DE1642724B1

DE1642724B1 - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Threonin

Info

Publication number: DE1642724B1
Application number: DE19681642724
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Kase; Kiyoshi Nakayama; Haruo Machida Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1967-01-13
Filing date: 1968-01-10
Publication date: 1972-01-13
Also published as: FR1551414A; GB1186822A; IT943046B

Description

3 4

. -Ii Impfstamm verwendet. Die Züchtung des Stammes Beispiel! vfird in denselben Medien und in der gleichen Weise, Escherichia coli ATCC 21151 (ein sowohl diamino- wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt, mit der pimelinsäure- als auch isoleucinbedürftiger Stamm) Abwandlung, daß an Stelle von Rohrzucker 50 g/l wird als Impfstamm verwendet. Dieser Stamm wird 5 Sorbit in der Zusammensetzung des Fermentationsunter aeroben Bedingungen 24 Stunden lang in einem mediums verwendet werden. Die nach Abschluß der Impf kulturmedium gezüchtet, welches sich aus 20 g/l Fermentation in der Fermentationsflüssigkeit ange-Glucose, 10 g/l Pepton, 10 g/l Hefeextrakt, 2,5 g/l NaCl reicherte Menge an L-Threonin beträgt 6,5 mg/ml,
und 50 mg/1 Diaminopimelinsäure zusammensetzt. Der

sich ergebende gezüchtete Stamm wird in einem Vo- io Beispiel3
lumenverhältnis von 10 % in einen 250 ml fassenden

dreieckigen Kolben eingeimpft, der 20 ml eines Fer- Escherichia coli ATCC 21149 (ein diaminopimelin-

mentationsmediums der folgenden Zusammensetzung säurebedürftiger Stamm, der durch Rückmutation aus

enthält: dem diaminopimelinsäure- und isoleucinbedürftigen

50 g/l Rohrzucker 15 Stamm, Escherichia coli ATCC 21151, erhalten worden

14 g/l (NHJ₂SO₄ war) wird als Impfstamm verwendet. Die Züchtung des

1 g/l KH₂PO₄ Stammes wird in denselben Medien und in der gleichen

0,3 g/l MgSO₄ · 7 H₂O Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt,

20 g/l CaCO₃ mit der Abwandlung, daß die Konzentration an

25 mg/1 L-Isoleucin 20 Diaminopimelinsäure auf 100 mg/1 abgeändert und

kein L-Isoleucin in der Zusammensetzung des Fermen-

Der pH-Wert dieses Mediums beträgt 7,2. tationsmediums verwendet wird. Nach Abschluß der

Die Züchtung wird dann unter aerobem Schütteln Fermentation beträgt die in der Fermentationsflüssig-

der Kultur bei 30⁰C 96 Stunden lang durchgeführt. keit angereicherte Menge an L-Threonin 5,3 mg/ml.

Nach 96 Stunden dauernder Züchtung beträgt die in 25

der Kulturflüssigkeit angereicherte Menge an L-Threo- Beispiel 4
nin 10,2 mg/ml.

Das L-Threonin in der Fermentationsfiüssigkeit Die Züchtung wird mit demselben Stamm, in den-

wird durch Ionenaustauscherharzbehandlung gewon- selben Medien und unter denselben Bedingungen wie

nen, nachdem das Mycel und CaCO₃ aus der Fermen- 30 im Beispiel 3 durchgeführt, mit der Abwandlung, daß

tationsflüssigkeit entfernt worden waren. an Stelle von Rohrzucker 50 g/l Mannit in der Zu-

. · 1 9 sammensetzung des Fermentationsmediums verwendet

Beispiel 2 werden. Nach Abschluß der Fermentation beträgt die

Escherichia coli ATCC 21151 (sowohl diamino- in der Fermentationsflüssigkeit angereicherte Menge

pimelinsäure- als .auch isoleucinbedürftig) wird als 35 an L-Threonin 6,3 mg/ml.

Claims

Die erfindungsgemäß verwendeten Stämme sind bei

Patentanspruch: der American Type Culture Collection hinterlegt

worden und sind in dem Katalog der Kulturen als

Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Escherichia coli ATCC 21149 und Eschenchia coli

L-Threonin durch Züchten von mindestens Di- 5 ATCC 21151 bezeichnet.

aminopimelinsäure erfordernden Mikroorganismen Escherichia coli ATCC 21149 ist diaminopimelin-

der Gattung Escherichia in wäßrigen Nährmedien säurebedürftig, und Escherichia coli ATCC 21151 ist

bei hierfür üblichen Bedingungen, dadurch diaminopimelinsäure- und isoleucinbedürftig.

gekennzeichnet, daß man als Escherichia Die in dem Nährmedium verwendete Konzen-

Escherichia coli ATCC 21149 oder ATCC 21151 io tration an Diaminopimelinsäure beträgt vorzugsweise

einsetzt. 10 bis 300 mg/1. Die Menge an Isoleucin im Nährmedium, im Falle der Verwendung des gleichzeitig

isoleucinbedürftigen Stammes, beträgt vorzugsweise

10 bis 200 mg/1.

15 Außer den oben erörterten speziellen Nährstoff-

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotech- Erfordernissen werden die üblicherweise zur Züchtung rüschen Herstellung von L-Threonin durch Züchten von Mikroorganismen angewendeten Medien und Bevon mindestens Diaminopimelinsäure erfordernden dingungen verwendet. Demzufolge ist erfindungsge-Mikroorganismen der Gattung Escherichia in wäßrigen maß entweder ein synthetisches oder ein natürliches Nährmedien bei hierfür üblichen Bedingungen. 20 Nährmedium geeignet, solange es die für das Wachs-L-Threonin ist als essentielle Aminosäure für die turn des verwendeten Stammes notwendigen Nähr-Ernährung von Mensch und Tier sehr wichtig. In der stoffe enthält. Derartige Nährstoffe sind in der Technik Medizin wird es als Nährstoff verwendet. L-Threonin bekannt; zu ihnen gehören Stoffe, wie eine Kohlenist in kleinen Mengen in Getreideproteinen enthalten stoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Ver- und als Aminosäure eine äußerst nützliche Substanz, 25 bindungen u. dgl., die von dem verwendeten Mikroweiche die Nährwerte von Getreideproteinen ver- Organismus in geeigneten Mengen ausgenutzt werden, bessert, wenn sie damit ergänzt werden. So seien als Kohlenstoffquelle beispielsweise Kohlen-Versuchsweise wurden Verfahren zur Herstellung hydrate, wie z. B. Glucose, Maltose, Rohrzucker usw., von L-Threonin durch Fermentation durchgeführt, oder jede andere geeignete Kohlenstoffquelle, wie z. B. wobei als Hauptausgangsmaterial L-Homoserin ver- 30 Glycerin, Mannit, Sorbit, organische Säuren usw., wendet wurde (USA.-Patentschrift 3 099 604, japa- genannt. Diese Stoffe können einzeln oder in Genische Patentveröffentlichung2896/61 undSugahara mischen von zweien oder mehreren verwendet werden, et al. in »Amino Acid and Nucleic Acid«, Bd. 10, S. 68 Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten von [1964]). L-Homoserin ist jedoch eine teure Verbindung. anorganischen oder organischen Salzen oder Verbin-Bei anderen Verfahren zur Herstellung von L-Threo- 35 düngen, wie z. B. Harnstoff oder Ammoniumsalze, nin werden Mikroorganismen der Gattung Escherichia, z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammodie zu ihrem Wachstum mindestens Diaminopimelin- niumnitrat, Ammoniumphosphat usw., oder natürsäure benötigen, in einem wäßrigen Nährmedium ge- liehe stickstoffhaltige Substanzen, wie z. B.Maisquellzüchtet(USA.-Patentschriften2937121und2937122); wasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischbei diesen Fermentationsverfahren werden jedoch nur 40 mehl, Bouillon, Caseinhydrolysate, Fischpreßsäfte, geringe Mengen an L-Threonin in den Kulturflüssig- Reiskleieextrakt usw., verwendet werden. Auch diese keiten erzeugt, und eine praktische Durchführung Substanzen können einzeln oder in Kombination von dieser Verfahren in industriellem Maßstab ist nicht zweien oder mehreren verwendet werden. Anorgaerreicht worden. nische Verbindungen, die zu dem Medium hinzuge-Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Ent- 45 fügt werden können, sind z. B. Magnesiumsulfat, wicklung eines verbesserten biotechnischen Verfahrens Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kazur Herstellung von L-Threonin, das in einfacher und liummonohydrogenphosphat, Eisensulfat, Natriumwirksamer Weise vorteilhaft in industriellem Maßstab chlorid, Manganchlorid, Calciumchlorid, oder andere bei niedrigen Betriebskosten und mit hoher Produkt- geeignete Salze von Magnesium, Eisen, Mangan, ausbeute durchführbar ist. 50 Zink, Calcium u. dgl. Mischungen der anorganischen

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Verbindungen können verwendet werden,

biotechnischen Herstellung von L-Threonin durch Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen,

Züchten von mindestens Diaminopimelinsäure erfor- wie z. B. aerobem Schütteln der Kultur oder durch

dernden Mikroorganismen der Gattung Escherichia in Rühren einer Submerskultur unter Belüftung, bei

wäßrigen Nährmedien bei hierfür üblichen Bedingun- 55 einer Temperatur von etwa 20 bis 40⁰C und bei einem

gen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man als pH-Wert von etwa 5,0 bis 8,5 durchgeführt. Nach

Escherichia Escherichia coli ATCC 21149 oder etwa 2 bis 4 Tagen der Züchtung unter diesen Bedin-

ATCC 21151 einsetzt. gungen sind wesentliche Mengen an L-Threonin in

Die Erfindung beinhaltet ein ausgezeichnetes in- der Kulturflüssigkeit angereichert worden,
dustrielles Verfahren zur Herstellung von L-Threonin, 60 Nach Beendigung der Fermentation wird L-Threonin bei welchem die in den Kulturflüssigkeiten produ- gemäß den üblichen Maßnahmen von der Fermenzierten L-Threonin-Mengen von 5 bis 10 g/l schwanken, tationsflüssigkeit abgetrennt, wie z. B. durch Behandwie in den nachstehenden Beispielen gezeigt wird, wo- lung mit Ionenaustauscherharzen, Ausfällung mit bei diese Mengen wesentlich größer sind als die ge- Metallsalzen, Chromatographie u. dgl.
ringen, gemäß dem bisherigen Stand der Technik er- 65 Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erhaltenen Werte, z. B. 1,0 bis 1,5 g/l (USA.-Patent- findung erläutern. Falls nicht anders angegeben, beschrift 2 937 121) und 2 bis 3 g/l (USA.-Patentschrift ziehen sich die darin enthaltenen Prozentangaben auf 2 937 122). das Gewicht 5 Volumenprozent.