DE1642724C - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Threonin - Google Patents
Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-ThreoninInfo
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Description
10 bis nru mg ι. .
15 Außer den oben erörterten speziellen Nahrstoff-
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotech- Erfordernissen werden die üblicherweise zur Züchtung
nischen Herstellung von i.-Threonin durch Züchten von Mikroorganismen angewendeten Medien und Bc-
von mindestens Diaminopimelinsäure erfordernden dingungen verwendet. Demzufolge .st erhndung^e-
Mikroorganismen der Gattung Escherichia in wäßrigen maß entweder ein synthetisches oder e.n natürliche,
Nährmedien bei hierfür üblichen Bedingungen. » Nährmedium gee.gnet. solange es die tür das Wu1,:,-
L-Threonin ist als essentielle Aminosäure für die turn des verwendeten Stammes notwendigen Nahr-
Ernährungvon Mensch und Tier sehr wichtig. Inder stoffe enthält. Derartige Nährstoffe sind in der TecW
Medizin wird es als Nährstoff verwendet, ι-Threonin bekannt: zu ihnen gehören Stoffe, wie eine Kohles-
ist in kleinen Mengen in Getreideproteinen enthalten stoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische W.-
und als Aminosäure eine äußerst nützliche Substanz. 25 bindungen u.dgl.. die von dem verwendeten Mikro-
welche die Nährwerte von Getreideproteinen ver- Organismus in geeigneten Mengen ausgenutzt werden,
bessert, wenn sie damit ergänzt werden. So seien als Kohlenstoffquelle beispielsweise Kohlen-
Veisuchsweise wurden Verfahren zur Herstellung hydrate, wie z. B. Glucose. Maltose, Rohrzucker u^
von !.-Threonin durch Fermentation durchgeführt, oder jede andere geeignete KohlenstoRquelle, wie /. a.
wobei als Hauptausgangsmaterial !--Homoserin ver- 30 Glycerin, Mannit, Sorbit, organische bauren u«,*..
wendet wurde (USA.-Patentschrift 3 099 604, japa- genannt. Diese Stoffe können einzeln oder in (.«.·
nische Patentveröffentlichung 2896/61 und S ugahara mischen von zweien oder mehreren verwendet werden
et al. in .»Amino Acid and Nucleic Acid«, Bd. 10. S. 68 Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten v-n
[1964]). [.-Homoserin ist jedoch eine teure Verbindung. anorganischen Her organischen balzen oder Verf.1,1-Bei
anderen Verfahren zur Herstellung von L-Threo- 35 düngen, wie z. B. Harnstoff oder Ammoniumsalze,
nin werden Mikroorganismen der Gattung Escherichia, z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsultat, Aminodie
zu ihrem Wachstum mindestens Diaminopimelic niumnitrat, Ammoniumphosphat usw., oder natursäure
benötigen, in einem wäßrigen Nährmedium ge- liehe stickstoffhaltige Substanzen, wie z. B.MaisqueH-züchtet(USA.-Patentschriften
2937121 und 2937122); wasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Hs.hbei
diesen Fermentationsverfahren werden jedoch nur 40 mehl, Bouillon, Caseinhydrolysate Fischpreßsafte.
geringe Mengen an L-Threonin in den Kulturflüssig- Reiskleieextrakt usw., verwendet werden Auch d.ese
keiten erzeugt, und eine praktische Durchführung Substanzen können einzeln oder in Kombination von
dieser Verfahren in industriellem Maßstab ist nicht zweien oder mehreren verwende werden. Anorgaerreicht
worden. nische Verbindungen, die zu dem Medium hinzuge
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Ent- 45 fügt werden können, sind z. B. Magnesiumsulfat,
wicklung eines verbesserten biotechnischen Verfahrens Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kazur
Herstellung von L-Threonin, das in einfacher und liummonohydrogenphosphat, Eisensulfat, Natriumwirksamer Weise vorteilhaft in industriellem Maßstab chlorid, Manganchlorid, Calciumchlorid, oder andere
bei niedrigen Betriebskosten und mit hoher Produkt- geeignete Salze von Magnesium, Eisen, Mangan,
ausbeute durchführbar ist. 5° Zink, Calcium u. dgl. Mischungen der anorganischen
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Verbindungen können verwendet werden,
biotechnischen Herstellung von L-Threonin durch Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen,
Züchten von mindestens Diaminopimelinsäure erfor- wie z. B. aerobem Schütteln der Kultur oder durch
dernden Mikroorganismen der Gattung Escherichia in Rühren einer Submerskultur unter Belüftung, bei
wäßrigen Nährmedien bei hierfür üblichen Bedingun- 55 einer Temperatur von etwa 20 bis 40°C und bei einem
gen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man als pH-Wert von etwa 5,0 bis 8,5 durchgeführt. Nach
Escherichia Escherichia coli ATCC 21149 oder etwa 2 bis 4 Tagen der Züchtung unter diesen Bedin-
ATCC 21151 einsetzt. gungen sind wesentliche Mengen an L-Threonin in
Die Erfindung beinhaltet ein ausgezeichnetes in- der Kulturflüssigkeit angereichert worden,
dustrielles Verfahren zur Herstellung von L-Threonin, 60 Nach Beendigung der Fermentation wird L-Threonin bei welchem die in den Kulturflüssigkeiten produ- gemäß den üblichen Maßnahmen von der Fermenzierten i.-Threonin-Mengen von 5 bis 10 g/l schwanken, tationsflüssigkeit abgetrennt, wie z. B. durch Behandwie in den nachstehenden Beispielen gezeigt wird, wo- lung mit Ionenaustauscherharzen, Ausfällung mit bei diese Mengen wesentlich größer sind als die ge- Metallsalzen, Chromatographie u. dgl.
ringen, gemäß dem bisherigen Stand der Technik er- 65 Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erhaltenen Werte, z.B. 1,0 bis 1,5g/l (USA.-Patent- findung erläutern. Falls nicht anders angegeben, beschrift 2 937 121) und 2 bis 3 g/l (USA.-Patentschrift ziehen sich die darin enthaltenen Prozentangaben auf 2 937 122). das Gewicht 5 Volumenprozent.
dustrielles Verfahren zur Herstellung von L-Threonin, 60 Nach Beendigung der Fermentation wird L-Threonin bei welchem die in den Kulturflüssigkeiten produ- gemäß den üblichen Maßnahmen von der Fermenzierten i.-Threonin-Mengen von 5 bis 10 g/l schwanken, tationsflüssigkeit abgetrennt, wie z. B. durch Behandwie in den nachstehenden Beispielen gezeigt wird, wo- lung mit Ionenaustauscherharzen, Ausfällung mit bei diese Mengen wesentlich größer sind als die ge- Metallsalzen, Chromatographie u. dgl.
ringen, gemäß dem bisherigen Stand der Technik er- 65 Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erhaltenen Werte, z.B. 1,0 bis 1,5g/l (USA.-Patent- findung erläutern. Falls nicht anders angegeben, beschrift 2 937 121) und 2 bis 3 g/l (USA.-Patentschrift ziehen sich die darin enthaltenen Prozentangaben auf 2 937 122). das Gewicht 5 Volumenprozent.
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B e i s D i e I 1 Impfstamm verwendet. Die Züchtung des Stammes
p wird in denselben Medien und in der gleichen Weise,
Escherichia coli ATCC 21151 (ein sowohl diamino- wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt, mit der
pimelinsäure- als auch isoleucinbedürftiger Stamm) Abwandlung, daß an Stelle von Rohrzucker 50 g/I
wird als Impfstamm verwendet. Dieser Stamm wird 5 Sorbit in der Zusammensetzung des Ferruentations-
unter aeroben Bedingungen 24 Stunden lang in einem mediums verwendet werden. Die nach Abschluß der
Impfkulturmedium gezüchtet, welches sich aus 20 g/l Fermentation in der Fermentationsflüssigkeit ange-
Glucose, 10 g/l Pepton, 10g/I Hefeextrakt, 2,5 g/l NaCl reicherte Menge an L-Threonin beträgt 6,5 mg/ml,
und 50 mg/1 Diaminopimelinsäure zusammensetzt. Der
und 50 mg/1 Diaminopimelinsäure zusammensetzt. Der
sich ergebende gezüchtete Stamm wird in einem Vo- io B e i s ρ i e I 3
lumenverhältnis von 10°/9 in einen 250 ml fassenden
lumenverhältnis von 10°/9 in einen 250 ml fassenden
dreieckigen Kolben eingeimpft, der 20 ml eines Fer- Escherichia coli ATCC 21149 (ein diaminopimelin-
mentationsmediums der folgenden Zusammensetzung säurebedürftiger Stamm, der durch Rückmutation aus
50 g/1 Rohrzucker 15 Stamm, Escherichia coli ATCC 21151, erhalten worden
14 g I (NH4).,SO4 war) wird als Impfstamm verwendet. Die Züchtung des
1 g/I K H2PO4 Stammes wird in denselben Medien und in der gleichen
0,3 g/l MgSO4 · 7 H2O Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt,
20 g/I CaCO3 " mit der Abwandlung, daß die Konzentration an
25 mg/I i.-lsoleucin 20 Diaminopimelinsäure auf 100 mg/1 abgeändert und
kein L-Isoleucin in der Zusammensetzung des Fermen-
Der pH-Wert dieses Mediums beträgt 7.2. tationsmediums vorwendet wird. Nach Abschluß der
Die Züchtung wird dann unter aerobem Schütteln Fermentation beträgt die in der Fermentationsflüssigder
Kultur bei 30°C 96 Stunden lang durchgeführt. keit angereicherte Menge an L-Threonin 5,3 mg ml.
Nach 96 Stunden dauernder Züchtung beträgt die in as
Nach 96 Stunden dauernder Züchtung beträgt die in as
der Kulturflüssig: eit angereicherte Menge an L-Threo- Beispiel 4
nin 10,2 mg/ml.
Das L-Threonin in der Fermentationsflüssigkeit Die Züchtung wird mit demselben Stamm, in den-
wird durch Ionenaustauscherharz! shandlung gewon- selben Medien und unter denselben Bedingungen wie
nen, nachdem das Mycel und CaCO3 aus der Fermen- 30 im Beispiel 3 durchgeführt, mit der Abwandlung, daß
tationsflüssigkeit entfernt worden waren. an Stelle von Rohrzucker 50 g/l Mannit in der Zu
sammensetzung des Fermentationsmediums verwendet
Beispiel 2 werden. Nach Abschluß der Fermentation beträgt die
Escherichia coli ATCC 21151 (sowohl diamino- in der Fermentationsflüssigkeit angereicherte Menge
pimelinsäure- als auch isoleucinbedürftig) wird als 35 an L-Threonin 6,3 mg/ml.
Claims (1)
- Die erfindungsgemäß verwendeten Stämme sind beiD „ . . j„ American Tvpe Culture Collection hinterlegtPatentanspruch: der American 1JV" ^ ,„i„„ a„ v„\t,,TI>„ „ι-worden und sind in dem Katalog der Kulturen alsVerfahren zur biotechnischen Herstellung von Escherichia eoli ATCC 21149 und Eschench.a eol.L-Threonin durch Züchten von mindestens Di- 5 ATCC 21151 bezeichnet diaminommelinammopimelinsäure erfordernden Mikroorganismen Eschenchia colt ATCC 21149 ist diammopimel rider Gattung Escherichia in wäßrigen Nährmedien säurebedürftig, und Eschenchia coIiATCC 21151 ist bei hierfür üblichen Bedingungen, dadurch diaminopimelinsäure- und isoleucinbedurf ig.gekennzeichnet, daß man als Escherichia Die in dem Nährmed.um verwendete Konwn-Escherichia coli ATCC 21149 oder ATCC 21151 io tration an Diaminopimelinsäure betrag vorzugsweiseeinsetzt 10 bis 300 mg/1- Die Menge an Isoleucin m Nähr-medium im Falle der Verwendung_ des gleichzeitigisoleucinbedürftigen Stammes, beträgt vorzugsweise
Family
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