DE1642726C

DE1642726C - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Threonin

Info

Publication number: DE1642726C
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Sagamihara; Tanaka Haruo Machida; Käse Hiroshi Koganei; Nakayama (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Publication date: 1972-12-21

Description

aerobes Schütteln der Kultur oder unter Belüftung und Rühren einer Submerskultur. Der pH-Wert des Mediums während der Züchtung sollte innerhalb eines Bereiches von etwa 4,5 bis 9,0 gehalten werden. Gewöhnlich ist nach einer Züchtungsperiode von 2 bis 7 Tagen unter diesen Bedingungen eine wesentliche Menge von L-Threonin entstanden und hat sich in dem Fermentationsmedium angesammelt.

Nach Vervollständigung der Fermentation kann das L-Threonin aus der Fermentationsflüssigkeit nach üblichen Verfahren, z. B. Ionenaustauschharzbehandlung, Extraktion mit Lösungsmitteln, Fällung mit Metallsalzen, Adsorption, Chromatographie od. dgl. gewonnen werden.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Escherichia coli ATCC 21 150 wird als Impfstamm benutzt. Dieser Stamm wird 24 Stunden in einem Impfmedium mit der Zusammensetzung (je Liter Wasser) 20 g/I Glucose, 10 g/l P^pton, 10 g/l Hefeextrakt, 25 g/l NaCl und 50 mg/1 Diaminopimelinsäure gezüchtet.

Die entstehende Impfkultur wird in einem Verhältnis von 10 Volumprozent in einen 250 ecm dreieckigen Kolben übertragen, der 20 ecm eines Produktionsmediums der folgen Jen Zusammensetzung (je Liter Wasser) enthält.

100 g/l n-Fructose
20 g/I (NH₄J₂SO₄
lg/1 KH₂PO₄
0,3 g/l MgSO₄-7 H₂O
30 g/l CaCO.,
100 mg/1 Diaminopimelinsäure

Der pH-Wert des Fermentationsmediums beträgt 7,2. 100 mg/1 Diaminopimelinsäure
50 mg/1 Di.-Methionin
25 mg/1 L-Isoleucin
20 g/l CaCO₈

Nach Beendigung der Züchtung betrug die Menge an in dem Fermentationsmedium erzeugtem und ίο angesammeltem L-Threunin 6,7 mg/ccm.

Beispiel 3

Die Züchtung wird in der gleichen Weise, wie im Beispiel 2 beschrieben, bewirkt, nur daß eine Seifenabfallflüssigkeit, die einer Entsalzung unterworfen worden ist, mit einer Glycerinkonzentration von 50 g/l an Stelle der Rohrzuckerabfallmelassen in der Produktionsmediumzusammensetzung des Beispiels 2 benutzt wird. Als Ergebnis betrug die Menge des in

ao dem Fermentationsmedium erzeugten L-Threonins 6,1 mg/ccm.

Die Entsalzungsbehandlung der Se'fenabfallflüssigkeit wurde in der folgenden Weise durchgeführt. Zunächst wurde eine aus dem Alkaliverfahren unter Verwendung von Hammeltalg als hauptsächlichem Ausgangsmaterial erhaltene Abfallflüssigkeit durch Zusatz von konzentrierter Salzsäure bis zum pH 7,0 neutralisiert. Die Flüssigkeit wurde dann zwecks Entfernung eines Niederschlages einmal filtriert und anschließend auf Ve ihres Volumens konzentriert. Danach wurde das ausgefällte Natriumchlorid abfiltriert und das Filtrat (Glycerin: etwa 30 %> [Gewichtsvolt'men], Natriumchlorid: etwa 22⁰Zo [Gewichtsvolumen]) verwendet.

Beispiel 4

Escherichia coli ATCC 21 148 wird als Impfstamm benutzt. Er wird in ein Produktionsmedium der folgenden Zusammensetzung übertragen:

30

35

Die Züchtung wird dann unter 96stündigem aeroben Schütteln bei 30⁰C ausgeführt. Nachdem die Züchtung 96 Stunden bewirkt worden ist, beträgt' die in dem Fermentationsmedium angesammelte Menge an i.-Threonin 12,1 mg/ccm. Das L-Threonin wird durch eine Ionenaustauschharzbehancllung nach Entfernung der Zellen und des CaCO₃ aus der Fermentationsflüssigkeit gewonnen.

Beispiel 2

Escherichia coli ATCC 21 148 wird als Impfstamm benutzt. Eine Impfkultur dieses Stammes wird unter der gleichen, im Beispiel 1 beschriebenen Bedingung, in einem Produktionsmedium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet.

50 g/l Xylose
14 g/l (NH₄)₂SO₄
lg/1 KH₂PO₄

83 g/l Rohrzuckerabfallmelassen

(50 g/l für Zucker berechnet)

14 g/l (NH₄)₂SO₄
1 g/l KH₂PO₄
0,3 g/l MgSO₄-7 H₂O

100 mg/1 Diaminopimelinsäure 50 mg/1 DL-Methionin
10 g/l Maisquellwasser
20 g/l CaCO,

Die Züchtung wird dann in der gleichen Weise und unter den gleichen Bedingungen, wie im Beispiel 1 beschrieben, ausgeführt. Die Menge des in dem Fermentationsmedium nach Vollendung der Fermentation erzeugten L-Threonins betrug 6,3 mg/ccm.

Neben der Anwendung der oben aufgezählten billigen Kohlenstoffquellen als Hauptkohlenstoffquelle in dem Nährmedium können auch andere Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Maltose, Rohrzucker, Mannit, organische Säuren, Sorbit u. dgl., in kleineren Mengen verwendet werden.

Claims

Hilfe der vorliegenden Erfindung dadurch insofern

Patentanspruch: ausgeschaltet, als die benutzten Kohlenstoffquellen

nicht teuer sind, während die mit ihnen erzeugten

Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Mengen an v-'l nreonin ziemlich groß sind. L-Threonin durch Züchten von Escherichia coli 5 Das Verfahren der vorliegenden Erfindung, in in assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquel- welchem die obenerwähnten »AbfalU-Kohlenstofflen, Mineralsalze und Diaminopimelinsäure ent- quelle Fruktose, Rohrzuckerabfallmelassen, Stärke haltenden Nährmedien bei hierfür üMchen pH- ermöglicht die Ansammlung des L-Threonins in der Werten und Temperaturen, dadurch ge- Kulturflüssigkeit in Mengen von 6mg/ml oder kennzeichnet, daß man als Escherichia coli, io darüber. Das wird in den unten gebrachten Beispielen Escherichia coli ATCC 21 148 oder Escherichia aufgezeigt. Aus all dem kann leicht ersehen werden, coli ATCC 21 150 einsetzt und als Hauptkohlen- daß das Verfahren zur Herstellung von L-Threonin stoffquelle Fructose, Xylose, Stärke, Rohrzucker- durch Fermentation nach der vorliegenden Erfindung abfallmelassen, entsalzte Seifenabfallflüssigkeiten bemerkenswert wirtschaftlich ist oder Gemische dieser Materialien verwendet. »5 Wie oben erörtert, enthält das Nährmedium gemäß

der vorliegenden Erfindung als HauptkohienstorT-quelle, Fruktose, Rohrzuckerabfallmelassen. Stärke

oder stärkehaltige Substanzen, Seifenabfallflüssigkeiten, die Glycerin enthalten. Xylose oder xylosehaltim so Substanzen oder Mischungen dieser Kohlenstoff

i.-Threonin ist eine sogenannte essentielle, für die quellen. Die verwendeten Seifenabfallflüssigkeite;; Ernährung von Mensch und Tier wichtige Amino- sind diejenigen, die nach der Neutralisation konzen säure, sie ist in Getreideproteinen nur in kleinen triert worden sind (gewöhnlich auf ein Sechstel des Mengen enthalten, verbessert bzw. ergänzt aber deren Volumens) und durch Filtration von dem ausge Nährwert ganz erheblich. Die biotechnische Herstel- *S schiedenen Natriumchlorid befreit worden sind, ode; lung von i.-Threonin durch Züchten von i.-Threonin diejenigen, die durch eine Ionenauftauschbehandlur.i; erzeugenden Mikroorganismen, die zur Familie entsalzt worden sind. Die genannten KohlenstolF-Enterobacteriaceae gehören, in wäßrigen Kohlenstoff- quellen können in dem Medium in verschiedenen und Stickstoffqucllen, Mineralsalze und Wachstums- Konzentrationen verwendet werden. Gewöhnlich je fak'oren enthaltenden Nährmedien ist bereits be- 3° doch wird eine Konzentration von 4 bis 20 Gewichts kannt, wozu auf die USA.-Patentschriften 2 937 121 prozent dieser Substanzen mit Bezug auf die anderen und 2 937 122 verwiesen sei, die die Stämme Mediumbestandteile, mit Ausnahme der Haupt-Escherichia coli ATCC 13 070 und ATCC 13 071 in, kohlenstoffquelle und der Diaminopimelinsäure (siehe wie vorstehend angegeben, zusammengesetzten unten) benutzt, wobei die anderen Nährstoffbestand-Medien züchten, wobei jedoch als Hauptkohlenstoff- 35 teile im allgemeinen in den Mengen angewandt werquellen Sorbit oder Mannit verwendet werden. Bei den, wie das bei der Züchtung von Mikroorganismen der Züchtung dieser Stämme in einem Medium, wie üblich ist.

es in dem nachfolgenden Beispiel 1 beschrieben ist, Die anderen zu benutzenden Nährstoffe sind in der

wird L-Threonin bei Verwendung von ATCC 13 070 Technik wohlbekannt. Zu ihnen gehören eine Stickzu 1,2 mg/ml und bei Verwendung von ATCC 13 071 40 stoffquelle, anorganische Verbindungen u.dgl., die zu 0,7 mg/ml erhalten. von den angewandten Mikroorganismen in den rich-

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotech- tigen Mengen verwendet werden. Als Stickstoffquelle nischen Herstellung von L-Threonin durch Züchten können verschiedene Arten von anorganischen oder von Escherichia coli in assimilierbare Kohlenstoff- organischen Salzen oder Verbindungen, wie Harn- und Stickstoffquellen, Mineralsalze und Diamino- 45 stoff oder Ammoniumsalze, wie \mmoniumchlorid, pimelinsäure enthaltenden Nährmedien bei hierfür Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumüblichen pH-Werten und Temperaturen, das dadurch acetat, Ammoniumphosphat usw. oder natürliche gekennzeichnet ist, daß man als Escherichia coli, stickstoffhaltige Substanzen, wie Maisquellwasser, Escherichia coli ATCC 21 148 oder Escherichia coli Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, 21 150 einsetzt und als Hauptkohlenstoffquelle Fmk- 5< > Bouillon· Caseinhydrolysate, lösliche Fischextrakte, tose, Xylose, Stärke, Rohrzuckerabfallmelassen, ent- Reiskleieextrakte usw. benutzt werden. Von diesen salzte Seifenabfallflüssigkeiten oder Gemische dieser Substanzen kann man entweder jede für sich oder in Materialien verwendet. Kombinationen von zweien oder mehreren verwen-

Erfindungsgemäß ist gefunden worden, daß Fruk- den. Anorganische Verbindungen, die dem Nährtose, Rohrzuckerabfallmelassen, Seifenabfallaugen, 55 medium zugesetzt werden können, umfassen Magnedie Glycerin enthalten, Stärke und stärkehaltige Sub- siumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenstanzen oder Xylose und xylosehaltige Substanzen, phosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensuldie ziemlich billig sind und ganz allgemein als land- fat oder andere Eisensalze, Manganchlorid, Calciumwirtschaftliche und industrielle Abfallstoffe ange- chlorid oder andere geeignete Metallsalze von Magnesehen werden, bemerkenswert wirksame Grundmate- ^6o sium, Calcium, Natrium, Mangan usw. Wie in der rialien für die Herstellung von L-Threonin unter Ver- Technik üblich, können dem Medium wachsrumswendung der Mikroorganismen Escherichia coli fördernde Mittel, wie Biotin oder Vitamine, zuge-ATCC 21 148 oder Escherichia coli ATCC 21 150 setzt werden.

sind. Zur gleichen Zeit werden die bei Verwendung Die Züchtung wird bei Temperaturen bewirkt, bei

dieser Substanzen als Ausgangsstoffe erzeugten Men- ⁶5 denen die eingesetzten Stämme gewöhnlich wachsen gen an i.-Threonin stark erhöht, wenn man mit den und sich vermehren. Das umfaßt gewöhnlich einen üblichen Verfahren der Technik vergleicht. Demzu- Temperaturbereich von 20 bis 40° C. Die Züchtung folge sind die Mangel der bekannten Verfahren mit erfolgt unter aeroben Bedingungen, z. B. durch