DE3137049C2 - Verfahren zur Gewinnung von Uricase mit Mikroorganismen - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von Uricase mit MikroorganismenInfo
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Description
15
Die Erfindung betrifft das im Patentanspruch angegebene Verfahren.
Uricase (EC 1.733.) ist ein Enzym, das die Oxidation
von Harnsäure zu Allantoin katalysiert und das im Gewebe von höheren Säugetieren wie Menschen nicht
vorhanden ist; es ist dagegen vorhanden in Geweben und «.neziell in inneren Organen von niederen
Säugetieren und in größeren oder kleineren Mengen in einigen Mikroorganismen. Anwenden kann man es bei
der klinischen Diagnose zur Bestimmung von Harnsäure in Serum oder Urin.
Es hat sich nun gezeigt, daß Uricase gebildet werden
kann durch Mikrococcus roseus NRRL B-12 196, einem Mikroorganismus, von dem bisher nicht bekannt war,
daß er dieses Enzym bilden kann und der darüber hinaus, verglichen mit anderen bekannten Mikroorganismen,
den Vorteil besitzt, daß er große Mengen an Uricase in Kulturmedien bildet, die geringe Konzentrationen
an Harnsäure enthalten. Es hat sich darüber hiiihüs überraschenderweise gezeigt, daß das Optimum
der Aktivität der von Micrococcus roseus NRRLB-12 196 gebildeten Uricase im Gegensatz zu der Uricase.
die von anderen Bakterien gebildet worden ist. nahe den pH· Werten von physiologischen Flüssigkeiten liegt, und
das ist insofern ein Vorteil, als es nicht erforderlich ist,
den pH-Wert der biologischen Probe, in der die Harnsäure bestimmt werden soll, zu verändern, sn daß
mögliche Schäden durch chemische Modifikationen der zu untersuchenden Probe vermieden werden. Dieser
Mikroorganismus wurde isoliert von Ackerland in der Nähe von Monterotondo (Rom) und besitzt die
folgenden morphologischen und biologischen Eigenschaften:
Mikroskopische Morphologie
Kugeln mit einem Durchmesser von 1 bis 2.5 μΐη,
unbeweglich und Gram-positiv, bildet durch Aufspalten in mehr als einer Ebene kubische Packungen oder
irreguläre Gruppierungen und erscheint manchmal paarweise oder isoliert.
Makroskopische Morphologie
Kolonien auf Nähr-Agar: aufrecht, glatter Rand, rosa
Farbe, glatte Oberfläche, 1 bis 2 mm Durchmesser.
NährAgar-Schräge: blaßrosa Patina, glatt und glänzend.
Biochemische Eigenschaften
Wachstum in GlucoscNährbrühe:
Wachstum in GlucoscNährbrühe:
50
55
65
leichte Trübung mit Schleimabscheidung, hell-rösa,
pH 6,5.
Wächst bei 100C, aber nicht bei 45°C, Optimum
zwischen 25 und 35° C.
Wachst in Glucose-Brühe, enthaltend 5 und 10%
MaCI, aber nicht in 15% MaCI enthaltender Glucose-Brühe.
Wächst nicht auf Simmons Citrat-Agar.
Aerobe Bildung von Säure aus Zuckern in Purple Broth Base (DIFCG): Xylose, Glycerin, Mannit,
Lactose, Maltose, Sorbose, Ribose, Arobinose, Raffinose, Cellobiose negativ; Glucose, Saccharose,
Fructose leicht verzögerte Säurebildung (7 bis 10 Tage).
Arginin-Hydrolyse: negativ
Stärke-Hydrolyse: positiv
Gelatine-Hydrolyse: negativ
Urease: positiv
H2S: negativ
Catalase: positiv
Nitratase: positiv
Indol: negativ
Acetoin: negativ
Methylrni· negativ
Lecithinase: negativ
Lipasc (Butter und Olivenöl): negativ
Beim Vergleich dieser Daten mit den Beschreibungen in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. VIII.
Aufl. gehört der erfindungsgemäße Mikroorganismus zu der Familie Micrococcaceae. Gattung Micrococcus.
Spezies roseus. Er wurde bei dem Northern Regional Research Center. Peoria. IH.. USA hinterlegt, wo er die
Nummer NRRL B-12 196 erhielt.
Die Züchtung von Mikcrococcus roseus NRRLB-12 196 kann aerob nach irgendeinem üblichen Verfahren
durchgeführt werden, wie in Form von Oberflächenkulturen oder besser in Submers-Kulturen mit Hilfe von
Rührfermentoren. Das Kulturmedium, das fest oder flüssig sein kann, enthält eine Quelle für assimilierbaren
Kohlenstoff, eine Stick toffquelle. eine Phosphorquelle sowie Mineralsalz und Vitamine.
Die Kulturen können bei Temperaturen zwischen 10 und 40 C gehalten werden, wobei der bevorzugte
Bereich bei 25 bis 35° C liegt und 10 bis 48 h, vorzugsweise 20 bis 30 h. bei einem pH-Wert im Bereich
von 6 bis 9, vorzugsweise 7 bis 8 gehalten werden.
Als Kohlenstoffquelle können z. B. Glucose, l.actat, Acetat. Saccharose, Fumarat. Harnsäure. Maisquellwasser
und Glycerin angewandt werden.
Als Stickstoffquelle können z. B. Fleischhydrolysate, Casein- oder Sojabohnen-Hydrolysate. Ammoniumsalze.
Harnstoff. Nitrate und Harnsaure verwendet werden.
Die Extraktionen und möglicherweise Reinigung der Uricase aus der Bakterienpaste wird nach üblichen
Verfahren durchgeführt. Die von dem Micrococcus roseus NRRI. B 12 196 extrahierte Uricase kann vorteilhafterweise
in polymeren Mati ices unter Ausbildung chemischer Bindungen mit der Matrix oder ionischer
Bindung oder durch reine physikalische Immobilisierung immobilisiert werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Es wurde eine Kulturbrühe der folgenden Zusammen^
Setzung hergestellt.
Hefeextrakt
Harnsäure
Harnsäure
15 g/l
2 g/l
Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 7,2 eingestellt und das Medium in Mengen von jeweils 200 ml im
500-rr.I-Kolben verteilt. Nach 30 Minuten langem
Sterilisieren bei 116°C wurden die Kolben mit einer Kultur des Stammes NRRL B-12 196 von einer Schräge,
enthaltend das gleiche Medium zusammen mit 2% Agar, beimpft und 24 h bei 30°C unter Orbitalschütteln mit
220 LJpM inkubiert. Die Zellen wurden dann abzentrifugiert. Von 200 ml Brühe erhielt man 3 g Paste
(Feuchtgewicht). Die so erhaltene Zellpaste wurde in 60 ml Phosphatpuffer (0,1 m; pH 8,5) aufgeschlämmt und
durch eine French-Pressure-Cell-Presse geleitet, bis ein
vollständiges Aufbrechen der Zellen eingetreten war. Die Enzyiiiakiivität wurde in dem so erhaltenen Extrakt
bestimmt. 1 g feuchte Zellen enthielt 100 Uricase-Einheiten.
Bestimmung der Uricase
Die Uricaseaktivuät wurde spektrofotometrisch durch Verfolgung der Harnsäure-Absorption bei
283 nm bestimmt nach dem Verfahren von Mahler et al (J. Biol.Chem, (1955), 216, 625), modifiziert wie später
erläutert. 7 ml einer Lösung enthaltend 20 mg Harnsäure in 100 ml Phosphatpuffer (0,1 m, pH 8,5) wurden in
einen kleinen Kolben von 50 ml gegeben und unter Rühren auf dem Wasserbad bei 300C inkubiert. Die
Reaktion begann mit der Zugabe einer kleinen Menge Enzymextrakt. Unmittelbar nach der Zugabe des
Extraktes sowie 10 min danach wurden 0,5 ml Proben des Reaktionsgemisches entnommen und zu 4 ml 0,1 m
HCI gegeben.
Die Absorption der so erhaltenen Lösung wurde bei 283 nm abgelesen.
Eine Uricase-Einheit ju definiert als die Enzymmenge,
die 1 μΜοΙ Harnsäure pro Minute unter den
angegebenen Versuchsbedingungen abbauen kann.
B e i s ρ i e I 2
Ein Extrakt von Micrococcus roseus NRRL B-12 196-Zellen
wurde wie in Beispiel 1 hergestellt.
Der rohe Extrakt wurde zentrifugiert und in der überstehenden Flüssigkeit die Uricaseaktivität, wie
i" oben beschrieben, bestimmt, wobei als Reaktionsg, misch
Harnsäure in Lösungen von 0,1 m Phosphat bei verschiedenen pH-Werten angewandt wurde. Dabei
wurden gleichzeitig die Aktivitäten eines Enzymextrakts untersucht, der von Kulturen von Bacillus
ι"» fastidiosus unter den gleiche.-i Bedingungen erhalten
wordt-n war wie für Micrococcus roseus angegeben. Die
erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle angegeben. Dabei wurden die Aktivitäten der Extrakte der beiden
Mikroorganismen bei pH 9 als 100 angenommen.
Urieaseaiciiviifit ais Funktion des pH-Wertes in Extrakten
von B. fastidiosus und M. roseus
| pH-Wert | Extrakt von | B. fastidiosus |
| M. roseus | 13,5 | |
| in 6,5 | 71 | 35 |
| 7,0 | 94 | 57 |
| 7,5 | 103 | 85 |
| 8,0 | 106 | 95 |
| 35 8,5 | 103 | 100 |
| 9,0 | 100 | |
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Gewinnung von Uricase durch Züchten von Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, eine Stickstoffquelle, eine Phosphorquelle und Mineralsalze enthält, und Extrak'.ion der Uricase aus der Mikroorganismenpaste, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Micrococcus roseus NRRL B-12 196 einsetzt.
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