und/oder Peptid enthalten, z. B. Caseinhydrolysat, Fleischextrakt,
Polypepton und Hefeextrakt. Diese Aminosäureträger werden dem Nährmedium vorteilhaft in
einer solchen Menge zugesetzt, daß ihre Konzentration etwa 50 mg bis 0,5 g/l beträgt, gerechnet als Aminosäure.
Die Fermentationsbedingungen, z. B. der pH-Wert des Mediums und die Temperatur für eine maximale
Ausbeute an Inosinsäure, liegen im allgemeinen bei einem Anfangs-pH-Wert des Nährmediums von etwa
6,0 bis 9,0 und die Fermentationstemperatur bei etwa 20 bis 45° C.
Die Fermentation wird fortgesetzt, bis die maximale Inosinsäuremenge im Fermentationsmedium gebildet
ist. Die zur maximalen Anreicherung von Insoinsäure
ίο erforderliche Zeit ist verschieden in Abhängigkeit
von den verschiedenen Faktoren, im allgemeinen erreicht jedoch die im -Fermentationsmedium angereicherte
Menge gewöhnlich ihr Maximum zwischen dem 2. und 10. Tag nach Beginn der Züchtung.
Das Verfahren der Erfindung zur Herstellung von Inosinsäure in guten Ausbeuten läßt sich wirksam
im großtechnischen Maßstab durchführen. -Beim Verfahren der Erfindung wird Inosinsäure angereichert,
während keine anderen 5'-Nucleotide in nennenswerter Menge im Fermentationsmedium gebildet werden.
Die Insosinsäure wird daher in freier Form oder in Form eines Salzes, z. B. als Dinatriumsalz oder
Dikaliumsalz, nach einfachen Methoden beispielsweise unter Verwendung von Aktivkohle o3er Anionenaustauschharzen
gewonnen.
Nach dem Verfahren der Erfindung wird die Inosinsäure auf mikrobiologischem Wege direkt im Fermentationsmedium
angereichert, ohne daß dabei im Gegensatz zum Stand der Technik dem Nährmedium z. B.
Hypoxanthin als Synthesevorstufe zugesetzt werden muß.
In den folgenden Beispielen beziehen sich die Mengenangaben auf Gewicht/Volumen, falls nicht
anders angegeben.
Der gleichzeitig Adenin und Biotin benötigende Mutant Brevibacterium thiogenitalis ATCC Nr. 21015
wird aus Brevibacterium thiogenitalis ATCC Nr. 19240 durch Bestrahlung mit Ultraviolettlicht (15 W) aus
einer H*öhe von 50 cm für eine Dauer von 5 Minuten und anschließende Isolierung nach der Penicillintechnik
(Experientia, 6, S. 41 [1950]) und Repliea-Plattierung (Journal of Bacteriology, 63, S. 399 [1952])
erzeugt. Der so erhaltene Mutant Brevibacterium thiogenitalis ATCC Nr. 21015 wird in 11 des Nährmediums
der in Tabelle 2 genannten Zusammensetzung geimpft, worauf 18 Stunden bei 3O0C unter
Schütteln bebrütet wird.
Glucose ■ : 100 g
CaCO3 20 g
Primäres Calciumphosphät 10 g
K2HPO4 6 g
KH2PO4 4 g
MgSO4-7 H2O 6 g
Harnstoff 8g
Hefeextrakt 10 g
Wasser: Zur Auffüllung auf 1 Liter erforderlicher Menge pH 7,5
Das erhaltene Fermentationsmedium wird in 50 1 eines Nährmediums der gleichen Zusammensetzung
geimpft und unter Belüftung und unter Bewegung 76 Stunden bei 280C fermentiert, wobei 3600 μg
5 6
Inosinsäure und 100 μg Hypoxanthiri pro Milliliter 120 Stunden bei 280C fermentiert wird. Hierbei
und eine Spur Inosin gebildet werden. ' werden 5100 μg Inosinsäure pro Milliliter gebildet.
Nach Einstellung auf pH 2,5 wird das Fermentationsmedium filtriert. Das erhaltene Filtrat wird Tabelle 3
durch eine Aktivkohlesäule (10 χ 150 cm) gegeben. 5 Glucose 80 ε
durch eine Aktivkohlesäule (10 χ 150 cm) gegeben. 5 Glucose 80 ε
Die Säule wird mit 50 1 eines Gemisches von Aceton, CaCO 10 ε
Ammoniak und Wasser (Volumverhältnis 50+1: 49) Primäres Ca"lciümphösphät '.'.'.".'.".'.'.'. 20 g
eluiert. Nach Einengung unter vermindertem Druck Sekundäres Calciumphosphat 30 g
und Einstellung auf pH 8,0 wird das Eluat durch eine jr udq 8 e
Säule (10 X 100cm) geleitet, die mit einem stark io MgSO *7HO """
^g
basischen Anionenaustauschharz (Formiat-Typ) ge- Harnstoff 2
6e
füllt ist. Nach einer Wäsche mit Wasser und 0,02 η u^f^vtrai/t-
8 π
. „ ■ . riereexiraici δ g
Ameisensaure wird die Säule mit 301 0,01 normaler Biotin 0 5 me
Ameisensäure eluiert, die 0,05 normaler Natrium- Wasser; z^'Auffüllung auf' 1 Liter pH 8,0
formiat enthalt, wobei 15 1 einer Fraktion erhalten 15
werden, die 5'-Inosinsäure enthält. Nach Neutralisation Das so erhaltene Fermentationsmedium wird auf
mit 2 normalem Natriumhydroxyd wird die Fraktion die im Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet,
unter vermindertem Druck auf 11 eingeengt. Heißes wobei 450 g Kristalle von Dinatrium-5'-inosat erhalten
Methanol (etwa 60° C) wird in einer solchen Menge werden.
zugesetzt, daß die Methanolkonzentration 50%>
20 -■ BeisDiel 3
bezogen auf das Gesamtvolumen, beträgt. Die
erhaltene Lösung wird auf 5°C gekühlt, wobei 140,8 g Der gleichzeitig Adenin und Biotin benötigende
Kristalle von Dinatrium-5'-inosinat gebildet werden. Mutant Brevibactrium thiogenitalis ATCC-Nr. 21017
wird aus Brevibacterium thiogenitalis ATCC-Nr. 19240
B e i s ρ i e 1 2 25 durch Bestrahlung mit Ultraviolettlicht aus einer Höhe
von 50 cm für eine Dauer von 4 Minuten und an-
Der gleichzeitig Adenin und Biotin benötigende schließende- Isolierung nach der Penicillintechnik und
Mutant Brevibacterium thiogenitalis ATCC Nr. 21016 Replica Plattierung erzeugt. Der so erhaltene Mutant
wird aus Brevibacterium thiogenitalis ATCC-Nr. 19240 wird in 21 des Nährmediums der in Tabelle 2 vom
durch Bestrahlung mit Ultraviolettlicht (15W) für 3° Beispiel 1 genannten Zusammensetzung geimpft, worauf
eine Dauer von 3 Minuten aus einer Höhe von 50 cm 20 Stunden bei 28°C unter Schütteln fermentiert wird,
und anschließende Isolierung nach der Penicillin- Das erhaltene Fermentationsmedium wird in 1001
technik und Replica-Plattierung erzeugt. Der so des Nährmediums der in Tabelle 3 von Beispiel 2
erhaltene Mutant ATCC 21016 wird in 2 1 des Nähr- genannten Zusammensetzung geimpft, worauf 90 Stun-
mediums der in Tabelle 2 vom Beispiel 1 genannten 35 den bei 280C unter Belüftung und Bewegung fermen-Zusammensetzung
geimpft, worauf 20 Stunden bei tiert wird. Hierbei werden 2550 μg Inosinsäure pro
28°C unter Schütteln fermentiert wird. Das erhaltene Milliliter gebildet. Das Fermentationsmedium wird
Fermantationsmedium wird in 100 1 eines Nähr- auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet,
mediums der in Tabelle 3 genannten Zusammen- wobei 195,5 g Kristalle von Dinatrium-5'-inosinat
setzung geimpft, worauf unter Belüftung und Schütteln 4° erhalten werden.
Claims (1)
1 2
Minimalkulturmedium
Glucose 10,0 g
Patentanspruch: ' K2HPO4 1,0 g
. KH2PO4 3,Og
5 Na2SO4 1,Og
Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Eisen(III)-citrat 0,1g
Inosinsäure durch Züchten von Mikroorganismen ' MgSO4 · 7 H2O 0,1 g
in einem Kohlehydrate, Stickstoffsubstanzen, Mine- Natriumglutamat 6,5 g
ralsalze, Aminosäuren, Biotin und Adenin ent- Vitamin B1 3,0 mg
haltenden Nährmedium bei übljchen pH-Werten io Destilliertes Wasser an 1 Liter fehlende Menge
und Temperaturen, dadurch gekenn- pH 7,2 ■ .
zeichnet, daß man als Mikroorganismus
zeichnet, daß man als Mikroorganismus
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 21015, Die gemäß der Erfindung verwendeten, gleichzeitig
— ATCC 21016 oder — ATCC 21017 einsetzt und Adenin und Biotin zum . Wachstum benötigenden
das Nährmedium an Mineralsalzen auch primäres, 15 Mutanten wurden erhalten, indem die Mutation von
sekundäres und/oder tertiäres Calciumphosphat in Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 nach einer
einer Menge von 0,2 bis 5,0 Gewichts-/Volum- an sich bekannten Methode hervorgerufen wurde,
prozent enthält. Die Mutation wurde erreicht, indem Brevibacterium
. thiogenitalis ATCC 19240 beispielsweise mit Ultra-
20 violettlicht, Röntgenstrahlen, y-Strahlen, N-Senfgas,
. salpetriger .Säure, Nitrosoguanidin usw.. behandelt
wurde.
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