DE1949719A1

DE1949719A1 - Verfahren zur Herstellung von Dextranase

Info

Publication number: DE1949719A1
Application number: DE19691949719
Authority: DE
Inventors: Masatoshi Arai; Atsushi Hattori; Keijiro Ishibashi; Tokio Okaniwa
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1968-10-03
Filing date: 1969-10-02
Publication date: 1970-05-06
Also published as: FR2019829A1; US3702805A; DE1949719C2; FR2019829B1; NL6914830A; SE360380B; GB1240620A

Description

46 804

Sankyo Company Limited

1 -6, 3-Chome, Mhonbashi-Hon-cho, Chuo-ku

Tokyo, Japan

Verfahren zur Herstellung von Dextranase

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Dextran-abbauenden Enzymes, der Dextranase, durch Kultivierung von gewissen Mikro-Organismen, deren Bevorzugung von uns überraschenderweise gefunden -wurde.

Dextran, das teilweise durch Dextranase hydrolysiert worden war, ist zur Herstellung von Blutserum-Ersatzstoffen verwendet worden. In letzter Zeit hat Dextranase verschiedene Anwendungsgebiete gefunden, auf dem Gebiet der Zahn-Hygiene, (z. B. als enzymatisch^ Zubereitung zur Verhinderung von Zahn-Karies oder Zahnsteinablagerung).

Es ist bekannt, daß Dextranase durch Kultivierung von Mikroorganismen gewonnen werden kann, die zur Gattung Penicillium, Aspergillus, Verticillium und Spicaria sowie Celluvibrio gehören (vgl. z. B. Acta. Chem. Scand. 3, 1405 (1949); US-Patent 2 709 150; J. Bact. 64, 513 (1952)); Acta. Ohem. Scand. 2, 803 (1948); und Canadian Journal of Microbiology 3, 239 (1957).

Nach umfangreichen Forschungen wurde nunmehr Überraschenderwelse gefunden, daß gewisse Mikrο-Organismen, deren Dextranasebildende Aktivität bisher nicht bekannt war oder vorgeschlagen worden war, sehr wirksam zur Herstellung von Dextranase in großem Maßstab auf biologischem Wege sind.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Herstellung von.Dextranase, das gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Dextranaseerzeugenden Mikro-Organismus der Gattung Chaetomium, Humicolä, Sporotrichum, Anixiella, Macrosporium, Streptomyces, Gibberella, Gloeosporium oder Glomerella in einem Nährmedium !kultiviert und aus dem kultivierten Uährmedium die darin angereicherte Dextranase abtrennt und gegebenenfalls reinigt. Die Abtrennung der Dextranase aus der Kulturbrtihe kann in an sich bekannter Weise erfolgen.

Geeignete Mikrο-Organismen, die als Dextranase-erzeugende Stämme für das Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, sind bekannte Stämme, wie sie in der nachfolgenden Aufstellung beispielsweise genannt werden. In dieser Aufstellung sind in der rechten Spalte die Literatursteilen angegeben, in denen die mykologischen Merkmale der betreffenden Mikr ο-Organismen beschrieben sind. Die Code-Hummern, die angegeben sind, sind solche der Anmelderin zur genauen Klassifizierung.

Chaetomium

C. spirale £-216-3

C. uracile F-212-8

("!Fermentation Research Institute of Japan, Deposit No. 334

C. aubspirale F-216-4 C. bostrychodes ff-203-5

Journal of General and Applied Microbiology 6, 223-251 (i960)

Streptomyces

S. olnnamonenais Act 4-2

(Fermentation Research

Institute of Japan, ..-.,. Deposit Fo. 339

S. flavovirena Act 8-5 . S. grlseocarneus Act 12-1 S. griseolua Act 12-3

Bergey·s Manual of Determinative Bacteriology 7th Ed, 771, 763, 775 and 766

aöl a /1b ο 4

Gibberella

G-13

CFerment ation Research Institute of Japan, Deposit No. 309

G. saubinetii P-I4-10 Agricultural Experimental Reports, Agricultural Experiment Station of Agricultural and Commercial Department of Japan, 12, 1, 110 (1898)

Hokkaido-Nokaiho (Japan) 12, 133, 1 (1912)

Gloeosporium

G. kaki G-12

(Fermentation Research Institute of Japan, Deposit No. 308;

G. laeticolor G-11

G. olivarum G-9

"Pathological and Therapeutical Studies on important parasitic diseases of persimmon" by S. Ikata, 282 (1942), Iokendo, Japan

Annals of the Phytopathological Society of Japan, 13, 3-4, 57 (1949).

ibid. 2, 6, 550 (1933)

Glomerella

G. fluetigena G-10

[fermentation Research Institute of Japan, Deposit No. 307;

G. lagenaria G-8

Annals of the Phytopathological Society of Japan, 16, 137 (1952)

Humicοla

H. grisea Έ-56-4

("Fermentation Research Institute of Japan, Deposit No. 336) "A manual of soil fungi" by Gilman, 325-326 (1957)

Sporotrichum

S. asteroides F-60-9

(.Fermentat ion Research Institute of Japan, Deposit No. 337) "Pathogenic microbiology (part Bacertia), 956-957 (1966), Igakushoin, Japan

UU ab la/ Ibb4

Anixiella

A. reticulata P-200-2

(Fermentation Research Institute of Japan, Deposit ITo.· 535)

Transactions of the micrological Society of Japan, 6, 3, 85
(1965)

Macrosporium

M. batatieola P-57-1-

(fermentation Research Institute of Japan, Deposit No. 338;

"Nogyo oyobi Engei" (Agriculture and
Horiculture). 22, 5 p. 239 (1947)

I¹Ur den Fachmann ist es offensichtlich, daß auch Mutanten und Varianten der oben beispielsweise genannten Stämme für das■-Verfahren der Erfindung brauchbar sind.

Bei der Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung in der Praxis wird ein geeigneter Dextranase-erzeugender Stamm, wie sie oben genannt wurden, einem flüssigen oder festen Kulturmedium eingeimpft, das verschiedene Nährstoffe enthält, die üblicherweise für ein kün-st/liches oder ein natürliches Medium verwendet werden. Die Kultivierung wird dann in der Regel durch Oberflächenkultivierung oder submerse Kultur durchgeführt. Geeignete Nährmedien sind unter anderem beispielsweise Weizenkleie, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Pepton, Stärke, Glucose, Sucrose, Ammoniumsulfat, Harnstoff und verschiedene andere anorganische Salze. Eine Zufügung von 1 - 2 % Dextran zum Kulturmedium ist besonders vorteilhaft, da eine solche Zugabe in der Regel die Dextranase-Produktivität bis auf das 10-fache oder noch mehr erhöht, und zwar im Vergleich mit der Kultivierung unter Bedingungen, in denen kein Dextran vorhanden ist. Eine geeignete Züchtungs-Temperatur liegt bei etwa 30° C. Geeignete pH-Werte liegen im Bereich von etwa 5.5 bis 7.0. Die Kultivierungszeit schwankt in Abhängig-

keit von den sonstigen Kultivierungs-Bedingungen. In der Regel liegt sie jedoch bei etwa 3 bis 5 !Pagen, in welcher Zeit eine maximale Potenz der gewünschten Dextranase erhalten wird. .

Die Isolierung und gegebenenfalls Reinigung des gewünschten Enzymes (Dextranase) aus der flüssigen Kulturbrühe oder einem Koji-Extrakt kann in der üblichen Weise durchgeführt werden, die zur Gewinnung von Enzymen aus lermentationsbrühen, die dieses enthalten, bekannt ist. Beispielsweise kann die durch die Kultivierung erhaltene Kulturbrühe oder der wässrige Koji-Extrakt einer der folgenden Behandlungen unterworfen werden: Konzentration unter vermindertem Druck, Aussalzen mit !Natriumsulfat oder Natriumchlorid, fraktionierte Ausfällung mit Methanol, Äthanol, Aceton oder einem ähnlichen Lösungsmittel, Adsorptions-Elutions-Zyklen unter Verwendung eines geeigneten Adsorptions-Materials, Ausfällung unter Verwendung eines Protein-fallenden Mittels, Ausfällung beim isoelektrischen Punkt, Abtrennung von Verunreinigungen mit einem Schwermetall, elektrische Dialyse usw. Diese Behandlungsmethoden können alleine oder in Kombination angewandt werden, wobei eine Dextranase der gewünschten Reinheit erhalten werden kann.

Das so erhaltene Dextran-abbauende Enzym (Dextranase) kann Dextran intensiv zersetzen mit dem Ergebnis einer schnellen Verflüssigung. Der optimal wirksame pH-Wert liegt bei 4 - 6 und die optimale Temperatur bei 55 - 60° 0 · Der pH-Wert bzw. die !Temperatur, bei denen Dextranase stabil ist, liegen bei 4-9 bzw. 55° 0 oder darunter.

Die enzymatische Aktivität .yon Dextranase kann wie folgt bestimmt werden ι 5 ml einer M/^Q. Acetat^

UCT3Ö Γ3Τ Töbi

(pH 5.1) mit 4.95 # Dextran ("Dextran 2000" , hergestellt und verkauft von Pharmacia ltd., Schweden) wird mit 0.5 ml einer geeigneten verdünnten Enzym-lösung versetzt, und die ■Versuchsmischung wird bei 40° C aufbewahrt. Es wird die Zeit gemessen, die erforderlich ist, um die Anfangsviskosität des Dextrans auf die Hälfte herabzusetzen (diese wird nachfolgend als "Halbwerts-Zerfallszeit" bezeichnet). Der gemessene Wert ist proportional der enzymatisehen Aktivität.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

100 ml eines flüssigen Kulturmediums (auf pH-6.0 eingestellt), welches 1 i» Kartoffelstärke, 0.5 # Maisquellwasser, 0.5 fi Pepton und 0.5 fi Sojabohnenmehl enthält, wird ohne Dextran oder zusammen mit 1 $ Dextran in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben, sterilisiert, und dann mit den verschiedenen nachfolgend genannten Stämmen geimpft.Die Kultivierung erfolgt durch Schüttelkultur bei 30° C 4 Tage lang. Die enzymatisch« Dextranase-Aktivität der so erhaltenen Kulturbrtihe wird, bestimmt. Die Versuchsergebnisse der einzelnen Versuchern der nachfolgenden Tabelle 1 zusammen-gesteilt.

Tabelle 1

Benutzter Stamm Halbwerts-Zerfallszeit

Ohne Zugabe von Mit Zugabe von Dex- ; , Dextran (keine trän (4-fache Ver^

Ohaetomium spirale P-21 b-3 bO Min.

-» * gracile I-2t2^8 60Jiin. 13 Min.

⁹¹ subspirale P^-216-4 - 6 iStd.

■-■ bostrychodes P^2O3-5 - 6 Std.

(Anfängliche Viskosität der Versuohsmischung 150 Sek.)

(W Kontrolle ., _v: _ , 10 S.elg,) ,,

Beispiel 2

festes Kulturmedium wird dadurch !hergestellt, daß Weizenkleie mit der halben Menge Sojabohnenmehl ohne oder zusammen mit 2 # Dextran vermischt werden und dazu eine gleiche Menge Wasser gegeben wird, wobei eine pastige Masse erhalten wird. Uach Sterilisation wird dieses feste Kulturmedium mit den verschiedenen nachfolgend genannten Stämmen geimpft. Die Kultivierung wird 5 Tage lang nach der Eoji-Kultivierungs-Methode bei 30° C durchgeführt. Die Kultivierungs masse wird mit Wasser in einer Menge von 10 oder 100 Teilen der erwähnten festen Masse extrahiert. Der wässrige Extrakt wird zur Bestimmung der enzymatisehen Aktivität untersucht. Die Versuchsergebnisse sind in der Tabelle 2 zusammengestellt.

Tabelle 2

Benutzter Stamm Halbwerts-Zerfallszeit

Ohne Dextran Mit Dextran (Extraktion mit (Extraktion mit

10 χ Wasser) 100 χ Wasser)

Chaetomium spirale F-216-3 ¹¹ gracile P-212-8 ¹¹ subspirale P-216-4 " bostrychodes :F-2O3-5

(Anfängliche Viskosität der Yersuchsmischung 150 Sek.) (Wasser als Kontrolle 10 Sek.)

Beispiel 3

Die unter Verwendung von Dextran erhaltene KuMivierungsmasse von Beispiel 2 wird mit Wasser in einer Menge von 3 Volumteilen pro Yolumteil der Masse extrahiert. Zu der erhaltenen EnzymlöBung wird Aceton in einer Menge von 3 Volum-

30	Min.	13	Min.
30	Min.	16	Min.
	—-	6	Std.
		6	Std.

teilen pro Teil der Enzymlösung gegeben. Der erhaltene Nieder schlag wird durch Filtration abgetrennt und dann unter vermindertem Druck getrocknet. Eine Enzymprobe wird so als weißes Pulver erhalten. Die Ausbeute beträgt 3 - 5 1» berechnet auf das Gesamtgewicht der eingesetzten festen Wahrmedium-Komponenten. Die enzymatisch^ Aktivität dieser Probe wird wie folgt festgestellt.

Tabelle 3

Benutzter Stamm

Chaetomium spirale F-216-3 ⁿ gracile F-212-8

Halbwerts-Zerfallezeit

der 0.05 # Enzym-Probenlösung

25 Min. 20 Min,

(Anfängliche Viskosität der Versuchern!sehung 150 Sek.) (Wasser als Eontrolle 10 Sek*)

Beispiel 4

100 ml eines flüssigen Kulturmediums (auf pH 6.0 eingestellt),' welches 1 i° Kartoffelstärke, 0.5 $> Maisquellwasser, 0.5 $ Pepton und 0.5 1° Söjabohnenmehl enthält, werden ohne Zusatz von Dextran oder mit 1 Ϊ* Dextran in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben, sterilisiert und dann mit den nachfolgend genannten verschiedenen Stämmen gei-mpft. Die Kultivierung wird 4 Tage lang als Schtittellcultur bei 30° C durchgeführt. Die ehzymatlsche Dextranase-Aktivität der so erhaltenen Kulturbrühe wird gemessen. Die Versuchsergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 4 zusammengestellt.

U U b ö I y/ I bb

4	Mi	Std.	M	31	Min
10	Std.	V	100	Min
	8	Std
10	Std

!Tabelle 4

Benutzter Stamm Halbwerts-Zerfallszeit

Ohne Zugabe von Mit Dextran Dextran (keine (keine Ter-

' Verdünnung) dünnung)

Streptomyces cinnamonensis Acf 4-2 ^M flavovirens Act 8-5 ¹¹ griseocarneus Act 12-1 " griseolus Act 12-3

(Anfängliche Viskosität der Yersuchsmischung 50 Sek.) (Wasser als Eontrolle . 10 Sek.)

Beispiel 5

Ein festes Kulturmedium wird dadurch hergestellt, daß Weizenkleie mit der halben Menge Sojabohnenmehl vermischt wird, wobei Dextran nicht zugegeben oder in einer Menge von 2 $> zugegeben wird, und dann eine gleiche Menge Wasser mit dem Gemisch vermischt wird, wobei eine pastige Masse erhalten wird. Nach Sterilisation wird das feste Kulturmedium mit den verschiedenen nachfolgend genannten Stämmen geimpft. Die Kultivierung wird nach der Koji-Kultivationsmethode 5 Sage lang bei 30° C durchgeführt. Die Kultivierungsmasse wird mit Wasser in einer Menge von 10 Teilen pro feil der Masse extrahiert. Der wässrige Extrakt wird auf seine enzymatische Aktivität untersucht. Die 7erSuchsergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengestellt.

- 10 -

υ u a « ι a / ι fa οπ»

- ίο -

Tabelle 5 - '

Benutzter Stamm Halbwerts-Zerfallszeit

• Ohne Dextran Mit Dextran

(Extraktion mit (Extraktion mit - - ' 10 χ Wasser) 10 χ Wasser)

Streptomyces cinnamonensis Act 4-2 15 Std. 150 Min.

" flavovirens Act 8-5 - 8 Std.

(Anfängliche Viskosität der Versuchsmischung 50 Sek.)

(Wasser als Zontrolle 10 Sek.)

Beispiel 6

Die in Gegenwart von Dextran gemäß Beispiel 4 erhaltene Kulturbrühe wird mit Aceton in einer Menge von 3 Volumteilen pro Teil der erwähnten Brühe versetzt. Der .erhaltene Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt und dann unter vermindertem Druck getrocknet. Es wird so eine Enzyme-Probe als weißes Pulver erhalten. Die Ausbeute beträgt 3-5$ berechnet auf das Gewicht der KuI tür brühe. Die enzymatisch^ Aktivität dieser Probe wird bestimmt, wobei das folgende Ergebnis erhaltenwird.

Tabelle 6

Benutzter Stamm Halbwerts-Zegfallezeit

einer 0.5:f> Enssym-

- "' - "^:'.- - - Probenlösung

Streptomyoee oinnamonenBia Act 4-2 15 Min. ^i .'■■■■■ flmvovirens Aot 8-5 45 Min.

(Anfängliche Viskosität der VerBUchsmischung 50 Sek.) (Wasser ala Kontrolle 10 Sek.)

-■11 -

Beispiel 7 ·

10Ö ml eines flüssigen Kulturmediums (auf pH 6.0 eingestellt), welches 1 % Kartoffelstärke, 0.5 f<> Maisquellwasser, 0.5 # Pepton und 0.5 # Sojabohnenmehl enthält, wird ohne Zugabe von Dextran oder mit 1 # Dextran in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben, sterilisiert und dann mit den verschiedenen nachfolgend genannten Stämmen geimpft. Die Kultivierung wird 4 Tage lang als Schüttelkultur bei 30° C durchgeführt. Die enzymatisch^ Dextranase-lktivität der Kulturbrühe wird bestimmt. Die jeweils erhaltenen Versuchsergebnisse sind in der Tabelle zusammengestellt·

Tabelle 7

Benutzter Stamm · HalbwertB-Zerfallszeit

Ohne Dextran Mit Dextran (keine Ver- (4-fache Ver-

- dünnung) dünnung)

Humiöola grisea F-56-4 4 Std.

Sporotrichum asteroides ]?-60-9 90 Min.

Anixiella reticulata F-200-2 Macrosporium bataticola F-57-1

(Anfängliche Viskosität der Versuchsmischung (Wasser als Kontrolle

Beispiel 8

Ein festes Kulturmedium wird dadurch hergestellt, daß Weizenkleie mit seinerhalben Menge Sojabohnenmehl vermischt wird, einmal ohne Zugabe von Dextran und das andere Mal mit 2 $> Dextran. Dann wird zu diesem Gemisch die gleiche Menge Wasser gegeben, wobei eine pastige Masse erhalten wird. Fach Sterilisation wird dieses feste Kulturmedium mit den verschiedenen nachfolgend genannten Stämmen geimpft. Die Kultivierung wird

-Ί2 -

100	Min.
20	Min.
6	Std.
6	Std.
150	Sek.)
10	Sek.)

UUaö I b/ 1b b 4

.'■■'■- 12 -

nach der Koji-Kultivierungs-Methode 5 Tage lang bei 30° C durchgeführt. Die Kultivierungsmasse wird mit Wasser in einer Menge von 10 bzw. 100 Teilen pro Teil der Masse extrahiert. Der wässrige Extrakt wird auf seine enzymatisch« Aktivität untersucht. Die Versuchsergebnisse sind in der Tabelle 8 zusammengestellt.

Tabelle 8

Benutzter Stamm

Hälbwerts-Zerfallszeit
Ohne Dextran Mit Dextran (Extraktion mit (Extraktion 10 χ Wasser) mit 100 χ
- Wasser)

Humicola grisea F-56-4 Sporotrichum asterorides P-60-9 Anixiella reticulata ί·-200-2 Macrosporium bataticola P-57-1

(Anfängliche Viskosität der Versuchsmischung (Wasser als Zontrolle

30 Min.	150	Min.
1-0 Min.	55	Min.
'-.■-■■	6	Std.
"■'—■'	6	Std.
bsmischung	150	Sek.)
	10	Sek.)

Beispiel 9

Die in Gegenwart von Dextran erhaltene Kultivierungsmasse von Beispiel 8 wird mit Wasser in einer Menge von 3 Volumteilen pro Teil Masse extrahiert. Zu der erhaltenen Ehzymlösung wird Aceton in einer Menge von 3 Volumteilen pro Teil der Enzym-lösung gegeben. Der erhaltene Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt und dann unter vermindertem Druck getrocknet. Es wird so als weißes Pulver eine Enzym-Probe erhalten. Die Ausbeute beträgt 3 - 5 # berechnet auf das Gesamtgewicht der anfänglichen festen Nährmedium-Komponenten. Die enzymatische Aktivität wird untersucht, wobei das folgende Ergebnis erhalten wird.

ü ü a 8 1 a/Ίbb4

ItI II« t

Il 1 t t I |(i ti ;

- 13 -

Tabelle 9

Benutzter Stamm Halbwerts-Zerfallezeit

einer 0,15$ Enzym-Probenlösung

Humicola grisea :F-56-4 90 Min,

Sporotrichum asteroides IM5O-9 30-Min»

(Anfängliche Viskosität der Versuchsmischung 150 Sek.) (Wasser als Eontrolle 10 Sek.)

Beispiel 10

100 ml eines flüssigen EaItürmediums (auf pH 6,0 eingestellt), welches 1 # Eartoffeistärke, 0.5 i° Maisquellwasser, 0.5 # Pepton und 0.5 1° So^'abohnenmehl enthält, wird zusammen mit 1 % Dextran in einen 500 ml Erlenmeyer-Eolben gegeben, sterilisiert und dann mit den verschiedenen nachfolgend genannten Stämmen geimpft. Die Eultivierung wird 4 Sage lang als Schüttelkultur bei 30° 0 durchgeführt. Die enzymatische Dextrana.se-Aktivität der so erhaltenen Eulturbrühe wird bestimmt. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle 10 zusammengestellt.

!Tabelle 10 . Benutzter Stamm Halbwerts-Zerfallazeit

Gibberella fujikuroi G-13 10 Min.

(Jibberella saubinetii F-14-10 2 Std.

(Jloeosporium kaki GM2 4 Std.

öloeosporium laeticplor Q-11 Q Std.

GKLoeosporium oliTarum 0-9^ 10 Std,

ölomereall* iructigena (J-IO 10 Std.

Glomerellt. lagenaria Ö-8 24 Std.

(Anfängliche Viekoiität der Ttreuchsmiechung 150 Sek.) (Wasser als Kontrolle 10 Sek.)

■-■.* "./■■■ .'■■■■■" ■ -■ - ■;'. .■'■■, - 14 -

uliy b ι a / \ et>4

BeiBpiel 11

Ein festes Kulturmedium wird dadurch, hergestellt, daß Weizenkleie mit der halben Menge So^abohnenmehl zusammen mit 2 % Dextran vermischt wird. Dann wird die gleiche Menge Wasser zu diesem Gemisch gegeben, wobei eine pastige Hasse gebildet wird. Nach Sterilisation wird das feste Kulturmedium mit den'nachfolgend genannten,Stämmen geimpft. Die Kultivierung wird 5 lage lang nach der Kooi-Kultivierungsmethode bei 30⁰O durchgeführt. Die Eultivienuigsmasse wird mit Wasser in einer Menge von 10 Seilen pro Teil Masse extrahiert. Der wässrige Extrakt wird auf seine enzymatisch^ Aktivität untersucht. Die Yersuchsergelmisse sind in tabelle 11 zusammengestellt.

tabelle 11 Benutzter Stamm Halbwerts-Zerfallszeit

Gibberella fu-jikuroi G-13 5 Hin.

Sibberella saubinetii F-14-10 2 Std.

Gloeosporium kaki G-12 3 Std.

Gloeosporium laeticolor G~11 5 Std.

Gloeosporium olivarum G-9 6 Std.

Glomerella fructigena G-10 6 Std.

Glomerella lagenftria G-8 12 Std.

(Anfängliche Yiskosität der Versuchsmischung 150 Sek.) (Wasser als Kontrolle

Btiapjel " ~

Sie in Gegenwart von Dextran gemäß Beispiel 11 erhaltene Sultivierungsmasee wird mit Wasser in einer Menge von 3 yolumteilen pro Ttil Masse extrahiert. Zu der erhaltenen EnjiyjBlößung wird Aceton in einer Meng© von 3 Volumteilt π pro Teil dtr Enzymlösung gegeben. Dtr erhaltene Niederwird durch filtration abgetrennt, und dann unter

6 64

verminderte» Druck getrocknet. Es wird so eine EnzymprcTbe in Form eines weißen Pulvers erhalten. Die Ausbeute beträgt 3 bis 5 % berechnet auf das Gesamtgewicht der anfängl xch eingesetzten festen Nähmedium-Komponenten . Die enzymatische Aktivität der Probe wird mit dem folgenden Ergebnis bestimmt.

gabeile 12

Benutzter Stamm Enzymprobe Halbiert s-Zer-

Konzentration fallszeit

Gibberella fuäikuroi G-13 0.15 % 30 Min.

Gloeosporiiäa kaki G~12 1.0 % 90 Min.

Glomerella fructigena G-IO 1.0% 3 Std.

(Anfängliche Viskosität der Versuchsmischung I50 Sek.)

(Wasser als Eontrolle 10 Sek.)

Patentansprüche:

9/ 16b 4

Claims

46 804--Dr.T Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Dextranase, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Dextranase erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Chaetomium, Humicola, Sporotrichum, Anixiella, Macrosporium, Streptomyces, Gibberella, Gloeosporium oder Glomerella in einem Nährmedium kultiviert und aus dem kultivierten Nährmedium die darin angereicherte Dextranase abtrennt und gegebenenfalls reinigt. ■

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

der Dextranase-erzeugende Mikroorganismus Chaetomium spirale, Chaetomium gracile, Chaetomium subspirale, Chaetomium bostrychodes, Streptomyces ci^namonensis, Streptomyces flaVovirens, Streptomyces griseocarneus, Streptomyces griseolus, Gibberella fujikuroi, Gibberella saubinetii, Gloeosporrum kaki, Gloeosporium laeticolor, Gloeosporium olivarum, Glomerella fructigena,3omerella lagenaria, . Humicola grisea, Sporotrichum asteroides, Anixiella reticulata oder Macrosporium bataticola ist.

$. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß d-er Dextranase—erzeugendes Mikroorganismus Chaetomium spirale, Chaetomium gracile, Sporotrichum asteroides oder Gibberella fujikuroi ist. .

TTU a IM 9 / \ 6 b A

BAD ORIGINAL