DE2500876C3

DE2500876C3 - Aerobes Züchten von Hefezellen

Info

Publication number: DE2500876C3
Application number: DE19752500876
Authority: DE
Inventors: Reiko Michimi; Teizi Urakami
Original assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Current assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Priority date: 1974-01-14
Filing date: 1975-01-10
Publication date: 1979-02-22
Also published as: DE2500876B2; GB1461234A; DE2500876A1; CA1030468A; IT1028323B; JPS50100283A

Description

Die Erfindung betrifft ein aerobes Verfahren zum Züchten von Hefezellen gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs.

Bislang werden Abfallmelassen, Sulfitablaugen und η-Paraffine als Kohlenstoffquellen in Kulturmedien zum Züchten von Hefezellen verwendet. Neuerdings sind jedoch viele Arbeiten erscheinen, die das Kultivieren von Hefen mit billigen Kohlsnstoffquellen betreffen. In den letzten Jahren sind mit dem Fortschreiten der organischen synthetischen chemischen Industrie Methanol und Äthanol in großen Mengen hergestellt worden, so daß diese Alkohole mit niedrigen Kosten erhältlich sind. Diese Alkohole sind wasserlöslich und können daher sehr gut als Kohlenstoffquellen für Hefekultivierungsmedien verwendet werden.

Durch die Erfindung wird nun ein Verfahren zum Züchten von Hefezellen zur Verfügung gestellt, bei dein ein bestimmter Hefestamm gezüchtet wird, der imstande ist, Methanol und/oder Äthanol als Hauptkohlenstoffquellen zu assimilieren.

Die Erfindung ist im Patentanspruch angegeben.

Aus Erden der Reisfelder von Kashiwazaki, Niigata, Miyagi, Nakanoguchigawa, Niigata und Kamo, Niigata, wurden einige solcher Stämme isoliert. Man nimmt an, daß sie zur Gattung Pichia gehören; sie unterscheiden sich jedoch in verschiedenen Punkten von bekannten Hefearten dieser Gattung. Es wurde daher die Schlußfolgerung gezogen, daß es sich um neue Arten handelt, und sie wurden als Pichia aganobii bezeichnet. Die erfindungsgemäß eingesetzten Stämme wurden als Pichia aganobii Y-16, Y-145, Y-410 und Y-1023 bezeichnet. Sie wurden beim Fermentation Research Institute, Agsnry of Industrial Science and Technology, Chiba, Japan, hinterlegt. Ihre Hinterlegungsnummern sind FERM-P Nr. 2427, FERM-P Nr. 2428, FERM-P Nr. 2429 und FERM-P Nr. 2430. Der Hinterlegungstag ist der 25. Dezember 1973.

Nachstehend sind die mikrobiologischen Eigenschaften der obengenannten Stämme angegeben:

Mikrobiologische Eigenschaften von Pichia aganobii Y-16( = FERM-P2427).

(a) Wachstumszustand auf verschiedenen Medien:

1. MY-Fiüssigkeitsmedium, 2- bis 7tägige Kultivierung bei 28°C:

Vegetative Zellen mit einer Größe von 2 bis 5 χ 2 bis 5 μ. Runde, ovale bis kurzellipsoide Gestalt, wobei sie einzeln oder in Paaren auftreten. Keine Bildung eines Häutchens bzw. einer Membran. Keine Bildung von Arthrosporen. Reproduktion durch multilaterales Knospen.

2. MY-Agarmedium, 4tägige Kultivierung bei 28°C:

(1) Wachstumsgrad: üppiges Wachstum.

(2) Gestalt des Umfangs der Kolonien: gesamter Umfang.

(3) Erhabener Zustand der Kolonien: gepolstert oder konvex.

(4) Gestalt der Oberfläche der Kolonien: glatt.

(5) Glanz der Kolonien: glänzend.

(6) Natur der Kolonien: butterartig bzw. buttersäureartig.

(7) Farbton: gelblichweiß.

3. Metha;iolhaltiges Agarmedium(* Fußnote
Nr. 2), 7tägige Kultivierung bei 28°C:

(1) Wachstumsgrad: üppiges Wachstum.

(2) Gestalt des Umfangs der Kolonien: gesamter Umfang.

(3) Erhabener Zustand der Kolonien: gepolstert oder konvex.

(4) Gestalt der Oberfläche der Kolonien: glatt.

(5) Glanz der Kolonien: glänzend.

(6) Natur der Kolonien: butterartig bzw. buttersäureartig.

(7) Farbton: gelblichwei ß.

4. Riesige Kolonien auf MY-Agarmedium, 20tägige Kultivierung bei 20⁰C:

(1) Wachstumsgrad: üppiges Wachstum.

(2) Gestalt des Umfangs der Kolonien: gesamter Umfang.

(3) Erhabener Zustand der Kolonien: erhaben.

(4) Gestalt der Oberfläche der Kolonien: glatt.

(5) Glanz der Kolonien: kreideartig.

(6) Natur der Kolonien: butterartig bzw. buttcrsäureartig.

(7) Farbton:weiß.

¹V Objektlrägerkultur auf Maisextrakt-Agarmedi um,4wöchige Kultivierung bei 28°C:
Keine Bildung eines echten Mycels noch eines Pseudomycels.

(b) Bildung von Ascosporen:

Die Bildung von Ascosporen wurde auf einem Malzagarmedium und einem Natriumacetatagarmedium beobachtet. Die Ascosporen hatten eine ovale bis ellipsoide Gestalt und eine Anzahl von 1 bis 4.

(c) Bildung von Ballistosporen:

Auf einer MY-Agarplattenkultur wurde keine Bildung von Ballistosporen beobachtet.

(d) Physiologische Eigenschaften:

1. Optimale Wachstumsbedingungen:

Gutes Wachstum bei 20 bis 35°C. Ein gutes Wachstum wurde bei einem pH von 2 bis 7,5 beobachtet.

2. Wachstumsbereiche:

Das Wachstum wurde bei oberhalb 35° C schlecht. Das Wachstum wurde bei einem pH-Wert von oberhalb 7,5 schlecht.

3. Assimilierung von Nitraten: negativ.

4. Assimilierung von Arbutin: positiv.

5. Verflüssigung von Gelatine: negativ.

6. Bildung von karotinoidem Pigment: negativ.

7. Bildung von starkeartigen Verbindungen: negativ.

8. Vitaminerfordernde Eigenschaften: Biotin war absolut erforderlich. Thiamin wurde stimulativ benötigt.

9. Koagulierun;.' von Milch: negativ

10. Osmotoleranz: Saiztoleranz, wobei in einer wäßrigen Lösung, die nicht mehr als 8 Gew.-% Natriumchlorid enthielt, ein Wachstum festgestellt wurde.

11. Assimilierung von Methanol oder Äthanol (* "■ Fußnote Nr. 3): Ausgezeichnetes Wachstum unter Assimilierung von Methanol als Kohlenstoffquelle selbst in Abwesenheit von anderen Kohlenstoffquellen Gutes Wachstum unter Assimilierung von Äthanol, obgleich nur langsam.

12. Ureasetest: negativ.

13. Fettspaltung: negativ.

14. Erzeugung überschüssiger Säure: negativ.

15. Bildung von Ester: negativ. ii

(e) Fermentation von Saccharides

D-Glukose +

D-Galaciose —

Saccharose —

Maltose —

Cellobiose -

Trehalose -

Lactose —

Inulin — Raffinose

Melibiose -

Λ-Melhyl-D-glucosid — Lösliche Stärke

(f) Assimilierung von verschiedenen Kohlensloffquellen:

Kohlenstoffquelle

U-Arabinose L-Arabinose D-Ribose D-Xylose D-Glukosc D-Mannose D-Galactose L-Rhamnose Maltose Saccharose Lactose Melibiose Cellobiose Trehalose Raffinose Melezitose «-Methyl-D-glucosid Lösliche Stärke Inulin Erythrit Inosit D-Mannit Glyzerin DL-Milchsäure Salicin Bernsteinsäure Zitronensäure L-Sorbose Arbutin D-Glycitit

Assimilierung + (langsam)

+ (langsam)

f +

Es werden nur diejenigen Eigenschaften angegeben, die sich von denjenigen von Pichia aganobii FERM-P 2427 unterscheiden.

(f) Assimilierung von verschiedenen
Kohlenstoffquellen:

Zitronensäure —

Mikrobiologische Eigenschaften von Pichia aganobii FERM-P 2428:

(f) Assimilierung von verschiedenen
Kohlenstoffquellen:

DL-Milchsäure
Zitronensäure

+ (langsam)

Mikrobiologische Eigenschaften von Pichia aganobii FERM-P 2429:

Mikrobiologische Eigenschaften von Pichia aganobii FERM-P 2430:

(e) Assimilierung von verschiedenen
Kohlenstoffquellen:

Zitronensäure —

D-Arabinose -

Fußnoten:

1. Die Tests wurden entsprechend den Angaben in Lodders »The Yeasts, A Taxonomic Study«, 1970 und Hiroshi lizuka und Shoji Goto: »Method for Classification and Identification of Yeasts«, 1969, durchgeführt.

2. Das methanol- (oder äthanol-) haltige Agarschrägmedium wurde auf folgende Weise hergestellt:

In 1 !destilliertem Wasser wurden

4 g KH₂PO₄,

3 g (N Ht)₂SO₄.

0,4 g MsSO₄ · 7 H₂O.
0,2 mg FeSO₄ ■ 7 H₂O,

5 mg CaCI₂ · 2 H₂O,
0,5 mg MnSO₄ ■ 4 H₂O,
0,5 mg ZnSO₄ · 7 H₂O,

4 μg Biotin,

200 μgThiaminhydrochlorid und

20 g Agar

aufgelöst Die resultierende Lösung wurde auf einen pH-Wert von 4,7 eingestellt, 20 min lang bei 1 atü sterilisiert und sodann aseptisch mit 10 g Methanol (oder Äthanol) versel/t.

3. Es wurde das gleiche Flüssigkeitsmedium wie bei Fußnote 2 verwendet, mit der Ausnahme, daß das Agar weggelassen wurde.

Aufgrund der Tatsache, daß die obigen Stämme alle runde bis ellipsoide Ascosporen und keine Arthrosporen oder Ballistosporen bilden und die Zellen rund oder oval sind, daß die Stämme durch eine multilaterale Verknospung reproduziert werden, daß sie kein Pseudomycelium bilden, keine Nitrate assimilieren und kein Häutchen bilden, werden sie nach L ο d d e r: »The Yeasts, A Taxonomic Study« (1970) als zu der Art Pichia gehörig angesehen.

Beim Vergleich der Eigenschaften der erfindungsgemäß verwendeten Hefen mit denjenigen der bekannten Stämme, die in der Arbeit von Lodder beschrieben sind, stellt sich heraus, daß die Hefen darin den Stämmen ähnlich sind, die zu der Art Pichia fannosa

gehören, weil sie Galactose assimilieren und Saccharose, Maltose und Laktose nicht assimilieren und weil sie D-Glukose fermentieren. Sie unterscheiden sich jedoch in verschiedenen anderen Punkten, beispielsweise in der Oberflächenform der Kolonien, der Größe der Zellen, der Bildung von Häutchen, der Bildung von Arthrosporen, der Form von Ascosporen, eier Fermentierung von Galactose und Trehalose, der Assimilierung von D-Arabinose, L-Arabinose, L-Sorbose, Cellubiose, Trehalose, Laktose, D-Xylose, Äthanol, Sdicin, Eernstein- -1:ire, Zitronensäure und Methanol- der Spaltung von Arbutin, der Erfordernis nach Vitaminen und dem Wachstum bei 37° C.

Die Gemäß der Erfindung verwendeten Stämme sind die gleichen wie die Stämme von Pichia pinus hinsichtlich der Eigenschaften, daß sie Arbutin spalten und Cellubiose und Erithritol assimilieren, jedoch nicht Saccharose, Maltose oder Laktose, aber sie unterscheiden sich davon hinsichtlich der Fermentierung von D-Glucose, der Assimilierung von D-Arabinose, L-Arabinose, D-Mannose, D-Galactose, L-Ramnose, Äthanol, Zitronensäure und L-Sorbose und hinsichtlich des Urease-Versuches.

Aus den oben angegebenen Unterschieden wird ersichtlich, daß die erfindungsgemäß verwendeten Hefen nicht zu den bekannten Hefen gehören, wie sie in der Art von L ο d d e r zusammengestellt sind. Aufgrund der Tatsache, daß die erfindungsgemäßen Hefen Methanol und/oder Äthanol assimilieren, gibt es auch keine Übereinstimmung der erfindungsgemäß eingesetzten Hefen mit bekannten Stämmen. Daraus !:ann die Schlußfolgerung gezogen werden, daß die erfindungsgemäß verwendeten Hefen zu einer neuen An gehören, die als Pichia aganobii bezeichnet wird.

Die Kulturflüssigkeit, die zur Kultivierung der erfindungsgemäßen Hefe verwendet wird, kann jedes beliebige synthetische oder natürliche Medium sein, sofern es Methanol und/oder Äthanol als Hauptkohlenstoffquelle enthält. Es enthält weiterhin geeignete Mengen von Stickstoffquellen, anorganische Stoffe, Vitamine und andere wachstumsfördernde Substanzen.

Als Stickstoffquellen werden beispielsweise Ammoniumsalze, Harnstoff, Maisque"wasser, Kasein, Hefeextrakt und Fleischextrakt verwendet. Weiterhin werden anorganische Salze, wie Calciumsalze, Magnesiumsalze, Kaliumsalze, Phosphate, Mangansalze, Zinksalze, Eisen salze und Kupfersalze, und Substanzen, die für das Wachstum erforderlich sind, oder wachstumsfördernde Substanzen, wie Vitamine und Aminosäuren, zugesetzt.

Die Kulturflüssigkeit enthält 6 Gew.-% oder weniger Methanol und/oder Äthanol.

Weiterhin wird die Kultivierung unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von 20 bis 33° C, insbesondere von 27 bis 32°C, und bei einem pH-Wert von 7,5 oder weniger, insbesondere ;on 2 bis 7, durchgeführt.

Die Kultivierung kann absatzweise oder kontinuierlich durchgeführt werden. Im Falle der Verwendung eines Ammoniumsalzes als Stickstoffqnelle wird Ammoniak während der Kultivierung verbraucht, weil Zellen gebildet werden, wodurch der pH-Wert der Kulturflüssigkeit verringert wird. Um den pH-Wert der Kulturflüssigkeit während der Kultivierung bei einem konstanten Wert zu halten, ist der pH-Wert der Kulturflüssigkeit daher durch Zugabe von Ammoniak, Kaliumhydroxid oder Natriumhydroxid von Zeit zu Zeit nachzustellen.

Nach beendigter Kultivierung werden die resultierenden Zellen von der Kühlflüssigkeit durch Filtrierung oder Zentrilugierung abgetrennt. Erforderlichenfalls werden die Zellen gewaschen.

Die auf diese Weise erhaltenen nassen Zellen werden getrocknet. Sie können entweder wie sie sind oder nach verschiedenen Behandlungen verwendet werden. Ei können auch aus den so erhaltenen Zellen endozellulärt Substanzen, wie Nucleinsäuren, Vitamine, Koenzyme. Proteine und Lipide, als Reinsubstanzen oder Gemische

ίο extrahiert werden, worauf diese als Futtermittel. Nahrungsmittel, Arzneimittel etc. verwendet werden können.

Hinsichtlich der Erfindungshöhe wird auf BPatGei i: 9,156, verwiesen.

Zum Fortschritt wird ausgeführt, daß beim erfindungsgemäßen Verfahren durch die Verwendung von Hefezellen diese wesentlich leichter aus der Kulturfiussigkeit abzutrennen sind als bei bekannten Verfahren. bei denen Bakterien gezüchtet werden.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

Beispiel 1

In 1 I reinem Wasser wurden

4 g KH₂PO₄,
3 g (N H₄J₂SO₄,

0,4 g MgSO₄ · 7 H₂O,
0,2 mg FeSO₄ · 7 H₂O,

5 mg CaCI₂ · 2 H₂O,
0,5 mg MnSO₄ ■ 4 HA

so 0,2 mg CuSO₄ ■ 5H₂O.
20 μg Biotin und
1 mgThiaminhydrochlorid

aufgelöst, und die resultierende Lösung -vurde auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt. 500 ml dieser Kuhurflüssig-

j-, keit wurden in einen 1 -1-Minikolben gegeben und 20 min bei 1 atü sterilisiert. Sodann wurden 5 g Methanol zugesetzt. In dieser Kulturflüssigkeit wurden 2 Vol.-% einer Vorkulturflübsigkeit Pichia aganobii FERM- P 2427 gegeben. Die Vorkultur war hergestellt worden.

indem die Hefe 48 Std. bei 28°C in einem η eihanolhaltigen Medium der gleichen Zusammensetzung wie oben bei einem Anfangs-pH-Wert von 5 kultiviert worden war. Es wurde eine atrobe Rührkultur 53 Std. lang bei 32°C vorgenommen, wobei Ammoniakwasser zugesetzt wurde, uin den pH-Wert der Kulturflüssigkeit bei 4,5 zu halten. Nach beendigter Kultivierung wurde zentrifugiert, wodurch nasse Zellen gesammelt wurden. Diese erhaltenen Zellen wurden 24 Std. bei 80^cC getrocknet, wodurch 3,4 g Zellen/l Kulturflüssigkeit erhalten

so wurden.

Beispie! 2

Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß anstelle von Pichia aganobii FERM-P 2427 Pichia aganobii FERM-P 2429 verwendet wurde und daß die aerobe Rührkultur 46 Std. bei 28°C anstelle 53 Std. bei 32°C durchgeführt wurde. Es wurden 3,J g Zellen pro ! Kulturflüssigkeit erhalten.

Beispiel 3

Beispiel i wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß anstelle von Pichia aganobii FHRM-P 2427 Pichia b5 aganobii FERM-P 2428 verwendet v.üicJe und daß die aerobe Rührkultur 55 Std. bei 28°C anstelle von 53 Std. bei 32°C durchgeführt wurde. Es wurden 3,3 g Zellen pro I der Kühlflüssigkeit erhalten

Beispiel 4

Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß anstelle von Pichia aganobii FERM-P 2427 Pichia aganobü FERM-P 2430 verwendet wurde. Es wurden 3,5 g Zellen pro i der !Ojlturflüssigkeit erhallen.

Beispiel 5

Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Kulturflüssigkeit 2,5 g Äthanol anstelle von 5 g Methanol enthielt und daß die Vorkultivierung 4 Tage

anstelle von 48 Std. durchgeführt wurde und daC schließ!'^': die aerobe Rührkultur 4 Tage bei ?8°C anstelle von 53 Std. bei 32°Γ durchgeführt wurde. E: wurden 3,1 g Zellen pro I der Kulturflüssigkeit erhallen.

Beispiele 6bis8

Das Beispiel 5 wurde wiederholt, mit der Ausnahme

daß anstelle von Pichia aganobii FERM-P 2427 Pichia aganobii FERM-P 2*29, 2428 und 2430 verwende!

wurden Es wurden 3,2 g, 3,3 g bzw. 3,2 g Zellen pro 1 dei Kühlflüssigkeit erhalten.

Claims

Patentanspruch:

Aerobes Verfahren zum Züchten von Hefezellen in einer Kulturflüssigkeit, welche Methanol und/ oder Äthanol als Kohlenstoffquelle, Stickstoffquellen, anorganische Salze und andere Nährquellen enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe die Hefestämme Pichia aganobii FERM-P 2427,2428,2429 oder 2430 einsetzt.