DE1442163C

DE1442163C - Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von saurer Protease

Info

Publication number: DE1442163C
Application number: DE19621442163
Authority: DE
Inventors: Hirao Suita Tomoda Katsumi Toyonako Shimazono, (Japan)
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1962-04-04
Filing date: 1962-04-04
Publication date: 1973-09-06

Description

Beispielsweise kann man eine wäßrige Lösung, die die Protease enthält, aussalzen, indem man ein Salz, wie Natriumsulfat, Ammoniumsulfat, Natriumchlorid, zur Lösung gibt. Oder man kann sie der fraktionierten Fällung unterwerfen, indem man ein geeignetes hydrophiles organisches Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, n-Propanol, Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran, zur Lösung gibt.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene saure Protease ist bei Temperaturen von z. 3, 40 bis 5O⁰C oder, wenn die saure Protease gleichzeitig mit ihren Substraten, d. h. Proteinen, behandelt wird, von 60 bis 70° C, im stark sauren pH-Bereich stabil. Daher kann das filtrierte Zuchtmedium, in dem die Proteasekonzentration noch niedrig ist, unmittelbar unter vermindertem Druck eingeengt werden. Es kann auch das Gefriertrocknungsverfahren angewendet werden.

Wenn die Abtrennung durch Adsorption erfolgen soll, können beispielsweise die folgenden bekannten Adsorbentien verwendet werden: Calciumphosphat, Aluminiumoxyd, Bentonit (natürliches kolloides hydratisiertes Aluminiumsilikat), Magnesiumsilikat, Carboxymethylcellulose, schwach saure Kationenaustauschharze vom Carbonsäuretyp wie Mischpolymerisat-Austauschharze mit Carboxylgruppen (schwach sauer) und Harze auf Basis vernetzter Methacrylsäure verbindungen. Diese Austauschharze sind in »Ion Exchange Resins« von Robert K u η i η, 2. Auflage., S. 85 bis 87 (John Wiley & Sons, Inc., 1958), beschrieben.

Die Protease kann aus ihrer wäßrigen Lösung durch Zusatz von Protein fällenden Mitteln, wie Nucleinsäuren, Gerbsäuren, Phosphorwolframsäure, gefällt werden. Die Ausfällung der Protease wird durch Einstellung des pH-Wertes der Lösung auf den isoelektrischen Punkt erleichtert. Zur Reinigung der sauren Protease kann auch Elektrodialyse angewendet werden.

Die gemäß der Erfindung hergestellte und gewonnene saure Protease katalysiert überaus stark die Hydrolyse von Peptidbindungen in Proteinen. Die katalytische Wirkung ist von der Art der Proteine unabhängig. Die Protease vermag daher die verschiedensten Proteine, wie Kasein, Hämoglobin und Albumin in gleich starkem Maße aufzuspalten.

Die folgenden Versuche zeigen die Aktivität der sauren Protease und lassen ihre praktischen Anwendungsmöglichkeiten erkennen. Bei diesen Versuchen wurde als Proteasepräparat das pulverförmige Enzym verwendet, das mit Aceton aus der durch Züchtung eines Stamms von Trametes sanguinea (L. ex Fr.) Lloyd erhaltenen und filtrierten Brühe extrahiert worden war.

a) Einwirkung der Protease auf Fleisch

In 20 cm³ einer wäßrigen Suspension von 0,1 g gemahlenem Fleisch in einer auf pH 2,8 eingestellten Pufferlösung ließ man das Proteasepräparat in einer 10 mg Protein entsprechenden Mengen bei 55⁰C mit dem gemahlenen Fleisch reagieren. Nach 20 Minuten bildete sich bei Zusatz von Trichloressigsäure zum Gemisch keine Fällung. Die Absorption der Suspension bei einer Wellenlänge von 275 πημ — entsprechend der charakteristischen Absorptionsbande von Tyrosin — nahm erheblich zu und erreichte ihr Maximum ~80 Minuten nach Beginn der Reaktion. Nach 100 Minuten verlor das gemahlene Fleisch die natürliche Zähigkeit bzw. Klebrigkeit und wurde bröckelig. Ließ man dagegen die gleiche Fleischsuspension ohne Zusatz der Protease bei 55° C stehen, zeigte sich nach einer weit längeren Zeit als 100 Minuten keine Veränderung.

	10	0	Absorption (Ε-Wert) der
Reaktionszeit	20	Fleischsuspension bei einer
Minuten	40	Wellenlänge von 275 πιμ
60	(Schichtdicke 1 cm)
⁵ 80	0,000
100	0,455
0,460
0,540
0,680
0,680

b) Einwirkung der Protease auf Abfallhefe

ao Bei der Extraktion von Ribonucleinsäuren aus Hefe erhaltene Abfallhefe, die auf Grund der Zellwände nicht löslich ist, wird durch Einwirkung der sauren Protease löslich gemacht. In je 5 cm³ der nachstehend aufgeführten Enzymlösungen, deren Konzentration 300 mg/100 cm³ betrug, wurden 100 mg Abfallhefe suspendiert. Die Suspensionen wurden 24 Stunden bei 37°C stehen gelassen. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

30	Enzym	Acidität des Mediums	Löslich gemachter
			fester Teil, bezogen auf ursprünglichen festen Teil der Ab
	Pepsin	1/100 n-Salz-	fallhefe (°/„)
35		säure	11,9
	Trypisin	pH 7 (Phosphat
		puffer)	26,4
	Saure Pro	1/100 n-Salz-
	tease	säure	61,0
40

Einige Ausführungsformen des Verfahrens gemäß der Erfindung sind in den folgenden Beispielen · beschrieben, in denen die Prozentsätze sich auf das Gewicht beziehen, falls nicht anders angegeben. »ATCC« bedeutet »American Type Culture Collection, Washington, D. C, USA.«.

Beispiel 1

5 1 eines auf etwa pH 5,2 eingestellten Mediums aus 5°/₀ Dextrin, 2% Maismaische, 0,15 °/₀ Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05 °/₀ Magnesiumsulfat (7 Mol Kristall wasser), 2 mg/1 Thiaminhydrochlorid, Rest Wasser, wurden mit einem Stamm von Trametes sanguinea (L. ex Fr.) Lloyd beimpft. Dann wurde 6 Tage unter Schütteln bei einer Temperatur zwischen 25 und 6O⁰C bebrütet. Nach der Bebrütung war das Mycel stark gewachsen. Durch Zentrifugieren wurde eine klare wäßrige Schicht vom Mycel abgetrennt.

Zur wäßrigen Schicht wurde Äthanol gegeben, wobei sich 25 g weißes pulverförmiges Enzym abschieden. Die enzymatische Aktivität des Pulvers als Protease bei einem pH-Wert von 3,0 war folgende:

PE
⁵

37° C, 275 ηιμ
mg-Aquiv. Tyrosin

₌ . _{x/ p} j

Die Abkürzung für die Aktivität der Protease bedeutet, daß Kasein als Substrat der Einwirkung der

Protease bei 37° C für 20 Minuten ausgesetzt und die Zunahme der Lichtabsorption während der Reaktion bei einer Wellenlänge von 275 ηιμ gemessen wurde, wobei die einem mg-Äquivalent Tyrosin entsprechende Absorption bei der gleichen Wellenlänge als Einheit der enzymatischen Wirksamkeit genommen wurde. Bei Verwendung eines Stamms von Trametes cinnabarina (Jacq.) Fr. an Stelle eines Stamms Trametes sanguinea (L. ex Fr.) Lloyd in dem vorstehend beschriebenen Versuch wurde ebenfalls saure Protease ίο in Pulverform erhalten. Der, hier verwendete Stamm von Trametes sanguinea (L. ex Fr.) Lloyd hat die Nr. ATCC 14 622, der Stamm von Trametes cinnabarina (Jacq.) Fr. ist unter der Nummer ATCC 14 623 hinterlegt.

Beispiel 2

51 eines auf einen pH-Wert von 5,2 eingestellten Zuchtmediums aus 5% Glukose, 0,3 °/o Polypepton, 0,15% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat (7 Mol Kristallwasser), 0,2 % Hefeextrakt, 2 mg/1 Thiaminhydrochlorid, Rest Wasser, wurde mit Poria vaporaria (Fr. non Pers.) Cooke ATCC 14 624 beimpft. Dann wurde 6 Tage unter Schütteln bei einer Temperatur von 28 bis 30° C bebrütet. Nach der Bebrütung wurde die Nährmittellösung filtriert. Die Aktivität des Filtrats als Protease wurde nach einer Modifikation der Kunitzschen Methode unter Verwendung einer Laktatpufferlösung ermittelt, die einen pH-Wert von 2,8 hatte:

PE ^Kafj' ³V ^C> ²⁷⁵ V- _{= 8} 08 · 10-²/cm³
mg/Aquiv. Tyrosin ' '

Nach Zusatz von Äthanol zur filtrierten Nährlösung wurden 20 g des pulverförmigen Enzyms erhalten, das die Wirksamkeit der sauren Protease zeigte.

Beispiel 3

301 eines Nährmediums, dessen pH-Wert 3,0 bis 3,2 betrug, wurden mit Trametes sanguinea (L. ex Fr.) Lloyd ATCC14 622 beimpft. Das Medium hatte folgende Zusammensetzung: 5% Dextrin, 2% Maismaische, 0,15% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat (7 Mol Kristallwasser), 2 mg/1 Thiaminhydrochlorid, Rest Wasser. Es wurde 6 Tage unter Bewegung und Belüftung bei einer Temperatur von 25 bis 30° C bebrütet. Nach der Bebrütung wurde die Kulturbrühe filtriert. Zum Filtrat wurde Aceton gegeben, wobei sich 150 g weißes pulverförmiges Enzym abschieden. Das Pulver wurde in einer geringen Menge einer 0,02molaren Salzsäure-Natriumacetat-Pufferlösung gelöst, die einen pH-Wert von 3,5 hatte. Die Lösung ließ man durch eine Säule eines schwach sauren Kationenaustauschers mit Carboxylgruppen laufen, der mit einer Pufferlösung der gleichen Zusammensetzung vorbehandelt worden war. Die am Harz adsorbierte Protease wurde mit der auf pH 5,5 eingestellten 0,5molaren Salzsäure-Natriumacetat-Pufferlösung eluiert. Aus dem Eluat wurden Fraktionen, die als Protease aktiv waren, abgetrennt und der fraktionierten Fällung mit Ammoniumsulfat unterworfen. Die bei 40- bis 80%iger Sättigung mit Ammoniumsulfat erhaltenen Fällungen wurden abgetrennt und in einer geringen Menge der vorstehend genannten, auf pH 3,5 eingestellten 0,02molaren Pufferlösung gelöst. Die Lösung wurde 24 Stunden gegen eine Pufferlösung der gleichen Zusammensetzung wie das Lösungsmittel dialysiert. Zur Lösung, die innerhalb des Diaphragmas verblieb, wurden allmählich unter Kühlung etwa 20 Volumprozent gekühltes Aceton gegeben. Das Gemisch wurde in einer Eiskiste stehengelassen. Nach 24 Stunden begannen Kristalle aufzutreten. Die Kristallisation war nach 4 bis 5 Tagen abgeschlossen. Die Aktivität des kristallinen Enzyms als Protease war folgende:

_DC Kas., 37°C, 275 μ . , ,-, _D . .
PE ·.·'.' Γ = 3,65/mg Protein
mg-Aquiv. Tyrosin ' ' ^B

Es wurde festgestellt, daß 10% der im Kulturfiltrat vorhandenen Aktivität als Protease im kristallinen Produkt erhalten geblieben war. Es wurde ferner gefunden, daß die spezifische Aktivität des Produkts etwa 20mal so hoch war wie die des Kulturfiltrats.

Die auf die beschriebene Weise erhaltene kristalline saure Protease hatte folgende Eigenschaften:

Ihre optimale pH-Wert-Aktivität beträgt etwa 2,3 bis 2,5, wie aus F i g. 1 ersichtlich (Prüfung der Aktivität mit Kasein als Substrat). Ihre optimale Temperatur-Aktivität liegt bei etwa 55 bis 60° C, wie aus F i g. 5 ersichtlich (Prüfung der Aktivität mit Kasein als Substrat). Ihre optimale pH-Wert-Aktivität gegen Hämoglobin liegt bei 2,8 (siehe F i g. 2) und bei 3,4 gegen Eieralbumin (siehe F i g. 3).

Die Protease ist im pH-Bereich von 2,0 bis 6,5 stabil (siehe F i g. 4) und verliert ihre Aktivität, wenn sie ohne Substrat 10 Minuten auf 70° C erwärmt wird (siehe F i g. 6).

Sie wurde an einer Säule aus Carboxymethylcellulose adsorbiert, dann stufenweise mit einer 0,02molaren Salzsäure - Natriumacetat - Pufferlösung vom pH 3,5 bis 5,5 eluiert, wobei die allein aktive Fraktion erhalten wurde.

Ihr Ultraviolett-Absorptionsspektrum ist charakteristisch für typisches Protein, das eine maximale Adsorption bei einer Wellenlänge von 277 bis 280 ΐημ aufweist (F i g. 7).

Die Einheitlichkeit der Substanz wurde durch Elektrophorese (Gerät nach Tiselius) bestätigt, wobei 15% des enzymatischen Proteins im Phosphatpuffer (μ = 0,1) von pH 6,08 dem elektrischen Feld bei 72 V.und 10 mA 3 Stunden ausgesetzt wurden! Auch die Analyse mit der Ultrazentrifuge im Acetatpuffer (U = 0,1) von pH 5,0 bei einer Umdrehungszahl von 9,667 · 10²/Sek. für 75 Minuten zeigte, daß die untersuchte Protease einheitlich war. Die Sedimentationskonstante betrug 2,95 · 10~¹³ bei 17° C, woraus das Molekulargewicht der sauren Protease mit etwa 30 000 errechnet wurde.

Bei dem im Beispiel beschriebenen Versuch kann es geschehen, daß die dialysierte Lösung gefärbt ist. Diese Störung kann jedoch behoben werden, indem man die Lösung durch eine mit einem schwachbasischen Anionenaustauschharz auf Basis von Styrol-Mischpolymerisaten gefüllte Kolonne laufen läßt.

Beispiel 4
(nachgereicht)

5 leinesauf etwa pH 5,2 eingestellten Kulturmediums aus 5% Dextrin, 2 % Maismaische, 0,15% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat (7MoI Kristallwasser), 2 mgThiaminhydrochlorid/Liter, Rest Wasser, wurden mit jedem der in der Tabe le I aufgeführten Stämme beimpft. Dann wurde 6 bis 9 Tage unter Schütteln bei einer Temperatur zwischen 25

nd 3O⁰C bebrütet, bis das Mycel stark gewachsen ar. Durch Zentrifugieren wurde eine klar wäßrige chicht vom Mycel abgetrennt. Zur wäßrigen Schicht urde Äthanol gegeben, wobei ein festes Gemisch lurer Protease erhalten wurde. Die enzymatischen .ktivitäten der Proteaseproben sind in der Tabelle 1 isammengefaßt.

Tabelle 1

	Stamm	Aktivität	Be brütung (TaEeI
Spezies		_pEKas._37°C,275msi mg-Äquiv. Tyrosin
	IFO 4923	(pro mg Protein)	7
rametes	IFO 4924	22,85	7
ianguinea	IFO 4925	10,72	9
L. ex Fr.)	IFO 4926	12,95	8
Lloyd	IFO 6489	5,14	8
	IFO 6490	10,55	8
	IFO 6491	5,25	9
	IFO 6492	9,68	9
	IFO 6493	56,51	6
	IFO 6494	41,92	6
	IFO 6495	13,10	6
	IFO 6139	4,10	6
rametes	IFO 6485	3,66	9
;innaba-	IFO 6486	3,65	9
'ina	IFO 8255	4,27	6
'Jacq.) Fr.	7,85

Vergleichsversuch
(nachgereicht)

Es werden Vergleichsversuche durchgeführt, in enen die Aktivität der erfindungsgemäß hergestellten luren Protease der des kristallinen Pepsins gegenbergestellt wurde.

Die Versuche wurden nach der Anson-Hagihara-Methode durchgeführt, die beschrieben ist in »Annual Report of Scientific Works from the Faculty of Science«, Osaka University, Volumen 2, S. 56 (1954).

Als Versuchssubstrat wurden 20 mg Milchkasein und als Proteasen 0,031 mg erfindungsgemäß hergestellte Protease und 0,031 mg kristallines Pepsin verwendet. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

Versuchsprobe	Aktivität mg (Protease-Einheit/ mg Protein)
1 2	1280 840 .

Es ist erkennbar, daß die erfindungsgemäß hergestellte saure Protease beim Aufschließen von Kaseineiweiß eine etwa l,5mal höhere Wirksamkeit hat als kristallines Pepsin.

Dagegen ist die Aktivität der gemäß dem amerikanischen Verfahren (USA.-Patentschrift 2 848 371) hergestellten Protease beim Abbau des Milchkaseins nur halb so groß wie von kristallinem Pepsin. Die erfindungsgemäß gewonnene saure Protease hat demnach gegenüber dem aus der USA.-Patentschrift 2 848 371 bekannten Produkt eine um etwa das 3fache höhere Aktivität.

Hinzu kommt, daß die erfindungsgemäß hergestellte saure Protease eine höhere Stabilität aufweist als die Protease der USA.-Patentschrift 2 848 371, denn diese verliert ihre Aktivität bereits, wenn sie 10 Minuten lang der Einwirkung einer Temperatur von 55°C ausgesetzt wird. Die erfindungsgemäß gewonnene Protease ist dagegen bei 55 bis 6O⁰C noch, stabil. ·

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

309 036/8

Claims

1 2

tiimsfaktoren enthaltenden Nährmedien, das dadurc!

Patentanspruch: gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismu

einen der Stämme von Trametes cinnabarina (Jacq.

Verfahren zur Herstellung von saurer Protease Fr. oder von Trametes sanguinea (L. ex Fr.)'Lloy(

durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus in 5 oder den Stamm Poria vaporaria (Fries) Cooki

wäßrigen, assimilierbare Kohlen- und Stickstoff- ATCC 12 624 einsetzt.

quellen und übliche Wachstumsfaktoren enthal- Den hier gebrauchten Klassifizierungsbezeichnunger

tenden Nährmedien, dadurch gekenn- liegt das System zugrunde, das in »Mycological Flon.

zeichnet, daß man als Mikroorganismus einen of Japan« von Seiya I to, Vol. II (herausgegeber

der Stämme von Trametes cinnabarina (Jacq.) io von Yokendo, Tokio, 1955) veröffentlicht wurde.

Fr. oder von Trametes sanguinea (L. ex Fr.) Lloyd Die in das Verfahren der Erfindung eingesetzter

. oder den Stamm Poria vaporia (Fries) Cooke Mikroorganismen bilden in guter Ausbeute eine stabilt

ATCC 14624 einsetzt. saure Protease von hoher Aktivität. Durch Verwen

dung dieser Mikroorganismen ist die industrielle

15 Herstellung von saurer Protease möglich geworden.

Als assimilierbaren Kohlenstoff liefernde Stoffe

eignen sich Glukose, Dextrin, lösliche Stärke, Saccarose, Maltose und Laktose. Die verschiedensten

Es ist bekannt, daß Proteasen, die die Hydrolyse organischen Verbindungen bzw. organische Stoffe, wie von Peptidbindungen in verschiedenen Proteinen 20 organische Ammoniumsalze, organische Nitrate, Harnkatalysieren, in tierischem Eingeweide sowie in den stoff, verschiedene Aminosäuren, Maismaische, Pep-Zellen und in der Zuchtbrühe von Mikroorganismen, ton, Polypepton, Kasein, Fleischextrakt, Sojabohnenwie Pilzen und Bakterien, enthalten sind. Einige kuchen, Sojabohnenmehl und Kartoffelbrei, eignen dieser Proteasen können industriell hergestellt werden. sich zur Einführung nicht nur des Kohlenstoffs, son-Proteasen können nach dem optimalen pH-Wert, bei 25 dem auch des digerierbaren Stickstoffs, der jedoch dem sie katalytisch aktiv sind, in drei Gruppen ein- auch in Form von anorganischen Stickstoffverbindungeteilt werden: neutrale Protease, alkalische Protease gen, ζ. B. von anorganischen Ammoniumsalzen, wie und saure Protease. Bei den im Handel erhältlichen Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat, Ammonium-Proteasen handelt es sich fast ausschließlich um phosphat, Ammoniumnitrat, oder von anorganischen neutrale Protease. 30 Nitraten, wie Natriumnitrat, Kaliumnitrat, eingeführt Die bekannten Verfahren zur Herstellung von Pro- werden kann. Zusätzlich hierzu werden zweckmäßig tease ergeben relativ niedrige Ausbeuten, da die für Mineralsalze, Phosphate, Vitamine oder Wachstumsdie Proteasebildung verwendeten Mikroorganismen faktoren, z. B. wasserlösliche Salze von Vitamin Bj, eine beschränkte Leistungsfähigkeit haben. Außerdem als Hilfsnährstoffe in der Nährlösung verwendet, sind die so hergestellten neutralen Proteasen nur 35 Der pH-Wert des Kulturmediums wird zu Beginn begrenzt einsatzfähig, da sie z. B. bei pH-Werten auf etwa 3 bis 7 eingestellt. Bei Verwendung eines unter 4 nicht mehr stabil sind. Stamms von Trametes sanguinea (L. ex Fr.) Lloyd zur Bekanntlich wird saure Protease durch Aspergilli Bildung der sauren Protease wird empfohlen, den gebildet, die typische Pilze (Fungi) sind. Es wurde pH-Wert des flüssigen Mediums während der Beversucht, saure Protease unter Verwendung eines 40 brütung bei etwa 3, insbesondere zwischen 3,0 und 3,2 dieser Mikroorganismen industriell zu erzeugen. Die zu halten, da hierbei das gebildete Kulturfiltrat mehr Versuche waren jedoch bisher erfolglos, da der Mikro- als die doppelte Menge an saurer Protease enthält, Organismus auf einem festen Medium beispielsweise als wenn das Medium auf etwa pH 5 eingestellt ist. nach dem sogenannten Koji-Verfahren gezüchtet Die Herstellung der sauren Protease ist auch mit wurde, das sich nicht in den großtechnischen Maßstab 45 Hilfe des sogenannten Koji-Verfahrens möglich, bei übertragen läßt. dem feste Stoffe, wie Sägemehl, Reiskleie, Weizen-

Es wurde gefunden, daß ein Stamm von Trametes kleie, für die Züchtung verwendet werden,
cinnabarina (Jacq.) Fr., Trametes sanguinea (L. ex Fr.) Die Bebrütung erfolgt zweckmäßig bei üblichen Lloyd und Poria vaporaria (Fries) Cooke ATCC14624 Temperaturen von etwa 25 bis 35° C. Die in der Zuchtfähig sind, in guter Ausbeute Protease zu bilden, die 5° brühe angereicherte Protease erreicht gewöhnlich ihr sich in hoher Konzentration in der Zuchtbrühe Maximum zwischen dem zweiten und 15. Tag der anreichert, und daß es sich hierbei um saure Protease Bebrütung. Unter diesen Bedingungen reichert sich handelt, die mit bemerkenswert hoher und stabiler die gebildete Protease nicht innerhalb des Mycels an, Aktivität die Hydrolyse von Peptidbindungen in sondern sie dringt nach außen und reichert sich im Proteinen katalysiert. Diese saure Protease zeigt 55 Kulturmedium an. Beim Verfahren gemäß der Erfinmaximale katalytische Aktivität im pH-Bereich von dung wird daher die angereicherte Protease haupt-1 bis 4. Auf Grund dieser Eigenschaft ist sie besonders sächlich aus dem flüssigen Teil der Kulturbrühe, und als Digestivum, das Proteine im Magen aufspaltet, zwar gewöhnlich nach deren Filtraten, gewonnen,
geeignet. Durch dieses Digestivum kann der pH-Wert Zur Abtrennung der Protease können allgemein des Magensaftes stark sauer eingestellt werden 60 bekannte Methoden zur Gewinnung von Enzymen (pH 1 bis 3). aus ihren Lösungen angewendet werden. Die gemäß Es war bisher nicht bekannt, daß zur Familie der Erfindung gebildete Protease kann an verschiede-Polyporaceae gehörende Mikroorganismen saure Pro- nen Adsorbentien adsorbiert oder auch mit Hilfe tease zu bilden vermögen. einiger Fällungsmittel ausgefällt werden. Ferner kön-Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur 65 nen allgemeine Gewinnungsmethoden, wie Fällung in Herstellung von saurer Protease durch aerobes Züchten der Nähe des iso-elektrischen Punktes, Aussalzen, eines Mikroorganismus in wäßrigen, assimilierbare Dialyse und Kombinationen dieser Methoden zur Kohlen- und Stickstoffquellen und übliche Wachs- Abtrennung und Reinigung angewendet werden.