DE1926178A1 - Verfahren zur Herstellung von D-Arabit - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von D-ArabitInfo
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Description
ΓΛΤΚΛ"ΓΑΝ\νΑΐ,ΤΚ
D-8000 München 80 · maria-theresia-strasse 4 · telefon ,08II) 44106I
EisaI Kabushlki Kaisha, Tokyo (Japan)
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Arabit,
welches dadurch gekennzeichnet ist, da3 man einen Mikroorganismus
der Art Plchia ohmeri, weicher dazu imstande ist, hauptsächlich D-Arabit
zu erzeugen, in ein Nährmedium inoculiert, welches als wesentliche
KohlenstotTquelle ein fermentierbares Saccharid enthält, den Mikroorganismus
in dem Nährmedium unter aerobischen Bedingungen kultiviert und aus der kultivierten Flüssigkeit das angesammelte D-Arabit entfernt.
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Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein Verfahren zur
Herstellung von D-Arabit durch aerobische Kultivierung des Mikroorganismus Pichia ohmer! Nr. 230 (ATCC Nr. 20209) in einem fermentierbare
Saccharide enthaltenden Nährmedium.
Das auf diese Welse erhaltene D-Arabit dient als wichtiges Ausgangsmaterial
zur Herstellung von D-Xylose auf den. Wege über D-XyIu-I
öse.
Über die Herstellung verschiedener mehrwertiger Alkohole aus Sacchariden, beispielsweise aus D-Glucose unter Verwendung von Hefen,
liegen bereits viele Berichte vor. So wird z.B. D-Arabit biologisch durch Züchten von Pichia miso in einem D-Glucose enthaltenden Nährmedium
hergestellt (vgl. japanische Auslegeschrift Nr. 3545/62). Dieser Mikroorganismus gehört zur Pichia-Art.
Dieses Verfahren besitzt jedoch aen Nachteil einer schlechten Ausbeute an D-Arabit, da gleichzeitig die Bilaung nicht unerheblicher
Mengen anderer mehrwertiger Alkohole als D-Arabit, z.B. von Glycerin, Erythrit und dergleichen, erfolgt. Zur Isolierung und Reinigung des gewünschten
D-Arabits aus den daneben rrit ähnlichen Eigenschaften vorliegenden
Nebenprodukten sind daher aufwendige Maßnahmen notwendig.
Es ist gezeigt worden, daß eine Anzahl von Hefen, die zur Gattung
Debaryomyces, Hansenula und Saccharomyces gehören, zur Herstellung
von D-Arabit aus Sacchariden wirksam ist. Diese Methoden sind jedoch mit dem ähnlichen Nachteil wie im Falle der Verwendung von Pichia
miso verbunden.
Es ist gefunden worden, aa3 D-Arabit mit hoher Ausbeute ohne nennenswerte Bildung anderer mehrwertiger Alkohole erhalten werden
kann, wenn man einen Stamm des Mikroorganismus Pichia ohmeri, e.t,f P.
ohmeri Nr. 230 (Hinterlegungsnummer 158 des Fermentation Research
Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan; ATCC-Nr. 20209) in einem Nährmedium aerobisch kultiviert, welches die üblichen
fermentierbaren Saccharide, wie Glucose, Sucrose, Mannose, Fructose und dergleichen enthält.
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. Die Klassifizierung des bestiromten Mikroorganismus, welcher aus der Erde von Toshima-Ward in Tokyo., «Japan, isoliert worden ist,
wurde,nach der von J. Lodger in dem Buch "The Yeasts α Taxonomic
Study", Interscience Fublishers, New York, 1952, angegebenen Methode
durchgeführt.
Der auf diese Weise erhaltene Mikroorganismus zeigte die folgenden
bakteriologischen Eigenschaften:
a) YM-Flüssigkeitsmedium:
Nach 3 Tagen bei 25° C stellten die Zellen ovale, länglich-ovale
oder zylindrische formen mit den Abmessungen (1 ,5~5) χ (1,5 ·~12) /
dar. Es war ein Ee'dlment und eine Membrane gebildet worden.
b) ■ YM-Agar: - -
Nach 2 Wochen erschien die Schräg-Kultür grau-gelb. In der ersten Stufe des Wachstums war ihre Oberfläche glatt und wurde
dann runzlig. Der Umfang war mltWimpern versehen.
c) Pseudomyceliu.m:
Die ZUchtung auf Kartoffel-Dextrose-Medium, entsprechend der Dalmqu-Agar-Methode, ergab Pseudomyceiien.
d) Sporen: -
Auf dem herkömmlichen Sporen-bildenden Medium fand beim alleinigen
Inoculieren des Mikroorganismus keine Sporenbildung
statt (Da Pichia ohmeri zur heterothallisehen Art gehört, bildet
er keine Ascosporen, wenn er nicht mit anderen Arten gekreuzt fst).
e) Fermentation von Sacchariden:
I. . ; Glucose:· positiv
. II.. Galactose: . .. positiv (langsam)
. . III. Saccharose: positiv
IV, Maltose: · ■" . negativ
V. Lactose: - .negativ : •VI. . Paffinose: positiv
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f) Assimilierung von Kohlenstoffquellen:
Es wurden assimil iert: Glucose, Galactose, Saccharose, Maltose,
Sorbose, Cellobiose, Trehalose, Rafflnose, Äthanol, Glycerin,
Adonit, Mannit, Sorbit, <*-Methylglucoside und Salycin. Dagegen
wurden die folgenden Stoffe nicht assimiliert: Lactose, Melibiose,
Melecltose, Xylose, Arabinose, Erythrit, Dulcit, Gluconsäure,
Inosit und Stärke.
g) Nitrate: Nicht assimiliert.
h) Vitaminbedarf: Es war Biotin erforderlich.
I) Urease-Aktivität: keine Aktivität in Christensens-Medlum.
j) Keine Gelatine-Verflüssigung trat ein.
k) Herkunft: Erde von Toshima-Ward in Tokyo, Japan.
Angesichts des oben beschriebenen bakteriologischen Verhaltens wurde der Mikroorganismusstamm als Species von Pichia ohmerl Identifiziert
und als Pichia ohmeri Nr. 230 benannt.
Das Verfahren gemäß der Erfindung beruht auf der vorteilhaften Verwendung des oben angegebenen Mikroorganismus Pichia ohmerl Nr. 230.
Nach dem Verfahren der Erfindung wird D-Arabit mit hoher Ausbeute durch aerobische Kultivierung des genannten Mikroorganismus In einem
Nährmedium erhalten, welches als wesentliche Kohlenstoffquelle ein fermentierbares
Saccharid enthält. Dies führt zur Ansammlung von D-Arabit. Letzterer wird auf die herkömmliche Weise gewonnen.
Als für die Züchtung nach der Erfindung geeignete Kohlenstoffquellen
kommen alle Saccharide in Betracht, soweit sie von dem genannten Stamm verwertet werden können. Es wurde festgestellt, daß Glucose,
Saccharose, Mannose, Maltose, Fructose und dergleichen besonders vorzuziehen sind.
Es können gleichermaßen natürliche und künstliche Nährmedien verwendet
werden, die dadurch hergestellt werden, da3 man eine ausgewählte Kohlenstoffquelie mit einer organischen oder anorganischen Stickstoff-
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quelle, wie Ammoniumchlorid, -sulfat, -nltrat, -acetat, Harnstoff und
dergleichen, und mit einer geringen Menge von Nährstoffen, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Casamlnosäure, Peptonen und Vitaminen,
und schließlich mit anorganischen Substanzen, wie KH PO , MgSO '7HO
und dergleichen, vermischt.
Obwohl die Kontrolle des pH-Wertes des Nährmediums während der Kultivierung nicht notwendig 1st, Ist es doch im Interesse der Gewährleistung
einer gesteigerten Ausbeute an D-Arabit erwünscht, den pH-Wert bei 4 W zu halten. Die Kontrolle des pH-Wertes kann z.B. vorteilhafterweise
durch Zugabe von Calciumcarbonat durchgeführt werden.
Wenn die Fermentation gemäß der Erfindung mit einem Nährmedium,
welches ein Saccharld mit einer Konzentration von etwa 1C Gew.-'/. enthält,
durchgeführt wird, dann wird D-Arabit mit einer, bezogen auf das Gesamtgewicht des Saccharids, Ausbeute von 40% erhalten.
Wenn auf der anderen Seite die Fermentation mit einem Nährmedium durchgeführt wird, welches ein Saccharld mit einer niedrigeren Konzentration,
wie etwa 3~5 Gew.-%, enthält, und wenn die Saccharld-Verarmung
durch periodische Zugabe des Saccharids in der Weise kompensiert wird, da3 während des Prozesses die Konzentration des Saccharids in dem Nährmedium
auf etwa 3~ 5% gehalten wird, dann kann eine gesteigerte Ausbeute
an D-Arabit, beispielsweise eine solche von 50% (8 ~9 g/dl), bezogen auf
das Gesamtgewicht des Saccharids, erhalten werden.
Ferner kann eine gesteigerte Multiplikation der Zellen und eine erhöhte
D-Arabit-Ausbeute erhalten werden, wenn der Sauerstoffabsorptionskoeffizient
(Kd) in dem aerobischen Kultivierungsmedium innerhalb des Bereiches von 7,7 χ 10~ bis 4,15 χ 10~ , gemessen nach der Sulfit-Oxydations-Methode,
gehalten wird. Wenn man bei einem Kd-Wert von weniger als 4 χ
10 arbeitet, dann verringert sich der Saccharid-Verbrauch und man
nimmt einen aromatischen Ester-Geruch wahr. Die D-Arabit-Ausbeute wird beträchtlich verringert.
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Nach Vervollständigung der Fermentation wird aai>
u-Arabit gus aer Nährflüssigkeit nach den üblichen Methoden isoliert. Dies geschieht
dadurcn, da3 man die gewachsenen Zellen entfernt, die zurückbleibende
Flüssigkeit mit Aktivkohle behandelt, die Flüssigkeit konzentriert und den Rückstand aus heißem Äthanol und dergleichen umkristallisiert.
Es ist erwähnenswert, daß die Isolierung von D-Arabit aus der Fermentationsflüssigkeit gemäß der vorliegenden Erfindung ohne weiteres
vorgenommen werden kann, da die Flüssigkeit das gewünschte U-Arabit mit hoher Konzentration enthält, ohne da3 andere mehrwertige Alkohole
mit ähnlichen Eigenschaften vorliegen.
üie Erfindung wird in den Beispielen erläutert. In diesen sina
alle Angaben bezüglich der prozentualen Gehalte auf das Gewicht bezogen.
50 ml eines Nährmediurrs, welcnes 10% Glucose, 0,4% Hefeextrakt,
0,3% KH2FO4 und 0,1% MgSO4*7HO enthält und dessen pH-Wert 6,6 betrug,
wurden in einen 500 ml-Kolben gegossen. Dieser wurde dann 10 Minuten
bei 120° C sterilisiert.
Das Medium wurae mit 1,5% vorher sterilisiertem CaCO3 versetzt
und hierauf mit 4 ml einer Vorkultur von Pichia ohmeri Nr. 230 versetzt.
Diese wurde durch gesonderte 2-tägige Kultivierung dieses Mikroorganismus
in einer anderen Fraktion des oben genannten Nährmedlums hergestellt.
Der Kolben wurde 4 Tage auf einer Schütteleinrichtung mit einem
Ausschlag von 7 cm bei 125 Zyklen pro Minute und 30° C geschüttelt. Danach wurde eine kultivierte Flüssigkeit erhalten, die 4,3 g pro dl D-Arabit
enthielt, was einer auf das Gesamtgewicht der Ausgangsgiucose bezogene
Ausbeute von 43% entsprach.
Durch chromatographische Untersuchungen wurde bewiesen, daS
die kultivierte Flüssigkeit von anderen mehrwertigen Alkoholen als D-Arabit und der restlichen Glucose fast frei war.
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BAD ORiGfNAL
18,5 I eines Nährmediums, welches 2% Glucose, 0,1% Hefeextrakt,
0,2% Harnstoff, 0,1% KH2PO4 und 0,1% MgSO4'7H2O enthielt, wurden
In einen Tahk-Fermentor mit einer Kapazität von 30 I gebracht. Dieser
wurde 15 Minuten bei 120° C sterilisiert. In den Fermentor wurden 100 g
vorher durch Hitze sterilisiertes CaCO3 eingebracht.
Der Inhalt des Fermentors wurde mit 1 I einer Vorkultur Pichia
ohmeri Nr. 230 inocullert. Diese war gesondert durch 24-stündige Kultivierung
des Stammes bei 30 C in einem Nährmedium, welches 4% Glucose, 0,1% KH PO und 0,1% MgSO ·7Η Ο enthielt, hergestellt worden. ·
Das Ganze wurde bei 30 C unter Belüftung mit 20 l/min und Rühren mit 200 Upm (Kd « (8 - 5) x 10~ ) kultiviert. Dem System wurde kontinuierlich
eine genügende Menge 70%iger wäßriger Glucose-Lösung zugefügt,
um die Konzentration der Glucose in dem Nährmedium während der
Kultivierung Innerhalb des Bereiches von 4~5% zu halten. Die Zugabe
der Glucose-Lösung wurde nach 95 stunden unterbrochen und die Kultivierung
weitergeführt, bis die gesamte Kultivierungszeit 120 Stunden betrug.
Der Gesamtverbrauch an Glucose während der oben angegebenen
Fermentationsperiode betrug 17 g/dl Flüssigkeit. Die erhaltene Flüssigkeit enthielt 8,6 g/dl D-Arabit. Dies entspricht einer, bezogen auf die
verwendete Glucose-Menge, Ausbeute von 50%.
1 I der kultivierten Flüssigkeit wurde zentrifugiert, um die Sedimentierung
der Zellen zu bewirken. Diese wurden dann durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde mit einer bestimmten Menge Ca(OH)p versetzt
und erhitzt. Das Ganze wurde weiter mit einer kleinen Menge Aktivkohle behandelt.. Nach Entfernung der Feststoffe durch die Filtration wurde das
Filtrat bei vermindertem Druck bei 60° C zu einem Syrup konzentriert.
Nach dem Stehenlassen über Nacht veränderte sich der Syrup zu einer kristallinen Masse, die aus heiSem 99%igen Äthanol umkristallisiert wurde.
Dabei wurden 70 g prismenförmigen D-Arabits erhalten.
9 0 9 8 8 6 / 0 9 7 S
Das Produkt war in kaltem Äthanol unlöslich und reduzierte
Fehl ing'sehe Lösung nicht, beim Vermischen mit einem authentischen
Muster trat keine Schmelzpunktdepression auf. Die IR-Absorptionswerte
des Produktes entsprachen denjenigen des authentischen Musters.
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Claims (2)
- Patentansprüche1 . Verfahren zur Herstellung von D-Arabit, claaurch gekennzeichnet, aai man einen N1 ikroorganIsmus der Art Pichia ohmeri, welcher dazu imstande ist, hauptsächlich D-Arabit zu erzeugen, in ein Nährmedium inocullert, welches als wesentliche Kohlenstoffquelle ein fermentierbares Laccharid enthalt, aen N.ikroorganisrrius in dem Nährmeaium unter aerobischen Beaingungen kultiviert una aus der kultivierten Flüssigkeit das angesammelte D-Arabit entfernt.
- 2.- Verfahren zur Herstellung von u-Arabjt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dad man Pichia ohrreri Nr0 230 (ATGC Nr. 20209) verwendet.6/0979
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C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 |