DE2051945C3

DE2051945C3 - Verfahren zur Herstellung eines Enzyms mit etwa gleich großer Glutaminase- und Asparaginase-Aktivität

Info

Publication number: DE2051945C3
Application number: DE2051945A
Authority: DE
Inventors: Mitsuharu Fujii; Takashi Iwaasa; Tamotsu Nagareyama Yokotsuka
Original assignee: Kikkoman Shoyu KK
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1970-06-13
Filing date: 1970-10-22
Publication date: 1974-11-14
Also published as: DE2051945A1; US3721606A; DE2051945B2

Description

Es ist bekannt, daß Glutaminase in der Nahrungsmittelindustrie eine wichtige Rolle spielt, insbesondere bei der Herstellung von Würzen durch enzymatischen as Abbau von Proteinmaterialien. Außerdem hat Glutaminase auf biochemischem und medizinischem Gebiet große Beachtung gefunden.

Auf der anderen Seite fand Asparaginase auf dem Gebiet der Medizin und Biochemie auf Grund seiner Wirkung auf bestimmte Tumoren große Beachtung und ist als Arzneimittel von großem Wert.

Es ist bekannt, daß sowohl Glutaminase als auch Asparaginase in tierischen und pflanzlichen Geweben und Mikroorganismen weit verbreitet sind. Hochgereinigte Enzympräparationen wurden eingehend untersucht.

In letzter Zeit wurden Mikroorganismen als mögliche Enzymquellen für eine industrielle Herstellung dieser Enzyme eingehend geprüft. Es konnte z. B. festgestellt werden, daß Asparaginase in vielen Stämmen der Gattungen Aerobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Bacillus, Erwinia, Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Serratia, Aspergillus und Penicillium vorhanden ist (vergleiche z. B. R. E. Peterson und A. C i e g 1 e r, »Applied Microbiology«, 17 [1969] S. 929). Ebenso wurde festgestellt, daß Glutaminase in Mikroorganismen der Gattungen Escherichia, Proteus, Clostridium, Streptococcus und Staphylococcus sowie in Hefen vorhanden ist (vergleiche z. B. »Handbook of Enzymes«, S. 532, Herausgeber S. A k a b ο r i, Verlag Asakura Shoten).

Bisher wurden Asparaginase- bzw. Glutaminase-Präparate aus vielen Mikroorganismen isoliert und gereinigt, die jeweils beide enzymatische Aktivitäten aufweisen. Jedoch ist bei diesen üblicherweise die eine Enzymaktivität hoch, während die andere niedrig ist.

Im Verlaufe von Untersuchungen an auf mikroDiologischem Wege hergestellter Glutaminase und Asparaginase wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß der aus Bodenproben isolierte Stamm Pseudomonas fluorescens 30-21 Glutaniinase-Aktivität und eine fast genau so hohe Asparaginase-Aktivität aufweist. Wenn die durch diesen Stamm erzeugten Enzyme weiter gereinigt wurden, so verhielten sich beide Enzymaktivitäten bei jedem Reinigungsschritt vollkommen gleich. Es wurde festgestellt, daß das Enzymprotein, das sich am Schluß bei der Disc-Elektrophorese einheitlich verhielt, Glutaminase-Aktivitat und eine fast genau so hohe Asparaginase-Aktivität aufweist.

Außerdem war der Bereich des pH-Optimums beider Enzymaktivitäten des gereinigten Enzymproteins vollkommen gleich. Im Verhalten gegen verschiedene Inhibitoren und Anionen zeigten sich keine Unterschiede. Dies läßt darauf schließen ,daßan einziges Enzymprotein die beiden enzymatischen Wirkuneen aufweist Das erfindungsgemäß erhaltene Enzym mit Glutaminase-Aktivität und etwa gleich großer Asparaginase-Aktivität wird von den Erfindern mit Glutaminase GA bezeichnet.

Der Glutaminase GA erzeugende Mikroorganismus weist folgende bakteriologischen Eigenschaften auf:

1. Züchtungsmerkmale

Nähragar: reichliches Wachstum, ringförmige Kolonienbildung, glatte Oberfläche, vollständiger Umfang, flache oder halbkonvexe Wölbung, amorphe und durchscheinende Kolonien, gelblichgrauer Farbton, glänzend, keine Ausscheidung von Pigment ins Nährmedium.
Agar-Schrägröhrchen: gutes Wachstum, ausgebreitete Form der Kolonien. Die anderen Merkmale sind die gleichen wie die beim Nähragar beschriebenen.

Nährbrühe: gutes Wachstum, membranartige Oberfläche, stark trübe, zähflüssige Sedimentierung, keine Gasentwicklung und keine Pigmentierung des Nährmediums.
Nähragar-Stab-Kultur: fadenförmige Kolonien, bestes Wachstum an der Spitze.
Glucose-Ammonium-Nährmedium: Wachstum unter Bildung einer Säure.
p-Hydroxybenzoat-Nährmedium: gutes Wachstum, Bildung von grünlichem, fluoreszierendem Pigment.

Glucose-Nitrat-Nährmedium: Wachstum.
Succinat-Nitrat-Nährmedium: Wachstum.
Glutamat-Nitrat-Nährmedium: Wachstum.
Glutamat-Nährmedium: Wachstum, Bildung von grünlichem, fluoreszierendem Pigment.
Gluconat-Nährmedium: Wachstum, Bildung von fluoreszierendem Pigment und Fluo

res?e«/

Äthe όί-Vihrmedium: Wachstum, keine Bildung

t. Morphologische Eigenschaften

Größe und Form: einzeln auftretende kurze Stäbchen der Größe 0,7 χ (1,7 — 2) μ mit abgerundeten Enden.

Flagellum (Beweglichkeit): bewegliches polares Flagellum.
Sporenbildung: nicht beobachtet.

3. Physiologische Eigenschaften

Wachstumstemperatur: Wachstum im Temperaturbereich von 10 bis 37° C, optimales Wachstum bei Temperaturen von 25 bis 37⁰C, kein Wachstum bei 39,5⁰C.
Gram-Anfärbung: negativ.
Nitrat-Reduktion: positiv.
Lackmusmilch (Koagulation der Milch): keine Koagulation, alkalisch.
Gelatine-Stab: mäßige Verflüssigung.

3 4

. α ι D-U ^von,^{Stärke: keine} Hydrolyse. Zur Gewinnung des erfindungsgemäß hergestellten Jndol-Bildung: keine. _{En2yms können al}|_gemeine Enzymextraktionsverfahbchwefelwasserstoff-Bildung: keine. ren angewendet werden. Zum Beispiel werden die yoges-Proskauer-Test: negativ. Zellen zuerst durch mechanisches Mahlen, Schall oder Methylrot-Test: negativ. ₅ Ultraschall, Hochdruckhomogenisatoren oder Ver-Ammoniak-BildungausPepton:pos^:liv. mahlen mit Quarzsand, zerstört oder durch Zellen Katalase-Bildung: positiv. auflösend wirkende Enzyme, wie Lysozym, aufgelöst. Verhalten bei Anwesenheit von Natriumchlorid: Eine andere Möglichkeit besieht in der Extraktion des kein Wachstum bei 7 % Natriumchlorid. Enzyms aus den Zellen durch Behandlung mit Äthylen-Verwertung von Kohlenstoffquellen: Glycerin, io diamintetraessigsäure oder durch osmotischen Schock, Xylose, Glucose, Fructose, Galactose, Mannose, um eine rohe Lösung des Enzyms zu erhalten, die dann Mannit und Dextrin können verwertet werden. durch Zusatz von Ammoniumsulfat oder durch Alko-Aerobe Bildung von Säure aus Glucose beim hol der fraktionierten Fällung unterworfen wird, wo-Hugh-Leifson-Test. Keine Gasbildung und keine nach der Niederschlag gewonnen wird. Man dialysiert Saurebildung aus Lactose und Saccharose. 15 dann gegen vollentsalztes Wasser und erhält nach dem

. Gefriertrocknen rohe Glutaminase CA.

Nach einer Untersuchung der bakteriologischen Das so erhaltene Rohprodukt wird der Adsorption

Eigenschaften des Mikroorganismus gemäß Micro- und Elution unter Verwendung verschiedener Ionen-

biological Method (1957) und der Einteilungsgesichts- austauscher, z. B. Triäthylaminoäthyl-Cellulose, Di-

punkte gemäß Bergey's Manual of Determinative 20 äthyl-2-hydroxypropyI-ammoniumäthyldextran, der

Bacteriology, 7. Auflage (1957), wurde dieser Stamm Gelfiltration unter Verwendung von vernetzten Dex-

als Pseudomonas fluorescens identifiziert und von den tränen und Polyacrylamid-Gel, der Adsorption und

Erfindern als Pseudomonas fluorescens 30-21 bezeich- Elution unter Verwendung von Hydroxylapatit und

net. Dieser Stamm scheint neu zu sein und weist die der Elektrophorese unter Verwendung von Polyacryl-

bisher unbekannte Eigenschaft auf, ein neues Enzym 25 amid-Gel in einer geeigneten Zusammensetzung unter-

zu erzeugen, das Glutaminase-Aktivität und eine fast worfen, um ein hochgereinigtes Enzymprodukt zu er-

ebenso hohe Asparaginase-Aktivität aufweist. Der halten.

Stamm wurde bei der A. T. C. C. unter der Nr. 21 541 Beispielsweise wird zur Reinigung eines durch

hinterlegt. Fraktionierung mit Ammoniumsulfat oder Alkohol

Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein 30 erhaltenen Rohproduktes von Glutaminase GA eine

Verfahren zur Herstellung eines Enzyms mit etwa wäßrige Lösung dieser Substanz hergestellt und die

gleich großer Glutaminase- und Asparaginase-Akli- Lösung zuerst an Triäthylaminoäthyl-Cellulose oder

vitat durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus Diäthyl - 2 - hydroxypropyl - ammoniumäthyl - dextran

der Gattung Pseudomonas in einem Nährmedium bei Chromatographien. Wenn Triäthylaminoäthyl-Cellu-

hierfur üblichen Temperaturen und pH-Werten, das 35 lose verwendet wird, wird die rohe Enzymlösung zur

dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikro- Adsorption von Glutaminase GA auf eine mit Tri-

organismus Pseudomonas fluorescens ATCC 21 541 äthylaminoäthyl-Cellulose beschickte Säule aufge-

einsetzt und daß man das Enzym aus der Gärmaische tragen, die mit NaCl-haltigem 0,01 m Phosphatpuffer

mit allgemeinen Enzymextraktionsverfahren gewinnt. vom pH-Wert 7,0 bis 8,0 äquilibriert worden war.

Beim Verfahren der Erfindung werden vorzugsweise 40 Dann wird mit einem linearen Natriumchlorid-Gra-

flussige Nährmedien verwendet. Als Nährstoffzusätze dienten von 0,02 m bis 0,1 m in diesem Puffer eluiert.

kommen die verschiedensten Verbindungen in Frage, Die Fraktionen mit Glutaminase GA-Aktivität werden

wie Glucose, Glycerin oder Maltose als Kohlenstoff- gewonnen, und so erhält man das teilweise gereinigte

quelle. Als Stickstoffquelle können z. B. Pepton, Enzym.

Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit, Cas- 45 Anschließend wird eine Gelfiltration unter Verwen-

ammosäure, entfettete Sojabohnen, Hydrolysat von dung von vernetztem Dextran oder Polyacrylamid-Gel

Weizengluten, Ammoniumsalze oder Nitrate verwen- durchgeführt. Dazu wird die teilweise gereinigte

det werden. Außerdem können Salze, wie Magnesium-, Lösung auf eine mit Polyacrylamid-Gel beschickte

Calcium-, Kalium- und Natriumsalze, und Spuren- Säule aufgesetzt, die mit 0,01 m Phosphatpuffer vom

mengen von Nährstoffmaterialien zugesetzt werden. 50 pH-Wert 7,0 bis 8,0 äquilibriert worden war. Die

Die Züchtungstemperatur liegt im Bereich von 25 Elution wird mit dem gleichen Puffer durchgeführt,

bis 37^CC, vorzugsweise um 35⁰C. Der anfängliche Die Fraktionen mit Glutaminase GA-Aktivität wer-

pH-Wert liegt vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,0. Alle den gesammelt, und man erhält teilweise gereinigtes

Verfahren zur aeroben Züchtung können verwendet Enzym.

werden, jedoch wird das Submersverfahren unter Be- 55 Dann wird an einer mit Hydroxylapatit beschickten

lüftung bevorzugt. Für industrielle Zwecke verwendet Säule Chromatographien. Dabei wird die bei der vor-

man geeigneterweise einen Fermenter mit Belüftung genannten Gelfiltration erhaltene teilweise gereinigte

und Bewegung. Die Züchtung ist im allgemeinen nach Enzymlösung auf eine mit Hydroxylapatit beschickte

10 bis 16 Stunden beendet. und mit 0,02 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,5

Obwohl das erfindungsgemäß hergestellte Enzym, 60 äquilibrierte Säule zur Adsorption von Glutaminase

die Glutaminase CA, nach dem Ende der Züchtung GA aufgesetzt. Dann wird mit einem linearen Gradien-

aus der Gärmaische direkt durch Anwendung geeig- ten des gleichen Puffers eluiert. Die Fraktionen mit

neter Hilfsmittel gewonnen werden kann, erntet man Glutaminase GA-Aktivität werden gesammelt, und

vorzugsweise vorher die Zellen durch geeignete Ver- man erhält gereinigtes Enzym.

fahren, z. B. durch Zentrifugation oder Filtration, und 65 Im folgenden ist ein Beispiel für die genannte Ex-

ergreift dann geeignete Maßnahmen zur Gewinnung traktion, Isolierung und Reinigung von Glutaminase

des Enzyms aus den Zellen, da dieses hauptsächlich in GA angegeben, den Zellen enthalten ist.

Schritt

Volumen ml

Spezifische

Aktivität:

Einheiten/mg

Protein*)

Asparaginase-Aktivität/

Glutaminase-Aktivität

Ausbeute

Rohe Enzymlösung 1000

Ammoniumsulfat-Fraktion: 40 bis 60% Sättigung

Chromatographie an Triäthylaminoäthyl-Cellulose (hochaktive Fraktion)

Gelfiltration an einer Polyacrylamid-Gel-Säule
(hochaktive Fraktion)

Chromatographie an einer Hydroxylapatit-Säule
(hochaktive Fraktion)

*) Diese Werte beziehen sich auf die Glutaminase-Aktivität.

5,52
124

43,2

91
102

0,91 0,92 0,92 0,92 0,92

100 81,2 54,6 40,1 36,4

Die Enzymfraktion des letzten Reinigungsschrittes ao wurde gegen vollentsalztes Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert. Man erhielt ein weißes Pulver. Gereinigte Glutaminase GA verhält sich bei der Disc-Elektrophorese bei pH-Wert 9,5 elektrophoretisch einheitlich.

Die nach dem Verfahren der Erfindung hergestellte Glutaminase GA hat ein pH-Optimum im Bereich von etwa 7 bis etwa 9 (vgl. F i g. 1). Sie ist im pH-Bereich 6 bis etwa 8 stabil (vgl. F i g. 5). F i g. 5 zeigt das Ergebnis der Bestimmung der verbleibenden Aktivität, wenn man Lösungen von Glutaminase GA auf verschiedene pH-Werte einstellt und 10 Minuten bei 45°C hält.

Zur thermischen Stabilität ist zu bemerken, daß durch lOminütige Behandlung bei 50⁰C 95% der Aktivität verlorengehen. Durch eine lOminütige Behandlung bei 55° C geht die Aktivität vollkommen verloren (vgl. F i g. 6). F i g. 6 zeigt das Ergebnis der Bestimmung der verbleibenden Aktivität wenn Glutaminase GA in 0,05 m Tris-Puffer vom pH-Wert 7,5 gelöst wird und 10 Minuten bei der entsprechenden Temperatur gehalten wird. Das Molekulargewicht wurde durch Gelfiltration an vernetztem Dextran zu 96 000 bis 105 000 bestimmt.

Bezüglich der Wirkung von Anionen auf Glutaminase GA ist zu bemerken, daß fast keine Steigerung oder Hemmung der Aktivität durch Anionen, wie Phosphat, Borat, Sulfat, Arsenat, Cyanat oder Nitrat, zu beobachten ist, während durch Jod und Brenztraubensäure eine starke Hemmung eintritt. Durch Phthaleine (Triphenylmethanfarbstoffe) und Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure, wird keine Hemmung verursacht. Das Enzym wird durch Metallionen weder aktiviert noch gehemmt.

Angaben über die Substrat-Spezifität von Glutaminase GA:

L-Glutamin 100

L-Asparagin 92

υ-Glutamin 75

D-Asparagin 30

DL-Phenylalaninamid 0

L-Leucinamid 0

Glycinamid 0

Nicotinamid 0

Adenin 0

Acetamid 0

Propionamid 0

n-Valeramid 0

Oxalsäurediamid 0

Bernsteinsäurediamid 0

Benzamid 0

*) Die Aktivität gegenüber L-Glutamin wurde als 100 festgesetzt.

Bisher wurden Asparaginase oder Glutami iase aus einer großen Anzahl von Mikroorganismen isoliert und gereinigt Von den meisten dieser Enzym-Präparate ist bekannt, daß sie auch Aktivität des jeweiligen anderen Enzyms aufweisen, aber im allgemeinen zeigen viele dieser Enzym-Präparate eine höhere Aktivität des einen Enzyms und eine geringe Aktivität des anderen. Sehr wenige Enzyme haben die Glutaminase-Aktivität und zugleich eine fast genauso hohe Asparaginase-Aktivität wie die Glutaminase GA-

Aus Biochem. PharmacoL, 1969, 18(9), S. 2225 bis 2232, referiert in C. A., Bd. 71 (1969), Referat Nr. 119 956, ist eine Escherichia coli L-Asparaginase bekannt Die L-Asparaginase-Aktivftät und die L-GIutaminase-Aktivität dieses Enzyms sind in ihren pH-Aktivitätskurven verschieden. Die L-Glutaminase-

Aktivität steigt um das 6fache vom pH 5,0 bis 8,4, während die L-Asparaginase-Aktivität in diesem pH-Bereich nahezu konstant ist. Das eriindungsgemäß gewonnene Enzym zeigt dagegen nahezu gleiche pH-Aktivitätskurven hinsichtlich beider Substrate.

Die Geschwindigkeit der Hydrolyse von i.-Glutamin durch E. coli L-Asparaginase beträgt höchstens '/io der Hydrolysegeschwindigkeit von L-Asparagin. Das erfindungsgemäß gewonnene Enzym hydrolysiert diese Verbindungen mit nahezu gleicher Geschwindigkeit.

Die L-Glutaminase-Aktivität der E. coli L-Asparaginase hängt mehr oder weniger von dem Stamm oder dem Reinigungsverfahren ab; sie ist jedenfalls um mehrere Prozent geringer als die L-Asparaginase-Aktivität (vgl. Biochemistry, Bd. 6 (1967), S. 721, und Science, Bd. 165 [1969], S. 510).

Aus Biokhimiya 1969, 34(2), S. 352 bis 355, referiert in C. A., Bd. 71 (1969), Referat Nr. 27 983a, ist es bekannt, zwei Pseudomonas-Asparaginase-Isoenzyme A und AG an Sephadex G-100 und DEAE-Cellulose voneinander zu trennen. Die Asparaginase AG enthaltende Fraktion desamidiert D-Asparagin und L-Glutamin sowie L-Asparagin.

Die enzymologischen und chemischen Eigenschaften des Enzyms sind in dieser Literaturstelle nicht ausreichend offenbart. Es ist daher nicht möglich, das erfindungsgemäß gewonnene Enzym mit dem dort beschriebenen Enzym zu vergleichen. Hinsichtlich der Substratcharakteristika sind nur zwei Arten beschrieben, nämlich Glutamin und Asparagin. Über das pH-Optimum und den stabilen pH-Bereich finden sich keine Angaben. Das gleiche gilt für alle anderen wichtigen Parameter.

Des weiteren wird in Biokhimiya 1967, Bd. 32,

S. 859, über die Herstellung einer Glutaminase und einer Asparaginase aus Saccharomyces cerevisiae berichtet. Es handelt sich hierbei um verschiedene Enzymproteine. Auf Grund der wenigen mitgeteilten Ergebnisse ist ersichtlich, daß die gereinigten Enzyme von der erfindungsgemäß erhältlichen Glutaminase GA völlig verschieden sind.

Ein ähnliches Enzym wie die erfindungsgemäß hergestellte Glutaminase GA ist ein Enzym aus Pseudomonas GG 13, im folgenden als GG 13-Enzym be-

ao zeichnet (vergleiche M. E. A. Ramadan et al: Archives of Biochemistry and Biophysics, Bd. 108 (1964), S. 143 bis 157). Jedoch unterscheidet sich Glutaminase GA vom GG 13-Enzym in folgenden Punkten deutlich:

as

Glutaminase GA

GG 13-Enzym

pH-Optimum

Molekulargewicht
Einfluß von
Anionen

Einfluß von
Inhibitoren

Einfluß von
Metallionen

Sowohl die Glutaminase-Aktivität als auch die Asparaginase-Aktivität haben ein pH-Optimum im Bereich von etwa 7,0 bis etwa 9,0.

96 000 bis 105 000

Sowohl die Glutaminase-Aktivität als auch die Asparaginase-Aktivität zeigen das gleiche Verhalten. Sie werden durch Phosphat-, Borat-, Sulfat-, Arsenat-, Cyanat- oder Nitrationen weder verstärkt noch gehemmt. Jedoch werden sie durch Jod und Brenztraubensäure stark gehemmt.

Beide Enzymaktivitäten zeigen dasselbe Verhalten und werden durch Phthaleinfarbstoffe oder Glutaminsäure und Asparaginsäure nicht gehemmt.

Beide Enzymaktivitäten werden weder verstärkt noch gehemmt.

Während die Glutaminase-Aktivität ein pH-Optimum von 6,6 aufweist, hat die Asparaginase-Aktivität ihr Optimum bei pH-Wert 8,2.

25 000

Während die Glutaminase-Aktivität durch Phosphat-, Borat-, Sulfat- oder Arsenationen verstärkt wird, wird die Asparaginase-Aktivität durch Phosphat-, Boratoder Arsenationen gehemmt. Die Asparaginase-Aktivität wird durch Cyanat- oder Nitrationen verstärkt. Beide Aktivitäten werden nicht durch Jod gehemmt.

Die Glutaminase-Aktivität wird durch Phthaleinfarbstoffe stark gehemmt, während die Asparaginase nur durch Bromkresol stark gehemmt wird. Die Glutaminase-Aktivität wird durch Glutaminsäure gehemmt.

Beide Enzymaktivitäten werden durch Fe^{++ +} und Hg⁴⁺ stark gehemmt.

Auf Grand der vorstehenden Befunde kann festgestellt werden, daß nach dem Verfahren der Erfindung hergestellte Glutaminase GA ein neues Enzym ist.

Im folgenden sind die Bestimmungsverfahren für die Enzymaktivität, die Einheit der Enzymaktivität und die spezifische Enzymaktivität angegeben.

Bestimmung der Enzymaktivität: Ein Gemisch aus 0,2 ml Substrat (O,4prozentrge Lösung von Glutamin oder Asparagin) und 0,5 ml 0,05 m Phösphatpuffer vom pH-Wert 7,0 werden mit 0,2 ml Enzymlösung oder Zellsuspension versetzt. Man läßt die enzymatische Reaktion 10 Minuten bei 37°C ablaufen und bestimmt das gebildete Ammoniak nach üblichen Verfahren. Dabei versetzt man die Reaktionslösung mit N esslers Reagens und mißt die Absorption bei 420 nm.

Eine Enzymmenge, die unter den angegebenen Reaktionsbedingungen 1 μΜοΙ Ammoniak pro Minute freisetzt, entspricht einer Einheit der Aktivität (1 I. E.). Die spezifische Aktivität wird in Einheiten pro Milligramm Protein angegeben.

F i g. 1 zeigt den Einfluß des pH-Wertes auf die Aktivität von Glutaminase GA;

F i g. 2 zeigt die Ergebnisse einer Chromatographie von Glutaminase GA an einer Triäthylaminoäthyl-Ceflulose-Säule:

F i g. 3 zeigt die Ergebnisse einer Gelfiltration an einer Polyacrylamid-Gel-Säule;

F i g. 4 zeigt die Ergebnisse einer Chromatographie von Glutaminase GA an einer Hydroxylapatit-Säule;

F i g. 5 zeigt den Einfluß des pH-Wertes auf die Stabilität von Glutaminase GA;

F i g. 6 zeigt den Einfluß der Temperatur auf die Stabilität von Glutaminase GA.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Enzyms als Antitumorwirkstoff in Arzneimitteln. Das Enzym hat nämlich Antitumorwirkung. Es wurde auf folgende Tumoren angewendet. Dabei erhielt man folgende Ergebnisse.

2-10» Zellen der 6C3HED/OG- und 6C3HED/ RG-Tumoren und 1 · 10^e Zellen des Ehrlich-Ascites-Tumors wurden jeweils in die Bauchhöhle von C3H/ He-weiblichen Mäusen und 1 · 10^e L1210 bzw. L5178Y/CA55 Leukämiezellen wurden in die Bauchhöhle von BDF-Mäusen eingebracht. 24 Stunden später wurde das Enzym der Erfindung intraperitoneal verabreicht, und die Antitumorwirkung wurde aus der Überlebensrate und der Ascites-Retention bestimmt.

Wirkung von Gliiraminase GA auf bestimmte Tumoren:

Tumoren

6C3HED/OG

6C3HED/RG
L1210/V

L5178Y/CA55

Ehrlich Ascites,
Klon 4

Wirkungen und Dosis

Eine einzige Verabreichung von 250 I. E./kg bzw. 500 I. E./kg war wirksam. Die Oberlebensrate betrug 55 bzw. 64%.

Zwei Verabreichungen von 500 I. E./kg waren wirkungslos.

Fünfmalige Verabreichungen in Abständen von 48 Stunden von 1251. E./kg bzw. 501. E./ kg waren wirkungslos. Jedoch hemmte eine Verabreichung von 125 I. E./kg die Ascites-Retention.

Verabreichungen von sowohl 125 1. E./kg als auch 501. E./ kg waren geringfügig wirksam.

Eine einzige Verabreichung von 5001. E./kg und 250 I. E./kg hemmte die Ascites-Retention stark.

Daraus geht hervor, daß das erfindungsgemäß hergestellte Enzym eine Antitumor-Aktivität aufweist und als Präparat gegen Tumoren verwendet werden kann. Jedoch wurde der Nachweis, daß es beim Menschen mit Erfolg eingesetzt werden kann, bislang nicht erbracht, obwohl positive Tierversuche an Mäusen vorliegen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Pseudomonas fluorescens ATCC 21541 wurde 18 Stunden bei 30⁰C unter Schütteln in 5 ml eines Nähnnediums vom pH-Wert 6,5 gezüchtet, das 0,5 Gewichtsprozent Glucose, 0,72 Gewichtsprozent Dinatriumhydrogenphosphat und 5 Gewichtsprozent SaIzsäurehydrolysat von entfetteten Soyabohnen (Gesamtstickstoffgehalt 2,1%) enthält. Die erhaltene Kultur wurde als Inoculum für 100 ml des gleichen Nährmediums verwendet. Man züchtete 16 Stunden bei 30⁰C auf einer Drehschüttelmaschine bei 140 U/Min. Die Glutaminase GA-Aktivität pro 1 ml Gärmaische betrug 1,9 I. F., und die Zellmenge wurde zu 5 g/Liter

ίο Trockengewicht bestimmt.

Nach dem Zentrifugieren der Gärmaische und der Gewinnung der Zellen konnten 95% der in der Gärmaische festgestellten Gesamtaktivität zusammen mit den Zellen gewonnen werden. Die so erhaltenen Zellen wurden in 0,01m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 suspendiert. Dann wurde die Zellsuspension 3 Minuten bei 20 kHz mit Ultraschall behandelt und anschließend 10 Minuten bei 10 000 g zentrifugiert. Man erhielt 30 ml Überstand, der ein Rohextrakt von Glutaminase GA darstellte.

92% der in den Zellen enthaltenen Aktivität wurden in diesem rohen Enzymextrakt gewonnen. Die spezifische Aktivität betrug 0,5. Das Enzymrohprodukt wurde der fraktionierten Fällung mit Ammonium-

»5 sulfat unterworfen. Die bei 40- bis 90prozentiger Sättigung mit Ammoniumsulfat erhaltenen Niederschläge wurden gewonnen. 80% der im rohen Enzymextrakt enthaltenen Gesamtaktivität wurden in diesen Niederschlägen gewonnen, wobei die spezifische

Aktivität auf 8,0 stieg. Die Niederschläge wurden in vollentsalztem Wasser gelöst, gegen vollentsalztes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Man erhielt ein rohes Enzymprodukt von Glutaminase GA in Form eines weißen Pulvers.

Beispiel 2

15 Liter eines Nährmediums, das 0,75 Gewichtsprozent Glucose, 8 Gewichtsprozent mit Salzsäure hydrolysiertes Gluten (Gesamtstickstoffgehalt 2,3 Ge-

wichtsprozent), 0,72 Gewichtsprozent Dinatriumhydrogenphosphat und 0,64 Gewichtsprozent Kaliumdihydrogenphosphat enthielt und nach dem Sterilisieren auf den pH-Wert 6,5 eingestellt wurde, wurden in einen 30 Liter fassenden Fermenter gebracht und mit

♦5 einer Anzuchtlösung von Pseudomonas fluorescens ATCC 21 541, die auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten wurde, versetzt. Es wurde 11 Stunden bei 33° C mit einer Belüftungsgeschwindigkeit von 15 Litern/Min, und einer Rührgeschwindigkeit von

250 U/Min, gezüchtet. Die Glutaminase GA-Aktivität der so erhaltenen Gärmaische betrug 2,5 I. E./ml und die Zellmenge 7,0 g/Liter Trockengewicht.

Die durch Zentrifugation aus der Gärmaische gewonnenen Zellen wurden in 7 Liter 0,01 m Phosphat-

puffer vom pH_:Wert 7,5, der 0,03 m Natriumchlorid und 0,002 m Äthylendiamintetraessigsäure enthielt, suspendiert, und die Suspension wurde nach lOminütigem Rühren bei Raumtemperatur zentrifugiert. Man erhielt 7 Liter Überstand, der das Rohenzym enthielt

Die Ausbeute an Glutaminase GA aus den Zellen betrug 90% und die spezifische Aktivität der rohen Enzymlösung 5,4.

Die Lösung wurde mit Ammoniumsulfat auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 fraktioniert gefällt Der Nieder-

schlag wurde in vollentsalztem Wasser gelöst dialysiert und lyophilisiert. Das Rohprodukt von Glutaminase GA fiel als leichtgräuliches Pulver an. Das so erhaltene Produkt hatte die spezifische Aktivität von

12,4. Die Ausbeute an Glutaminase GA aus der rohen Enzymlösung betrug 82%.

Beispiel 3

1500 Liter eines Nährmediums der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 2 wurden in einen 3000-Liter-Tank-Fermenter gebracht. Dieses Nährmedium wurde mit 15 Litern einer Anzuchtlösung von Pseudomonas fluorescens ATCC 21 541, die auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 gezüchtet wurde, versetzt und bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von 1200 Litern/Min, und einer Rührgeschwindigkeit von 150 U/Min. 10 Stunden bei 35'C gezüchtet. Die Glutaminase GA-Aktivität der so erhaltenen Gärmaische betrug 3,0 1. E./ml, und die Ausbeute an Zellen betrug 7,5 g/Liter Trockengewicht.

Die durch Zentrifugieren der Gärmaische erhaltenen Zellen wurden in 150 Liter 0,01 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 suspendiert und durch einen Hochdruck-Homogenisator zerstört, wobei sie zweimal einem Druck von 24 442 kg/m² ausgesetzt wurden. Die Suspension wurde in 350 Litern vollentsalztem Wasser verdünnt und zur Entfernung der Zellteile zentrifugiert. Man erhielt etwa 500 Liter einer rohen Enzymlösung mit Glutaminase GA. Die Ausbeute an Glutaminase GA aus den Zellen erreichte 85%, und die spezifische Aktivität der rohen Enzymlösung betrug 0,45.

Die rohe Enzymlösung wurde auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 der fraktionierten Fällung mit Ammoniumsulfat unterworfen. Aus der rohen Enzymlösung erhielt man ein Rohprodukt von Glutaminase GA in Pulverform mit einer spezifischen Aktivität von 8,5 in einer Ausbeute von 80%.

Beispiel 4

3000 Einheiten eines gemäß Beispiel 1 erhaltenen Rohproduktes von Glutaminase GA wurden in 100 ml 0,01 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5, der 0,01 m an Natriumchlorid war, gelöst. Die Lösung wurde auf eine vorher mit dem gleichen Puffer äquilibrierte Triäthylaminoäthyl-Cellulose-Säule aufgesetzt. Es wurde mit einem linearen Natriumchlorid-Gradienten in diesem Puffer eluiert. Das Eluat wurde in 10-ml-Fraktionen aufgefangen. Das Ergebnis der Elution ist in Fig. 2 wiedergegeben. Die Proteinmenge wurde durch die Absorption bei 280 nm bestimmt. Aus den Fraktionen Nr. 17 bis 26 erhaltene, teilweise gereinigte Glutaminase GA wurde gegen vollentsalztes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Die spezifische Aktivität stieg durch diesen Schritt auf 40. Die Ausbeute betrug 65% in bezug auf das rohe Enzymprodukt und 55% in bezug auf die rohe Enzymlösung.

Die dabei erhaltene lyophilisierte Glutaminase wurde in 3 ml des genannten Puffers gelöst. Die Lösung wurde der Gel-Filtration an einer mit Polyacrylamid-Gel beschickten Säule (3,0 X 120 cm), die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war, unterzogen. Man eluierte mit dem gleichen Puffer und sammelte das Eluat in 10-ml-Fraktionen. Das Ergebnis dieser Gel-Filtration ist in F i g. 3 wiedergegeben. Aus den Fraktionen Nr. 21 bis 26 erhält man ein teilweise gereinigtes Glutaminase GA-Produkt. Die Ausbeute in bezug auf den vorhergehenden Schritt betrug 78% und in bezug auf die rohe Enzymlösung 43%. Die spezifische Aktivität stieg auf 92.

Ein durch die Gel-Filtration erhaltenes, teilweise gereinigtes Glutaminase GA-Produkt wurde gegen 0,02 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,5 dialysiert und auf eine vorher mit diesem Puffer äquilibrierte, mit Hydroxylapatit beschickte Säule (2,5 χ 60 cm) aufgesetzt. Man eluierte mit einem linearen Konzentrationsgradienten dieses Puffers urd sammelte Fraktionen von 10 ml. Die Ergebnisse der Elution sind in F i g. 4 gezeigt. Aus den Fraktionen Nr. 58 bis 63 erhielt man ein Produkt mit der Aktivität der Glutaminase GA. Die Ausbeute bei diesem Schritt betrug 88%, während die Gesamtausbeute aus der rohen Enzymlösung 37% betrug. Es wurde fast kein Anwachsen der spezifischen Aktivität beobachtet.

Die so erhaltene Glutaminase GA wurde gegen vollentsalztes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Man erhielt ein gereinigtes Glutaminase GA-Produkt als weißes Pulver.

Bei der Disc-Elektrophorese verhielt sich dieses Produkt einheitlich.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Enzyms mit etwa gleich großer Glutaminase- und Asparaginase-Aktivität durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas in einem Nährmedium bei hierfür üblichen Temperaturen und pH-Werten, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Pseudomonas fluorescens ATCC 21 541 einsetzt und daß man das Enzym aus der Gärmaische mit allgemeinen Enzymextraktionsverfahren gewinnt.

2. Verwendung des gemäß Anspruch 1 erhaltenen Enzyms zur Herstellung von Arzneimitteln mit Antitumorwirkung.