DE2261068A1 - Verfahren zur produktion von hefezellen - Google Patents

Verfahren zur produktion von hefezellen

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DE2261068A1
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Description

Andrejewski, Honke & Gesthuysen Patentanwälte
Diplom-Physiker Dn Walter Andrejewski Diplom-Ingenieur 2261068 Dr.-Ing. Manfred Honke
Diplom-Ingenieur Anwaltsakte: 40 550/Pe- Hans Dieter Gesthuysen
4300 Essen, den 12. Dez. 1972 Theaterplatz 3 .
Patentanmeldung
KYOWA HAKKO KOGYO KAEUSHIKI KAISHA 6-1, 1-chome, Ohte-machi, Chiyoda-ku, Tokyo- to, Japan
Verfahren zur Produktion von HefezeIlen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Produktion' von Hefezollen durch Züchtung des Mikroorganismus Torulopsis methanosorbosa nov.sp.
Die üblicher V/eise zur Fermentation verwendeten Kohlenstoffquollen sind hauptsächlich von landwirtschaftlichen Produkten hergeleitet v/orden. Inzwischen sind auch Formentationsprozesse unter Verwendung von Kohlenwasserstoffen, wie Kerosin, Naphtha, Leichtöl und verschiedenen η-Paraffinen für das Wachstum von Mikroorganismen untersucht worden, um das Nährmittelproblem zu
309828/0308
BAD ORIGINAL
Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen, Theaterplatz 3
lösen, d..h. zu erv/artendon Mangel an Nahrungsmitteln In der nahen Zukunft. Eine Schwierigkeit ist dabei in der Erlangung ausgeprägter Stämme aufgetreten, die befähigt sind, Kohlenwasserstoffe zu assimilieren. Außerdem existieren noch verschiedene Probleme im Hinblick auf die zu verwendende Apparatur, wie z.B. die Notwendigkeit für eine große Kraftmenge zum lebhaften Rühren zu sorgen, welches notwendig ist, um die Assimilation der in hartem Wasser löslichen Kohlenwasserstoffe vermittels des Mikroorganismus zu fördern, als auch noch Kühlprobleme, die infolge der großen, während des ZUchtens erzeugten thermischen Energie auftreten. Vom praktischen Gesichtspunkt aus gibt es auch noch andere Schwierigkeiten, wie die Behandlung der· toxischen Substanzen, z. B. der Krebserreger, die im Petroleum, in Kohlenwasserstoffen, Fermentations-Ablaugen und dergleichen enthalten sind.
Es ist daher wünschenswert, Hefezellen zu produzieren, unter Verwendung von Methanol als Haupt-C-Quelle, da dieses bei geringen Kosten durch die chemische Industrie in großen Mengen erhalten v/erden kann. Erfindungsgemäß ist nun eine Hefe gefunden worden, die eine ausgezeichnete Methanol-Assimilierbarkeit hat und die für die Produktion von Hefezellen im großen Maßstab geeignet i.c;t.
Die vorliegende Erfindung umfaßt im weiten Sinne ein Verfahren zur Produktion von Hefezellen durch Züchtung eines neuen Stammes, der eine ausgezeichnete Methanol-Assimilierbarkeit besitzt - bezeichnet als Torulopsis methanosorbosa - in einem Zuchtmediuia, das Methanol als Haupt-C-Quolle enthält. Im besonderen umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Produzieren von
309828/OäOi BADORIG!HAL
Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen !,Theaterplatz
Ilefezellen in hoher Ausbeute durch Züchten jener Hefe in einem Kulturmedium, das Methanol als Haupt~C-Q,uello enthält, in Gegenwart von wenigstens einem Glied, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Thiamin und dessen Salzen, p-Aminobenzoesäure und deren Salzen, Folinsäure und deren Salzen, Riboflavin, Biotin , Inosit besteht und Calcium-Ionen enthält.
Bekannte Hefen, die imstande sind, Methanol zu assimilieren, sind vieniger üblich als Bakterien, die solch eine Assimilierfähigkeit besitzen. Es ist auch berichtet worden, daß Hefen, die imstande sind, Methanol zu assimilieren, drei Stämme von Candida (FR-PS 2 ΟΟβ 235ί Sammlung von Vorträgen in "The Meeting of Japanese Agricultural Chemistry", 1970, S. 344-345)> zwei Stämme von Pichia und einen Stamm von Hansenula (FR-PS 2 006 235)* einen Stamm von JCloeckera (Agricultural Biological Chemistry, 1969.» Bd. 33* S. I5I9) und einen Stamm von Torulopsis (Sammlung von Vorträgen in "The Meeting of Japanese Agricultural Chemistry? 1970, S. 344) einschließen.
Torulopsis methanosorbosa, welcher für den erfindungsgemäßen Zweck verwendet werden kann, ist den erwähnten bekannten Hefen im Hinblick auf die Ausbeute an Zellen aus Methanol und auf die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit (Ü) überlegen. Ferner liegen die maximale Wachstumstemperatur und das Optimum an Wachstumstemperatur der vorliegenden Hefe bei 43 bzw. 37 C. Demzufolge ist die vorliegende Hefe durch eine höhere Wachstumstemperatur · gekennzeichnet im Vergleich mit den üblichen konventionellen Hefen.
3 0 9 8 2 S / 0 3 Ü
Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen, Theaterplatz 3
Beim Züchten des Mikroorganismus ist das Kühlen der Fermentations wärme ein wichtiges Problem hinsichtlich des Kühlwassers, der Kühlapparatur und-dergleichen. Eine höhere Temperatur beim Züchten ist vorteilhaft zur Unterstützung eines Kühleffektes, da die Differenz zwischen der Temperatur beim Züchten und der Temperatur des Kühlwassers größer und außerdem die Fermentation bei einer höheren Temperatur beschleunigt wird.
Torulopsis methanosorbosa KY 12 001 (PERM P-Nr. 1 208) ATCC 2036I) - wie in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet - ist ein Zuchttyp einer neuen Gattung vom Genus Torulopsis und ist hinterlegt und frei verfügbar auf nichtbeschränkter Bads bei der American Type Culture Collection. Es hat die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften:
a) Wachstum im Medium:
1) YM-Flüssigkeitsmedium:
gutes Wachstum, wenn innerhalb von J5 Tagen bei 250C gezüchtet; kompaktes Sediment; keine Filmbildung; Größe der Zellen- (2-4)x(l,5-4)yu; kugelförmig; Ausbreitung durch Sprossung (budding).
2) YM-Agar-Agar-Medium:
mäßiges Wachstum, wenn bei 25°C gezüchtet; die Oberfläche der Kolonie ist weiß, glänzend und buttergleich. Die große Kolonie ist eben oder erhöht und deren Rand ist schwach erhöht.
309828/Ö30Ö
Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen, Theaterplatz 3
J5) Abschrägung von Kartoffelextrakt-Agar-Agar: Die Zellen sind alle kugelförmig und fortpflanzungsfähig. Pseudomycel, echtes Mycel, Sporen, Arthrosporen und dergleichen sind, nicht beobachtet.
b) Bildung von Ascosporen: nicht beobachtet
c) Bildung von Ballistosporen: nicht beobachtet
d) Physiologische Eigenschaften;
1) Optimale Wachstumsbedingungen: PH5-6; 37°Cj aerob
2) Wachstumsbereich:
p„3-9> nicht höher als 4j5°C
rl
j5) Nitratassimilisation: positiv
4) Fettzersetzung: negativ
5) Harnstoffzersetzung: negativ
6) Gelatinezersetzung: negativ
7) Bildung von Carotinoid: negativ
B) namhafte Bildung von organischen Säuren: negativ 9) Bildung von stärkeähnlichen Substanzen: negativ
e) Vergärbarkeit von Zucker:
d-Glukose und d-Mannose werden fermentiert: 309828/03 0 0
Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen 1, Theaterplatz
Maltose, Saccharose, Laktose, Raffinose, d-Galaktose.. und Cellobiose werden nicht fermentiert.
f) Assimilierbarkeit:
Assimilierbar: d-Glukose, d-Galaktose, 1-Sorbose, Trehalose, d-Xylose, 1-Arabinose, 1-Rharanose, Glycerin, d-Mannit, d#l-MiIchsäure, Bernsteinsäure, Citronensäure, Adonit, d-Sorbit, d-Fruktose, Methanol und Äthanol.
Nicht-assimilierbar: d-Ribose, d-Arabinose, Maltose, Saccharose, Milchzucker, Melibiose, Cellobiose, Raffinose, Arbutin, lösliche Stärke, Inulin, Erythrit, Inosit, Dulcit, d-Glukonsäure, 2-Ketoglukonsäure, Essigsäure und n-Paraffine.
g) befähigt zum Assimilieren: Methanol und Äthanol als einzige C-Quelle.
Bemerkung: Zusammensetzung des YM-Mediums: 5 S Pepton, j5 g Hefeextrakt, 3 g Malzextrakt, 10 g Glukose sind in ml Wasser gelöst.
Wenn man die oben erwähnten Eigenschafton des vorliegenden Stammes mit denen von bekannton Arten - wie in "Die Hofe, CIi1G fco:;onomiGohe Studie" von J. Lodder und Mitarbeiter, 1970, Nwi.li Holland Publishing Co., Amsterdam, London offOi.bart - vergloicht, üo ist Torulopsis nitratophila eng mit dem vorliegenden Stamm verwandt. Ea gibt jedoch zwischen ihnen Unterschiede im .Ilnblici:
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BAD ORIGINAL
Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen, Theaterplatz 3
7 -
auf die Vergärbarkeit von Galaktose, die Assimilierbarkeit von Sorbose, Ribose, Milchsäure, Bernsteinsäure, Citronensäure, Methanol und dergleichen und auf die maximale Wachsturnstemperatur. Infolgedessen ist bestimmt worden, daß der vorliegende Stamm eine neue Art vom Genus Torulopsis ist, er wurde als Torulopsis methanosorbosa bezeichnet·
Züchtungsmethoden, wie sie mit konventionellen Hefen verwendet werden, können im allgemeinen auch auf den erfindungsgemäßen Züchtungsprozeß angewendet werden· Eine flüssige Kultur, insbes. eine Unterwasserkultur mit gleichzeitigem Rühren ist am geeignetsten. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird vorgezogen, das Züchten bei ca. 20 - 4o°, vorzugsweise bei ca. j50 - 4o°C und bei einem p„ von ca. 4 - 10 durchzuführen.
Das für den erfindungsgemäßen Zweck verwendete Medium sollte eine C-Q,uelle, Vielehe imstande ist, durch den verwendeten Mikoorganismus assimiliert zu werden (wie Methanol, iithanol, Sorbose), eine N-Q1UeIIe, organische und "anorganische N-Quellen (wie Harnstoff, Ammoniak, Ammonsulfat, Aminonnitrat und dergleichen), eine natürliche N-Quelle (wie Maiswasser, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt und dergleichen), verschiedene anorganische Salze, wie Phosphate (z. B. Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat und dergleichen), Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Eisensulfat, Zinksulfat, Calciumsulfat und dergleichen und eine das Wachstum fördernde Substanz enthalten.
309828/0300
Andrejewslei, Honke & Gestfiuysen, Patentanwälte, 4300 Esmh !,Tlieaterpiatz 3
Wenn Methanol als Haupt-C-Quelle verwendet wird, so ist es möglich, Hefezellen mit hoher Ausbeute durch Zusatz von Vitaminen (wie Thiaminhydrochlorid, p-Aminobenzoesäure, Polinsäure, Riboflavin, Biotin, Inosit und dergleichen) und/oder Ca-haltige Verbindungen (wie Calciumchlorid, Calciumacetat, Calciumphosphat und dergleichen) zu dem Medium zu erhalten.
Die Konzentration solcher zugesetzten Vitamine und Ca-haltigen Verbindungen kann in Abhängigkeit von dem Zusatzstoff variieren, Z.B. reichen die Konzentrationen im Falle von Biotin und Follnsäure vorzugsweise von 10-100^/1, und die Konzentration im Falle von Thiamin-hydroohlorid liegt vorzugsweise bei 50-1000^/1, die Konzentrationen liegen im Falle von p-Aminobenzoesäure, Riboflavin und Inosit vorzugsweise bei lOO-lQQO^l, und die bevorzugten Konzentrationen von Calciumchlorid, Calolumphosphat und dergleichen liegen bei über 10 Mol/l.
Die vorliegende Erfindung wird ferner durch die nachfolgenden Beispiele noch klarer erläutert werden.
Beispiel 1
Es wurde ein Grundmedium bereitet durch Lösen von 10 ml Methanol, 4 g NH4Cl, 1 g KH2PO4, 1 g K2HPO4, qß g MgSO4,JHgQ, 10 mg FeSO4. 7H2O, 10 mg MnSO4^-OH2O und 0,2 g CaCl2 in 1 1 entionisiertem Wasser. Dann wurde das Zuchtmedlum bereitet duroh getrenntes Zufügen der Vitamine, die in Tab. 1 aufgeführt sind, zu den Proben des erhaltenen Grundmediums. Es wurde dann jede Probe mit Torulopsis methanosorbosa KY 12 001 (FERM P-Nr. 1 208 (ATCC 2036I) beimpft.
309828/030Θ
Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen !,Theaterplafz
Die Züchtung wurde in 62 Stunden bei 30°C unter Schütteln ausgeführt, um das in Tab. 1 gezeigte Stammwaohstum zu ergeben, worin der Wachstumsgrad ausgedrückt ist durch die optische Dichte bei 660 nui, bestimmt in einer viermal verdünnten Zuchtbrühe.
Tabelle 1
<■ Zugesetzte Mange Wachstum
(pro 1 1 Probe) (opt. Dichte bei 660 mjü)
Thiamin-hydrochlorid 1 000//! 0,215
Riboflavin I 000/71 0,162
p-Aminobenzoesäure 200 //1 0,175
Folinsäure 10 f/\ 0,157
Biotin 10 f/\ 0,225
Inosit 1 000 //1 0,185
kein Zusatz
Beispiel 2
Ein gleicher Stamm - wie der im Beispiel 1 verwendete - wurde einem Medium aufgeimpft, das folgende Zusammensetzung hatte: 20 ml Methanol, 4 g/l NH11Cl, 2 g/l KHgPO^, 0,5 g/l MgS0_,.7H20, Biotin, 1000 f/\ Thiamin-hydrochlorid und 5xlO"5Mol/l
CaCl2. Das Medium hatte ein p„ von 6,0 und es wurde unter Schütteln 72 Stunden lang bei 300C gezüchtet.
30 98 28 /,03Öd
Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen 1, Theaterplatz 3
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Das Wachstum des Stammes bei 66O mti in einer viermal verdünnten Zuchtbrühe betrug 0,92, ausgedrückt durch die optische Dichte. Eine andere Züchtung wurde auf eine gleiche, oben beschriebene Weise ausgeführt, jedoch ohne die Verwendung von CaClg. Sie ergab ein Wachstum von nur 0,52 ausgedrückt durch die optische Dichte.
Beispiel 3
300 ml eines Mediums mit folgender Zusammensetzung: 0,4 0,2 fo KH2PO^, 0,05 % MgSO2^.7H2O, 0,02 % CaCIg.2HgO, Biotin und 100)f /1 Thiamin-hydrochlorid wurden in einen 2 1-Erlenmeyerkolben eingetragen, und es wurde 15 Minuten lang bei 1200C sterilisiert. Dann wurden 6 ml Methanol (2 % v/v) und 6 g CaCO-, zugesetzt. Das anfallende Medium wurde mit Törulopsis methanosorbosa KY 12 001 (PERM P-Nr. 1208) (ATCC 20361) beimpft, und das anfallende Gemisch wurde unter Schütteln. (220 Umdrehungen pro Minute) in 48 Stunden bei 37°C gezüchtet. Der Zuchtbrühe wurde Salzsäure zugefügt, um das CaCO-, zu lösen. Diese Flüssigkeit wurde alsdann zentrifugiert mit nachfolgendem Gefriertrocknen, um 2,05 g Zellsubstanz zu ergeben. Der Rohprotein-Gehalt der erhaltenen Zellen betrug 48,3 %*
Beispiel 4
3 1 eines Medium folgender Zusammensetzung: 0,5 $> (NHh )2SO2., 0,2 % KH2PO^, 0,05 % MgSO21.7H2O, 0,02 % CaCl3.2HgO, 10 mg/1 FeSOj1^H2O, 10 mg/1 MnSO4^-OH2O, IO//I Biotin und lobjT/1-Thiamin-hydrochlorid wurden in eine 5 1-Gärflasche eingetragen,
309828/Q30Ö
Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen 1, Theater platz 3
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und es wurde sterilisiert. Dann wurden JO ml Methanol zugefügt.
Das anfallende Medium wurde mit Torulopsis methanosorbosa KY 12 001 (EERM P-Nr. 120$) (ATCC 20361) beimpft, und dann wurde das Medium 4o Stunden lang bei 370C unter Belüften 0 l/Min.) und Rühren (600 r.p.m.) der Züchtung unterworfen. Wenn die Methanol-Konzentration des Mediums auf 0,2 % zurückgegangen war, wurde wiederholt Methanol zugesetzt, um die Konzentration während des Züchtens auf JL $ zu halten. Das pT, des Zuchtmediums wurde
xl
während des Züchtens mit Hilfe von Ammoniakwasser auf 5*5 gehalten. Die Zuchtbrühe wurde zentrifugiert und dann gefriergetrocknet, um 36 g Zellsubstanz zu ergeben.
Das im Abgas verdampfte Methanol wurde in einem Abscheider wiedergewonnen. Das verbrauchte Methanol wurde durch Abzug der wiedergewonnenen von der zugesetzten Methanolmenge bestimmt. Die Ausbeute an Zellsubstanz aus dem verbrauchten Methanol war 42 % (basierend auf dem Gewicht). Obgleich der eigentliche Wachstumsgrad während des tZüchtens schwankte, lag der maximale Wert (μ max), bei 0,16 Stunden ~ . Der Rohprotein-Gehalt der getrockneten'Zellen betrug 54 $·
Es könnan bei der vorliegenden Erfindung verschiedene Abänderungen vorgenommen werden.
Nachdem die vorliegende Erfindung, welche unter Schutz gestellt werden soll, beschrieben worden ist, wird sie in den nachfolgenden Ansprüchen dargetan.
308323/030$

Claims (1)

  1. Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen !,Theateiplcrtz 3
    - 12 -
    Patentansprüche: .
    JL\ Verfahren zur Produktion von Hefezellen, dadurch 'gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus, der zum Genus Torulopsis gehört, in einem Zuchtmedium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und eine anorganische Quelle enthält, züchtet, und daraus die Hefezellen gewinnt.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der * Mikroorganismus Torulopsis methanosorbosa ist.
    j3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Torulopsis methanosorbosa KY 12 001 (FERM P-Nr. 12Oo) (ATCC 20361) ist.
    4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Zuchtmedium Methanol enthält.
    5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Zuchtmedium Äthanol und/ader Sorbose enthält.
    6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Zuchtmedium außerdem ein Mitglied aus der Gruppe enthält, die aus Thiamin und dessen Salzen, p-Aminosäuro und deren Salzen, Folinsäure und deren Salze, Riboflavin, Biotin, Inosit und Calciumionon besteht.
    30982Ö/Ü3ÜÖ
    Andrejewski, Honke & Gesihuysen, Patentanwälte, 4300 Essen "!,Theaierpfafe
    7· Verfahren nach Anspruch β, dadurch gekennzeichnet, daß das Calciuraion Calciumchlorid ist.
    ü. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß' dem Zuchtmedium während des Züchtens Methanol zugesetzt wird:, um während des Zuchtprozesses seinen Verbrauch wieder auszugleichen.
    9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Züchten bei einer Temperatur von ca. 20-40 C und bei einem ρ von ca. 4-10 getätigt wird.
    BAD
    30S828/U3Ü
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