DE1517819C - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Prolin - Google Patents
Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-ProlinInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Prolin durch Züchten von
Mikroorganismen bei hierfür üblichen Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium.
L-Prolin ist eine wirtschaftlich bedeutsame Aminosäure, die in Arznei- und Stärkungsmitteln und für
andere Zwecke Verwendung findet. Bisher ist L-Prolin hauptsächlich durch Isolierung aus Hydrolysaten von
Proteinen, wie Gelatine, oder durch organische Synthese hergestellt worden. Die nach diesen Verfahren
erzielten Produktausbeuten sind jedoch sehr gering. Außerdem sind die Verfahren kompliziert.
L-Prolin ist daher einer der teuersten Aminosäuren. Die Entwicklung eines Verfahrens zur Massenproduktion
von L-Prolin durch Fermentation unter Verwendung billiger Kohlenhydratausgangsmaterialien wird daher
seit langem angestrebt, doch ist in der Literatur über ein industrielles Verfahren zur Herstellung von L-Prolin
durch Fermentation bisher nichts berichtet worden. In »Amino Acid«, Ed. 8, S. 51 (1963), wurde berichtet,
daß nur eine geringe Menge —73 y/Liter L-Prolin in der Kulturflüssigkeit angesammelt wird, wenn Micrococcus
glutamicus Nr. 541 gezüchtet wird.
Der vorliegenden Erfindung liegt als Aufgabe die Entwicklung eines verbesserten Verfahrens zur Herstellung
von L-Prolin zugrunde, mit dessen Hilfe sich die Nachteile und Unzulänglichkeiten der bekannten
Verfahren überwinden lassen, und das gewünschte Produkt in hoher Reinheit und guter Ausbeute liefert.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Prolin durchZüchten
von Mikroorganismen bei hierfür üblichen Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man in dem Nährmedium als Mikroorganismen Micrococcus glutamicus ATCC
19 223, -ATCC 19 224 oder -ATCC 19 225 züchtet. Es wurde nun gefunden, daß die angestrebten Ziele
erreicht werden können, wenn man die genannten Mikroorganismenmutanten, die für ihr Wachstum
Isoleucin, Arginin, Citrullin, Ornithin, Methionin oder Vitamin B12 benötigen, in einem wäßrigen Nährmedium
züchtet, das eine Quelle für Kohlenstoff, eine Quelle für Stickstoff, anorganische Substanzen und
geringe Mengen von sonstigen Nährstoffen enthält. Auf diese Weise wird eine bemerkenswerte Ansammlung
von L-Prolin in einer Menge von mehr als etwa 8 — 10 mg/ccm erhalten.
Bezüglich der erfindungsgemäß einsetzbaren Mikroorganismen ist zu sagen, daß Micrococcus glutamicus
ATCC 19 223 von Isoleucin, Micrococcus glutamicus ATCC 19 224 von Arginin, Citrullin oder Ornithin und
Micrococcus glutamicus ATCC 19 225 von Methionin oder Vitamin B12 abhängig ist.
Was die Zusammensetzung des wäßrigen Nährmediums anbelangt, so können sowohl künstlich zusammengestellte
als auch natürliche organische Medien verwendet werden, so lange sie die für das Wachstum
der verwendeten Mikroorganismen wesentlichen Nährstoffe enthalten. Diese Nährstoffe sind bekannt. Dazu
gehören Substanzen wie Quellen für Kohlenstoff, Quellen für Stickstoff, anorganische Verbindungen und
sonstige Nährstoffe, die von den Bakterien in bestimmten Mengen verwertet werden. Als Quellen für Kohlenstoff
seien z. B. erwähnt, Kohlenhydrate, z. B. Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Saccharose, Maltose,
Lactose, Trehalose, Cellobiose, Raffinose, Arabinose, Mannit, Sorbit, Inosit, Xylose sowie Stärkehydrolysat,
Abfallmelassen u. dgl. Auch Gemische aus zwei oder mehreren dieser Substanzen können verwendet werden.
Als Quelle für Stickstoff können die verschiedenartigsten anorganischen oder organischen Salze oder Verbindungen,
wie z. B. Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumcarbonat,
Ammoniumacetat, Ammoniumeitrat usw., Nitrate, Harnstoff oder andere stickstoffhaltige Verbindungen,
wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Brennereischlempe, Caseinhydrolysat,
Fischmehl, Fleischbrühe, entfetteter Sojabohnenrückstand, Seidenraupenpuppen u. dgl., verwendet
werden. Gemische dieser Substanzen kann man ebenfalls benutzen. Weiterhin ist es erforderlich, zu dem
Züchtungsmedium die bestimmten für das Wachstum der Bakterien erforderliche Nährstoffe zu geben, nämlich
Isoleucin, Arginin, Citrullin, Ornithin, Methionin oder Vitamin B12. Anorganische Verbindungen, die zu
dem Züchtungsmedium gegeben werden können, sind unter- anderem Kaliumhydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat,
Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Mangansulfat, * andere Salze des Mangans und des Magnesiums sowie Salze des Eisens, Kobalts,
Zinks, Nickels u. dgl.
Wenn als Quelle für Stickstoff Ammoniumsulfat verwendet wird, führt seine Zugabe in einer Menge von
1,5 bis 2,5 °/0 zu einer sehr hohen Ansammlung von L-Prolin. Im Falle von Ammoniumchlorid erlaubt seine
Zugabe in einer Menge von 1,0 bis 3,0 °/0 eine hohe Ansammlung
von L-Prolin.
Was die anorganischen Substanzen in dem Züchtungsmedium anbelangt, so wurde gefunden, daß die
Zugabe von mehr als 0,4 °/0 MgSO4 die gebildete
Menge an L-Prolin beeinflußt, wie die folgende Zusammenstellung zeigt.
Deshalb ist eine besondere Ausführungsform des beanspruchten Verfahrens dadurch gekennzeichnet, daß
der Gehalt des Nährmediums an Magnesiumsulfat wenigstens 0,4 Gewichtsprozent/Volumprozent beträgt.
Die entsprechenden Versuche wurden in der Weise durchgeführt, daß Micrococcus glutamicus ATCC
19 223 96 Stunden unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Medium gezüchtet wurde, das (in Gewicht/
Volumen) 12°/0 Glucose, 1,5 °/o Ammoniumsulfat, 0,5 °/0 Ammoniumchlorid, 0,75 °/0 Hefeextrakt, 3°/0
CaCO3, 0,15 °/o KH2PO4, 0,15 °/„ K2HPO4, 50y/Liter
Biotin sowie die in obiger Zusammenstellung genannten Mengen MgSO4 enthielt.
Die verwendete Menge an Biotin hat keinen Einfluß auf die gebildete Menge an L-Prolin.
Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen, wie als aerobe Schüttelkultur oder durch Rühren einer
Tauchkultur unter Einleiten von Luft, bei einer Temperatur von etwa 23 bis 37° C ,vorzugsweise 26 bis 32° C,
und einem pH-Wert von etwa 5,0 bis 6,5 durchgeführt.
Zugegebene Menge | Gebildete Menge |
MgS04(»/o) | L-Prolin (mg/ccm) |
0,05 | 0,1 |
0,40 | 3,1 |
0,60 | 5,5 |
0,80 | 6,4 . |
1,0 | 7,5 |
1,4 | 8,0 |
1,6 | 6,9 |
Wenn ein pH-Wert oberhalb von 7 angewendet wird,
besteht die Gefahr, daß sich die angesammelte Menge L-Prolin rasch wieder verringert, Ammoniak, Natriumhydroxyd,
Kaliumhydroxyd, Calciumcarbonat oder Calciumhydroxyd können als Neutralisationsmittel zur
Einstellung des pH-Wertes des Mediums verwendet werden. Weiterhin kann Harnstoff zu dem Züchtungsmedium gegeben werden, um dem Medium Ammoniumionen
zuzuführen sowie seinen pH-Wert einzustellen.
Es wird im allgemeinen 2 bis 4 Tage gezüchtet, wobei sich L-Prolin in dem wäßrigen Züchtungsmedium
als Hauptprodukt ansammelt. Nach beendetem Züchten wird im allgemeinen gefunden, daß sich in dem
Züchtungsmedium außerdem etwa 1 bis 2 mg/ccm Lysin, etwa 3 mg/ccm Alanin und weniger als etwa
1 mg/ccm Leucin als Nebenprodukte gebildet haben. Weiterhin werden Valin, Glutaminsäure und Asparaginsäure
in geringen Mengen als Nebenprodukte gebildet. Die Bildung von Lysin kann durch Verwendung
von Ammoniumsulfat als Quelle für Stickstoff gehemmt werden.
Nach beendetem Züchten wird die Kulturfiüssigkeit filtriert, wonach die Aminosäuren an einem Kationeriaustauschharz
adsorbiert und von diesem wieder eluiert werden. Das Eluat wird unter vermindertem
Druck eingeengt und sodann durch ununterbrochene Zugabe von Methanol entwässert. Das in der Lösung
enthaltene Methanol wird wieder durch Wasser verdrängt, nachdem diejenigen Aminosäuren abfiltriert
worden sind, die in Methanol nur schwach löslich sind. Die noch verbliebenen geringen Mengen an basischen
und sauren Aminosäuren werden entfernt, indem die wäßrige Lösung durch Säulen mit Kationen- und Anionenaustauschharzen
geleitet wird. Beim Einengen und Entwässern des Eluats unter Zugabe von Methanol, gefolgt
von einem Eindampfen bis zur Trockne unter vermindertem Druck, wird rohes kristallines L-Prolin erhalten.
In den folgenden Beispielen, die das Verfahren erläutern, beziehen sich die Prozentangaben auf Gewicht/Volumen.
Micrococcus glutamicus ATCC 19 223 wird als Impfkultur verwendet. 200 ecm einer Impfkultur dieses
Mikroorganismenstammes werden in einen Fermentationsbehälter mit einem Fassungsvermögen von
5 1 gegeben. Sodann werden 2 1 eines Kulturmediums, das 12°/0 Glucose, 2,0 % Ammoniumsulfat, 0,5 °/0
Ammoniumchlorid, 1,5 % MgSO4,0,75 % Hefeextrakt,
0,15% KH2PO4, 0,05% K2HPO4, 50y/Liter Biotin
und 3,0% CaCO3 enthält, in den Fermentationsbehälter gegeben.
Es wird dann 96 Stunden bei 28° C mit einer Rührgeschwindigkeit von 450 Umdrehungen pro Minute
und unter Einleiten von 2 1 Luft pro Minute gezüchtet. Der pH-Wert des Mediums wird während des Züchtens
mit einer 15%igen wäßrigen Ammoniaklösung auf 5,8 bis 6,0 eingestellt. Die in dem Züchtungsmedium
gebildete Menge an L-Prolin beträgt 9,2 mg/ccm.
Nach beendetem Züchten wird der pH-Wert mit Schwefelsäure auf etwa 2,0 eingestellt, und die Verunreinigungen
werden abfiltriert. Das Filtrat wird durch eine mit einem Kationenaustauschharz vom Sulfonsäuertyp
beschickte Säule gegeben, um die Aminosäuren zu adsorbieren, die sodann mit wäßriger Ammoniaklösung
eluiert werden. Nach Einengen des Eluats unter vermindertem Druck auf etwa 0,5 1 werden
diejenigen Aminosäuren, die in Methanol nur
ίο schwach löslich sind, so vollständig wie möglich entfernt,
indem während des Einengens ununterbrochen Methanol zugegeben wird, um die Lösung von Wasser
zu befreien. Nach Abfiltrieren der ungelösten Aminosäuren wird das in der Lösung enthaltene Methanol
wieder durch Wasser verdrängt und die wäßrige Lösung durch ein Kationenaustauschharz und sodann durch
ein An ionenaustauschharz geleitet. In dem Eluat wird das Wasser nach teilweisem Einengen wieder durch
Methanol verdrängt, und die unlöslichen Substanzen werden abfiltriert. Etwa 200 ecm der auf diese Weise
erhaltenen methanolischen· Lösung werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Es werden
13,5 g rohes kristallines L-Prolin mit-einefm Reinheitsgrad
von 85% erhalten.
^ ... „
B eispie I 2
Es wird mit dem gleichen Medium und unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 gezüchtet, nur
daß eine Impfkultur von Micrococcus glutamicus ATCC 19 224 verwendet wird. Man findet, daß die
Kulturflüssigkeit 9,5 mg/ccm L-Prolin enthält. Bei der Behandlung der Kulturflüssigkeit wie im Beispiel 1
werden 14,0 rohes kristallines L-Prolin mit einem Reinheitsgrad von 86 % erhalten.
B e i s ρ i e 1 3
Es wird unter den gleichen Bedingungen und mit dem gleichen Medium wie im Beispiel 1 gezüchtet, nur
daß das Medium außerdem 50 mg/Liter Vitamin B12 enthält und daß Micrococcus glutamicus ATCC19 225
(Methionin oder Vitamin B12 erfordernde Mutante) als
Impfkultur verwendet wird. Man findet, daß die Kulturflüssigkeit 9,8 mg/ccm L-Prolin enthält. Bei weiterer
Behandlung wie im Beispiel 1 werden 14,5 g rohes kristallines L-Prolin mit einem Reinheitsgrad von 86%
erhalten.
Claims (2)
1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Prolin durch Züchten von Mikroorganismen bei
hierfür üblichen Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, dadurch gekennzeichnet,
daß man in dem Nährmedium als Mikroorganismen Micrococcus glutamicus ATCC 19223,
-ATCC 19 224 oder -ATCC 19 225 züchtet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Gehalt des Nährmediums an Magnesiumsulfat wenigstens 0,4 Gewichts/Volumprozent
beträgt.
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