DE1230751B

DE1230751B - Verfahren zur Herstellung von Lipase durch Zuechten von Mikroorganismen

Info

Publication number: DE1230751B
Application number: DEM54287A
Authority: DE
Inventors: Koichi Yamada; Haruo Machida
Original assignee: Meito Sangyo KK
Current assignee: Meito Sangyo KK
Priority date: 1961-09-25
Filing date: 1962-09-21
Publication date: 1966-12-22
Also published as: GB976415A; US3189529A

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

C12d

Deutsche Kl.: 6a- 22/05

Nummer: 1230 751

Aktenzeichen: M 54287IV a/6 a

Anmeldetag: 21. September 1962

Auslegetag: 22. Dezember 1966

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Lipase durch Züchten von Mikroorganismen in hierfür üblichen Nährmedien bei ebenfalls üblichen pH-Werten und Temperaturen.

Früher wurde mit Bezug auf die Herstellung von Lipase mittels Hefen von Peters et al. 1948 bei Verwendung von Mycotorula lipolytica die Bildung von Lipase beobachtet, während 1952 Nelson in gleicher Weise die Bildung von Lipase bei Verwendung von Deotricum candidum festgestellt hat. Da jedoch im ersteren Fall der Zweck die Denaturierung und Reifung von Butterfett bei der Herstellung von Butter Käse od. dgl. war, während im letzteren Fall die Aktivität der erhaltenen Lipase niedrig war, war es unmöglich, eine Lipase von hoher Aktivität unter Verwendung dieser Hefepilze herzustellen.

Es ist ein Verfahren zur Herstellung von Lipase durch Züchten von Aspergillus luchuensis bekannt, bei dem aus dem Kulturmedium durch Extraktion ein Lipase enthaltendes Produkt mit einer Aktivität von 1350 Olivenöleinheiten erhalten wird. Ebenfalls ist die Herstellung von Lipase unter Verwendung von Penicillium oxalicum, Pseudomonas fluorescens, Serratia marescens und Aspergillus flavus bekannt. Auch diese Verfahren sind, wie im nachstehenden Vergleichsversuch gezeigt wird, nicht zufriedenstellend.

Aufgabe der Erfindung ist nun, Lipase in größerer Menge im Nährmedium anzureichern. Zu diesem Zweck wurden zahlreiche Mikroben aus der Luft, dem Boden, Kloaken- oder Sielwasser od. dgl. isoliert und deren Lipasebildungsvermögen untersucht. Hierbei wurde ein Hefestamm, der zur Gattung Candida gehört, gefunden, dessen Erzeugungsvermögen von Lipase in einem Nährmedium beachtlich hoch war.

Das Verfahren zur Herstellung von Lipase durch Züchten von Mikroorganismen in hierfür üblichen Nährmedien bei ebenfalls üblichen pH-Werten und Temperaturen ist nun dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Candida cylindracea ATCC 14 830 verwendet

Der gemäß der Erfindung verwendete lipaseerzeugende Hefestamm Candida cylindracea ATCC 14 830 wurde aus dem Boden isoliert.

»ATCC« bedeutet die Hinterlegungsstelle, nämlich American Type Culture Collection, und »14 830« die Hinterlegungsnummer.

Die mikrobiologischen Kennzeichen sind:

(1) Zelle in Malzextrakt: Nach 3 Tagen bei 25°C sind die Zellen lang-oval bis zylindrisch oder pseudomyzelartig, (0,8 bis 3,5) · (2,0 bis 21) μ,

Verfahren zur Herstellung von Lipase durch
Züchten von Mikroorganismen

Anmelder:

Meito Sangyo Kabushiki Kaisha, Nagoya (Japan)

Vertreter:

Dr. E. Wiegand und Dipl.-Ing. W. Niemann,

Patentanwälte, München 15, Nußbaumstr. 10

Als Erfinder benannt:

Koichi Yamada, Tokio;

Haruo Machida, Saitama-Ken (Japan)

Beanspruchte Priorität:

Japan vom 25. September 1961 (34 236)

einzeln, in Paaren, in Ketten als Pseudomyzelium.

(2) Kulturen auf KartofFelagar: Gut entwickeltes Pseudomyzelium wird gebildet.

(3) Häutchenbildung: Grauer, leicht rauher und kriechender Festfilm wird auf dem Malzmedium gebildet.

(4) Sporenbildung: Keine Bildung.

(5) Strich- oder Streifenkultur: Gräulichweiß, an der Erhebung höckerig, am Rand gewellt, sehr feucht, trüb, runzelig für die netzförmige Ausbildung an der Oberfläche.

(6) Vergärung: Glucose+, Galactose—, Saccharose + (sehr schwach), Maitose —, Lactose —, Raffinose —.

(7) Zuckerassimilation: Glucose -f-, Galactose -{-, Saccharose +, Maltose -f- (sehr schwach), Lactose —, Xylose +.

(8) KNO₃-Assimilation: Negativ.

(9) Wachstum im Äthanolmedium: Ein Häutchen wird gebildet.

(10) Spaltung von Arbutin: Negativ.

Die sich aus den vorstehenden Merkmalen ergebenden Unterschiede zwischen dem Hefestamm Candida cylindracea ATCC 14 830 und Candida solani und Mycotorula lipolytica sind in der nachfolgenden Tabelle I aufgeführt. Daraus geht hervor, daß es sich bei Candida cylindracea ATCC 14 830 um einen neuen Stamm handelt.

609 748/71

I 230

Tabelle I

Mycotorula lipolytica

Candida solani

Candida cylindracea 14 830
ATCC

Zelle

Kolonien

Vergärung . .. : -U

Glucose

Saccharose

Zucker

Assimilation

Galactose

Maltose .... .....->

Sucrose :.

Spaltung von Arbutin

(2 bis 4,5) · (4 bis 22) μ

glatt,
gelblich

(2 bis 4) · (4 bis 13) μ

glatt,
gelblich

(sehr schwach)

+ (sehr schwach)

(0,8 bis 3,5) · (2 bis 21) μ

runzlig,

netzförmig,

gräulichweiß

+ (sehr schwach)

fehlt oder leicht positiv

Als Medium für _:die Züchtung des gemäß der Erfindung verwendeten Hefestammes kann ein natürliches oder synthetisches Medium verwendet werden, sofern es mindestens _reine Kohlenstoffquelle und eine anorganische Substanz enthält. Die Kohlenstoffquelle und die· Stickstoff quelle können beliebiger Art sein, solange sie durch Candida cylindracea ATCC 14 830 verwertbar sind. Geeignete Kohlenstoffquellen umfassen z. B. Saccharose, Lactose, Glucose, Xylose, Stärke od. dgl. In ähnlicher Weise kommt als Stiekstoff'lieferndes Material ein weiter Bereich von Stickstorfquellen in Frage, solange sie assimilierbar sind; z. B. können anorganische Ammoniumsalze, Aminosäuren und eine große Vielzahl anderer Proteinsubstanzen od. dgl. verwendet werden. Als anorganische Salze sind beispielsweise Phosphate, Magnesiumsalze, Calciumsalze und zahlreiche andere anorganische Salze geeignet. Es ist ersichtlich, daß die Mengen von Kohlenstoff- und Stickstorfquellen und anorganischen Salzen sowie die Zusammensetzung des Mediums selbst, in Abhängigkeit von der Anpassungsfähigkeit der erfindungsgemäß für die Erzeugung von Lipase verwendeten Hefe, variieren.

Bei der Züchtung wird eine optimale Temperatur für das Wachstum gewählt, wobei normalerweise 20 bis 35° C, vorzugsweise 25 bis 33° C geeignet sind, der pH-Wert des Mediums liegt zweckmäßig bei 5,0 bis 8,0. Normalerweise wird die Züchtung während 1 bis 7 Tagen durchgeführt. Obgleich die Züchtung mit einer festen oder flüssigen Kultur durchgeführt werden kann, werden im allgemeinen günstigere Ergebnisse mit flüssiger Kultur erhalten. Vorzugsweise wird die Kulturentwicklung unter aeroben Bedingungen ausgeführt. Obgleich bei flüssiger KuI-tür eine Oberflächenkultur angewendet werden kann, werden jedoch bessere Ergebnisse mittels Schüttelkulturen oder Eintauchkulturen erhalten.

Bei der vorstehend beschriebenen Kulturentwicklung wird eine große· Menge Lipase in dem Medium gebildet. Um die Lipase aus dem Kulturmedium zu sammeln, wird dies im Fall von fester Kultur durch Extraktion mit Wasser oder einer wäßrigen Lösung ,erreicht. Im Fall von flüssiger Kultur wird die Lipase aus der Fermentationsflüssigkeit nach Abtrennung der Zellen gewonnen. Als wäßrige Lösungen können hierbei wäßrige Lösungen, welche Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid od. dgl., enthalten, wäßrige Lösungen, welche Säuren, wie Salzsäure, Citronensäure, Essigsäure od. dgl., enthalten, und außerdem zahlreiche Pufferlösungen verwendet werden.

Die so erhaltene Lipaselösung kann dann konzentriert werden, indem man Reinigungsbehandlungen, wie Ausfällung mit organischen Lösungsmitteln, Aussalzen, Konzentrierung unter vermindertem Druck und Reinigung durch Ionenaustauscher od. dgl., durchführt. Die hierfür- verwendeten organischen Lösungsmittel umfassen wassermischbare organische Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Isopropanol, Aceton od. dgl. Bei Verwendung eines Lösungsmittels ist die Konzentration, bis zu welcher das organische Lösungsmittel zugegeben wird, derartig, daß bei 20 Volumprozent das Enzym gelöst bleibt, jedoch bei 60 Volumprozent die Sammlung eines ausfallenden Anteils möglich ist. Als Aussalzmittel können beliebige Salze, welche sich leicht in Wasser lösen, verwendet werden, wie Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Magnesiumsulfat od. dgl. Die Konzentration, bis zu welcher diese Salze zugegeben werden, ist z. B. bei Ammoniumsulfat so, daß bei 10%iger Sättigung das Enzym in Lösung bleibt, während jedoch bei einer 30%ig^en Sättigung die Sammlung eines ausfallenden Anteils möglich ist. Es kann auch eine Reinigung mit einem Ionenaustauschharz ausgeführt werden.

Das durch diese Maßnahmen gewonnene Lipaseprodukt von hoher Aktivität kann, wenn es nach der Trocknung gelagert wird, selbst bei Raumtemperatur während einer langen Zeitdauer ohne eine Erniedrigung seiner Aktivität eine Lagerung überstehen. Der optimale pH-Wert des Enzyms liegt bei etwa 7, und .es ist in einem pH-Wert-Bereich von 5,0 bis 8,5 äußerst stabil. Selbst bei einem pH-Wert von 3,0 ist es in beträchtlichem Ausmaß säurestabil, wobei nur 45% seiner Aktivität beim Aussetzen während 30 Minuten an eine" Temperatur von 30° C inaktiviert werden. Diese Eigenschaft der Lipase ist besonders vorteilhaft, wenn sie für medizinische Zwecke verwendet werden soll.

Gemäß der Erfindung kann nun wirtschaftlich und sehr vorteilhaft im technischen Maßstab Lipase erzeugt werden, die nicht nur für medizinische Zwecke brauchbar ist, sondern auch für andere Verwendungszwecke, wie die Verwendung als Reinigungsmittel, die Verwendung auf kosmetischem

Sektor, die Verwendung als Nahrungsmittelzusatz od. dgl. geeignet ist. Die Erfindung wird nachstehend an Hand der Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Ein Medium mit einem pH-Wert von 7,2 und einem Gehalt von 2% Stärke, 2% Sojabohnenmehl, 0,1% Ammoniumsulfat, 0,5% Kaliumdiphosphat und 0,1% Magnesiumsulfat wird in Anteilen von jeweils 50 ml in einen Schüttelkolben von 500 ml Fassungsvermögen gegossen, und nach der Sterilisierung während 5 Minuten bei 115° C wird es mit Candida cylindracea ATCC 14 830 inokuliert, worauf die Kultur bei 30° C geschüttelt wird. 72 Stunden später wird die Zelle mittels Zentrifugieren entfernt. Bei allmählicher Zugabe von Ammoniumsulfat zu der überstehenden Flüssigkeit fällt die Lipase in der Flüssigkeit aus, wenn der Sättigungsgrad auf 30% gebracht wird. Die Ausfällung wird mittels Zentrifugieren gesammelt. Bei Trocknung unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur wird Lipase in Pulverform erhalten. Die Ausbeute beträgt etwa 2%> bezogen auf das Volumen des Mediums. Die Aktivität dieser pulverförmigen Lipase, welche mittels Hydrolyse von Fett bestimmt wird, ist nachstehend angegeben:

Vorliegende pulverf örmige Lipase
(ungereinigt)

Pulverförmige Lipase (gereinigt),
hergestellt nach Mann
Forschungslaboratorien

Ausmaß

der Hydrolyse

von Fett

5 mg
5 mg

26% 25%

Der vorstehende Versuch wurde gemäß der folgenden Methode von Nord und anderen durchgeführt. Es wurden 5 ml einer Emulsion von Olivenöl, 3 ml einer Pufferlösung und 1 ml der Enzymlösung bei 37⁰C während 4 Stunden inkubiert und das Ausmaß der Hydrolyse von Fett mittels Titration der Fettsäure mit einer Sodalösung gemessen.

Beispiel 2

Ein Medium mit einem pH-Wert von 7,2 und einem Gehalt von 2% Xylose, 2% Sojabohnenmehl, 0,1 % Ammoniumsulfat, 0,1 % Magnesiumsulfat und 0,5% Kaliumdiphosphat wird in 50-ml-Anteilen in einen Schüttelkolben mit einem Fassungsvermögen von 500 ml gegossen, und nach der Sterilisierung während 5 Minuten bei 115°C wird es mit Candida cylindracea ATCC 14 830 inokuliert, worauf das Schütteln der Kultur bei 30°C durchgeführt wird. 72 Stunden später wird die Zelle mittels Zentrifugieren entfernt. Bei allmählicher Zugabe von Äthanol zu der überstehenden Flüssigkeit, bis die Konzentration

ίο desselben auf 60 Volumprozent gebracht ist, fällt die gesamte Lipase in der Flüssigkeit aus. Diese wird gesammelt und unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet, wobei Lipase in Pulverform erhalten wird. Die Ausbeute an dieser pulver-

i5.förmigen Lipase beträgt etwa 2%, bezogen auf das Volumen des Mediums. Diese pulverförmige Lipase verlor selbst bei Lagerung während mehr als einem Monat bei Raumtemperatur ihre Aktivität nicht, welche, in Angaben der Hvdrolvse von Fett, 25%

20. betrug.

Nachstehend wird an Hand eines Vergleichsversuches gezeigt, daß das Verfahren gemäß der Erfindung zu überlegenen Ergebnissen im Vergleich mit denjenigen führt, welche bei dem bekannten Verfahren unter Anwendung von Penicillium oxalicum Currie und Thorn (IFM 5748), Aspergillus flavus (IFM 6343), Aspergillus luchuensis, Inui (IFM 4281) Pseudomonas fluorescens (IFM 3461) und Serratia marescens (IFM 3736) erhalten werden. (»IFM« gleich »Institute for Fermentation«, Osaka, Japan).

Ein Nährmedium aus 4,0% Maisquellwasser, 2,86% Sojabohnenmehl, 0,5% K₂HPO₄, 0,1% (MLJ₂SO₄ und 0,1% MgSO₄ -7H₂O mit einem Anfangs-pH-Wert von 4,9 wurde in sechs 500-ml-Kolben jeweils in einer Menge von 50 ml eingebracht. Nach Erhitzen auf 120° C während 10 Minuten zur Sterilisierung wurden die Nährmedien mit Candida cylindracea ATCC 14 830, Penicillium oxalicum Currie und Thorn (IFM 5748), Aspergillus flavus Link (IFM 6343), Aspergillus luchuensis Inui (IFM 4281) Pseudomonas fluorescens (IFM 3461) und Serratia marescens (IFM 3736) beimpft. Die Medien wurden bei 25 und 30°C geschüttelt, worauf nach einer bestimmten Zeitdauer die Flüssigkeit durch eine Zentrifugal-Trenneinrichtung abgetrennt wurde. Anschließend wurde die Lipaseaktivität der erhaltenen Flüssigkeiten bestimmt. Es wurden die in der nachstehenden Tabelle aufgeführten Ergebnisse erhalten.

Stamm

Züchtungstemperatur

Lipolytische Aktivität (Einheiten

je Milliliter) gemäß Züchtungszeit

24 Stunden I 48 Stunden 72 Stunden

Pen. oxalicum

Asp. flavus

Asp. luchuensis J

Pseud. fluorescens J

S. marescens J

C. cylindracea ATCC 14 830 j

30
25

0,6
0,3

10,9
0,8

0,1
0,0

3,6
0,2

2,3
12,0

151,5
174,2

0,9
0,8

16,1
7,5

2,4
1,3

3,4
0,2

0,7
1,6

92,0
113,6

0,4
1,0

22,4
25,6

4,1
18,8

0,0
0,2

0,6
0,5

29,3
32,9

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß der gemäß der Erfindung verwendete neue Stamm, Candida cylindracea ATCC 14 830, eine größere Menge an Lipase im Vergleich mit den bekannten Mikroorganismen erzeugt, wobei außerdem eine beträchtlich kürzere Züchtungszeit erforderlich ist.

Verfahren zur Messung der lipolytischen Aktivität

Eine Mischung von 75 ml von 2 %iger Polyvinylalkohollösung (einer Lösung von 1 Teil Polyvinyl- ίο alkohol mit einem Polymerisationsgrad von 1725 ± 25 und einer Verseifungszahl von 88 ± 1 % in 9 Teilen Polyvinylalkohol mit einem Polymerisationsgrad von 1725 ± 25 und einer Verseifungszahl von 28,8 ±2%) und 25 ml Olivenöl wurde auf 5 bis 10°C gekühlt, und diese Mischung wurde bei dieser Temperatur in einen Homogenisator eingebracht, in dem sie 10 Minuten homogenisiert wurde.

Die gut homogenisierte Mischung zeigte eine Art von gleichförmiger Emulsion. 5 ml dieser Emulsion und 4 ml einer 0,lmolaren Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 wurden in ein Reagensrohr gebracht und auf 37° C vorerhitzt. 1 ml der unter (1) beschriebenen Flüssigkeit wurde dann zugegeben und einer Reaktion während genau 20 Minuten unterworfen. Danach wurde die Mischung in einen Erlenmeyer-Kolben mit 10 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Aceton und Alkohol im Verhältnis von 1 : 1 übergeführt. Anschließend wurde die Innenseite des Reagensrohrs mit 10 ml desselben Lösungsmittelgemisches gewaschen, welches danach in den gleichen Kolben gegossen wurde.

Die oben beschriebene Reagenslösung wurde unter Anwendung einer wäßrigen Lösung von n/20-NaOH mit Phenolphthalein als Indikator titriert (Test). Außerdem wurden zur Verwendung in einem Nullversuch IQmI des Lösungsgemisches von Aceton und Alkohol und 1 ml der unter (1) beschriebenen Flüssigkeit in einen Erlenmeyer-Kolben eingebracht und die Flüssigkeit zuvor inaktiviert. Hierzu wurden dann 5 ml der obengenannten Emulsion, 4 ml der obengenannten Pufferlösung und 10 ml des Lösungsmittelgemisches von Aceton und Alkohol gegeben, und die Titrierung wurde in der gleichen Weise wie bei dem vorstehenden Test ausgeführt. Aus der Differenz der Titrationsergebnisse (P) zwischen dem vorstehenden Test und dem Nulltest wurde die Lipaseaktivität als Lipaseeinheit aus der nachstehenden Gleichung (1) bestimmt. Die unter (1) beschriebene Flüssigkeit wurde vor der Bestimmung in geeigneter Weise verdünnt, so daß die Titrationsdifferenz innerhalb des Bereiches von 1,00 bis 2 ml lag.

Lipaseeinheit (w) = P · F ■ D · 2,5

(wobei

P = Titrationsdifferenz,

F = abweichende Konzentration von n/20-NaOH, D = Verdünnungsverhältnis der Flüssigkeit

" In der vorgenannten Lipaseeinheit entspricht 1 u der Menge von Lipase, die 1 μ Mol Fettsäure je Minute freisetzen kann.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Lipase durch Züchten von Mikroorganismen in hierfür üblichen Nährmedien bei ebenfalls üblichen pH-Werten und Temperaturen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Candida cylindracea ATCC 14 830 verwendet.

In Betracht gezogene Druckschriften:
.USA.-Patentschrift Nr. 2 480 090;
O. Hoffmann — Ostenhof, »Enzymologie«, 1954, S. 177.

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