DE2245402A1

DE2245402A1 - Verfahren zur herstellung von xylose(glucose-) isomerase-enzymzubereitungen

Info

Publication number: DE2245402A1
Application number: DE2245402A
Authority: DE
Inventors: Frederick Carl Armbruster; Robert Paul Cory; Robert Edward Heady
Original assignee: Unilever Bestfoods North America
Current assignee: Unilever Bestfoods North America
Priority date: 1971-09-17
Filing date: 1972-09-15
Publication date: 1973-03-22
Also published as: GB1411765A; US3813318A; DE2245402B2; FR2153100A1; GB1411763A; BE788843A; CA986438A; GB1411764A; TR17546A; ES406665A1; JPS4836394A; CH576524A5; JPS5645589B2; IT970699B; BR7206440D0; NL7212631A; DE2245402C3; AU476885B2; FR2153100B1; AU4673772A

Description

15. Sep. 1972

GPG INTERNATIONAL Inc.

International Plaza

Englewood Cliffs, New Yersey 07632

U SA

Verfahren zur Herstellung von Xylose- (Glucose-) Isomerase-

Enzymzubereitungen

Priorität : USA vom 17.9.1971

No. 181 639

Die Erfindung bezieht sich ganz allgemein auf die enzymatische Isomersisierung und speziell auf Verbesserungen hinsichtlich der Herstellung von Enzymzubereitungen, die für die Isomerisierung von Glucose (Dextrose) zu Fructose (Laevulose) geeignet sind, und auf ihre Verwendung für derartige Umwandlungen. Sie bezieht sich weiterhin auf neue Isomerase-Enzymzubereitungen.

Die Herstellung von Glucosesirup und Trockenglucosesirup durch Hydrolyse von Stärke hat sich in der Richtung zu immer süssereh Erzeugnissen weiterentwickelt. Die Säurehydrolysate, welche die ersten Handelsprodukte darstellten, haben den Weg zu qualitativ besseren Erzeugnissen gewiesen, die durch die Verwendung von Verzuckerungsenzymen erhalten werden. Die Technik ist soweit fortgeschritten, dass ea keine Schwierigkeiten bereitet, Enzymhydrolysate mit D.E.-Werten über 95 zu erzeugen.

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Die Industrie ist jedoch an grösserer Süssigkeit auch interessiert, und seit Jahren sind Untersuchungen über die Technik des Isomerisierens von Stärkehydrolysaten durchgeführt worden, um ihren Gehalt an Fructose zu erhöhen. Wichtige Pionierarbeit auf diesem Gebiet wurde von CANTOR und HOBBS geleistet, worüber in dem US-Patent 2 354 664 berichtet wird, das am 11.8,1944 erteilt wurde. CANTOR und HOBBS benutzten die alkalische Katalyse, um die Isomerisierung zu bewirken.

Die alkalische Isomerisierung ist hinsichtlich des Grades, Ms zu dem die Isomerisierung durchgeführt werden kann, und hinsichtlich der Bildung qualitativ annehmbarer Erzeugnisse begrenzt. Infolgedessen war man jahrelang auf der Suche nach einem Enzym, das die Isomerisierung bewirken würde. Biese Suche fand ihren Höhepunkt in der Entdeckung der Xylose—Isomerase, welche die intermolekulare Umwandlung von D-Xylose in B—Xylulose katalysiert. Es wurde gefunden, dass dieses Enzym D-Glucose (Sextrose) in D-Fructose (Laevulose) umwandelt, wie es von MARSHALL und KOOI in Science, April 1957, Vol. 125, No. 3249, S. 648 - 649 und in dem Pionierpatent auf diesem Gebiet, dem US-Patent 2 950 228 ( Erfinder: Richard 0. Marshall) vom 23.8.I960 beschrieben wird. Seit dieser Zeit sind auf dem Gebiet der enzymatischen Isomerisierung zahlreiche Untersuchungen durchgeführt worden.

Über die Verwendung eines Mikroorganismus der Actinomycetales-Arten zur Gewinnung eines isomerisi er enden Enzyms habeil SATO und TSUMURA in ihrer Arbeit " A Study on Isomerization of Dextrose by a Streptomyces Strain" anlässlich eines Jährestreffens der Agricultural Chemical Society of Japan in Sapparo im Juli 1964 berichtet. Ein grosser Teil der weiteren Arbeiten, die sich auf die Verwendung von Mikroorganismen der Gattung Streptomyces zur Erzeugung des Enzyms Isomerase beziehen, wurde im Fermentation Research Institute of Japan durch Dr. Y Takasaki und seinen Mitarbeitern durchgeführt. Ein Teil dieser Arbeiten wird in der Ver-

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öffentlichung "Fermentation Advances", Academic Press-Verlag, New York 1969 in dem Beitrag von Br. Takasaki und Mitarbeitern zusammmengefasst, der auf S. 561 "beginnt. .

Die Arbeiten von SATO und TSUMURA führten zur Verwendung von Mikroorganismen der Gattung Strept.omyces zur Gewinnung von isomerisierenden Enzymen, wobei xylosehaltige Nährmedien verwendet wurden. Ein Nachteil der Verwendung von Xylose für die Enzymerzeugung ist darin zu sehen, dass die Kosten für das erforderliche Medium hoch sind. Dr. Takasaki und Mitarbeiter isolierten bestimmte Streptomyces-Stämme, die Xylanase erzeugen und die infolgedessen in einem Xylan enthaltenden Nährmedium kultiviert werden. Xylan ist wesentlich preiswerter als Xylose. Auch für diese Mikroorganismen haben sich jedoch hinsichtlich der Wirtschaftlichkeit und der Zusammenstzung und der Kosten des Kulturmediums Schwierigkeiten ergeben. Darüberhinaus hat sich gezeigt, dass alle bekannten Stämme für die technische Enzymgewinnung im Kulturmedium Kobalt benötigen wodurch ein zusätzliches Problem geschaffen wird.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur technischen Herstellung von isomerisierenden Enzymzubereitungen, das nicht an die Verwendung von Xylose gebunden ist, um die Enzymerzeugung zu induzieren.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein verbessertes Verfahren zur technischen Herstellung von isomerisierenden Enzymzubereitungen, die nicht die Verwendung von Kobalt im Kulturmedium benötigen.

Darüberhinaus dienen die erfindungsgemäss hergestellten Enzymzubereitungen dazu, Lösungen von Stärkehydrolysaten oder von Dextrose in laevulοsehaltige Erzeugnisse umzuwandeln, die für die wirtschaftliche Herstellung attraktiver sind als die nach den bekannten Verfahren hergestellten Erzeugnisse,

Gegenstand der Erfindung ist in Zuuammenhang damit ein verbessertes technischen Verfahren zur Herstellung von laevulosehaltigen Erzeugnissen.

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Zum besseren Verständnis der vorliegenden Anmeldung und zur Vereinfachung sollen nachfolgend einige allgemein gebrauchte Begriffe definiert werden :

D.E.-Wert. Der Begriff "D.E." ist eine'Abkürzung für "Dextrose-Äquivalent" . Er wird für den Gehalt an reduzierenden Zuckern, berechnet als D-Glucose und bezogen auf Trockensubstanz,verwendet.

Stärkehydrolysat. Der Begriff "Stärkehydrolysat" wird allgemein für einen Sirup oder ein Trockenprodukt verwendet, die durch Hydrolyse von Stärke gewonnen werden. Derartige Produkte können durch Hydrolyse von Stärke mit Säuren oder Enzymen oder durch eine Kombination der Säure- und Enzymhydrolyse erhalten werden. Ein bevorzugter Typ von Stärkehydrolysat für die Isomerisierung entsprechend der vorliegenden Erfindung wird durch Vorverzuckerung mit Säure oder Enzym bis zu einem D.U.-Wert von 10 oder woniger und nachfolgende Verzuckerung mit Enzymen bis zu D.E.-Werten über 95, vorzugsweise über 97 hergestellt.

Glucose und Dextrose. Stärkehydrolysate mit mittleren D.E.-Werten werden in der Literatur allgemein als "Glucosesirup" bezeichnet, was sowohl für Stärkehydrolysate in Sirup- als auch in Trockenform gilt. Die Bezeichnung "Dextrose" ist reserviert für das reine kristallisierte Monosaccharid D-Gluoose, das aus Stärkehydrolysaten mit hohem D.E.-Wert gewonnen wird. D-Glucose ist auch Bestandteil von Glucosenirup und Trockenglucosesirup mit hohem und mittleren D.E.-Werten. In den nachfolgenden Ausführungen wird der Begriff "Dextrose" für das reine kristallisierte Monosaccharid D-Glucose und der Begriff "Glucose" als Bestandteil D-Glucose von Stärkehydrolysaten in Sirup- und Trockenform verwendet.

Fructose und Laevulose. Die Begriffe "Fructose" und "Laevulose" werden in der Literatur im allgemeinen synonym angewendet und beziehen sich auf da:s Isomere der D-Glucose, dan süsser als Dextrose ist. Das Isomere kommt im Honig und im Invertzucker zusammen mit vor, er, iut wertvoll wegen seiner grosoen Süssigkeit.

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Entsprechend dem Begriff "Dextrose" sollte auch der Begriff "Laevulose" für das reine kristallisierte Monosaccharid D-Fructose reserviert bleiben. In den nachfolgenden Ausfüllungen wird deshalb die Bezeichnung "Fructose" für den Gehalt an D-Fructose in isomerisierten Stärkehydrolysaten angewendet.

Das verwendete Enzym. Das Enzym, welches D-Glucose zu D-Fructose isomerisiert, ist in der Literatur mit verschiedenen Namen bezeichnet worden. In dem Marshall- Patent ( US-Patent 2 950 228) ist es als Xylose-Isomerase benannt worden, weil es Xylose zu Xylulose isomerisiert. Es hat aber auch die Eigenschaft, D-Glucose zu D-Fructose zu isomerisieren. Aus diesem¹ Grunde ist es in der Literatur auch als Bextrose-Isomerase und Glucose-Isomerase bezeichnet worden. In den folgenden Ausführungen wird aus Gründen der historischen Entwicklung die Bezeichnung "Xylose-Isomerase" verwendet werden.

Enzym-Zubereitung. Die Bezeichnung "Enzym-Zubereitung" wird für jede stoffliche Zusammensetzung verwendet, die sich durch die gewünschte Aktivität an Xylose-Isomerase auszeichnet. Es kann sich dabei beispielsweise um lebende Zellen, um getrocknete Zellen, um Zellextrakte und um raffinierte konzentrierte Zubereitungen aus den Zellen handeln. Enzym-Zubereitungen können sowohl in trockener als auch in flüssiger Form vorliegen.

Einheiten. Alle Teil- und Gewichtsangaben in den folgenden Ausführungen geben Gewichtsprozente an, sofern nicht etwas anderes gesagt wird.

Isomerase-Einheiten. Ein« Isomerase-Einheit wird als die Menge Enzymaktivität definiert, die erforderlich ist, um 1 Mikromol Fructose je Minute unter den nachfolgend unter der Überschrift "Bestimmung der Isomerase-Aktivität" beschriebenen Isomerisierungsbedingungen zu erzeugen.

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Streptomyces. Diese Bezeichnung wird für eine Gattung von Mikroorganismen der Actinomycetales-Arten gebraucht. Bei diesen Mikroorganismen handelt es sich um aerobe mycelbildende Actinomyceten. Die Gattung ist gut definiert. Einige ihrer wichtigen unterscheidenden Eigenschaften werden in dem Buch " The Actinomycetes" von Selman A. Waksman, Verlag The Ronald Press Company, New York 1967, S. 135 u.ff. beschrieben.

Wie nunmehr gefunden wurde, ist es möglich, Xylose-Isomerase-Enzymzubereitungen technisch herzustellen, wenn man in einem Nährmedium einen Mikroorganismus der Gattung Streptomyces züchtet, für den seine Fähigkeit, eine beachtliche Menge Xylose-Isomerase zu erzeugen, wenn er in einem Nährmedium kultiviert wird, das frei von Xylose und xyloselieferndem Material und das im wesentlichen frei von Kobalt ist, charakteristisch ist.

Bevorzugte Mikroorganismen sind mutierte Stämme von Streptomyces olivochromogenes, insbesondere S. olivochromogsnes ATCC Nos. 21 713 ι 21 714, 21 715 und ihre Äquivalente. Diese Mikroorganismen haben die erforderlichen funktioneilen Eigenschaften, beachtliche Mengen Xylose-Isomerase zu erzeugen, wenn sie in einem Nährmedium kultiviert werden, das frei von Xylose und xyloselieferndem Material und frei von zugesetztem Kobalt ist. Obwohl diese spezifischen Mikroorganismen bevorzugt werden, wird angenommen, dass sich jeder Mikroorganismus der Gattung Streptomyces mutieren lässt, um einen Stamm mit den gewünschten Eigenschaften zu erhalten.

Obwohl es in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung möglich ist, geeignete Enzymzubereitungen in technische» Massstab durch Kultivierung von ausgewählten Mikroorganismen in einem Nährmedium, das frei von Xylose und xyloselieferndem Material und im wesentlichen frei von Kobalt ist, herzustellen, werden im allgemeinen bessere und wirtschaftlicher« Ergebnisse erhalten, wenn Xylose, Kobalt oder beides in dem Nährmedium, in dem der bevorzugte Mikroorganismus kultiviert wird, vorhanden sind.

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Herstellung der mutierten Stämme

Es wurde ein Stamm S. olivochromogenes ATGG 21 114 ausgewählt, weil er als gute Quelle für Xylo.se-Isomerase bekannt war.

Dieser Mikroorganismus wurde im Spörenzustand mit einer Dosis ultravioletten Lichts bestrahlt, die ausreichend war, um 97 $ der bestrahlten Mikroorganismen abzutöten. Die bestrahlten Sporen wurden auf einer Platte ausgestrichen, und jede Kolonie wurde hinsichtlich ihrer Enzymaktivität geprüft. Da das Medium, auf dem die Kolonien gewachsen waren, keine Xylose enthielt, um die Bildung des Isomerase-Enzyms zu induzieren, zeigte lediglich die Kolonie, die die gewünschten Eigenschaften hatte, eine positive Enzymreaktion. Diese Kolonie wurde isoliert und eingehend geprüft, um zu zeigen, dass der neue mutierte Stamm tatsächlich beachtliche Mengen Xylose-Isomerase produzierte, ohne dass er im Nährmedium Xylose als Induktionsmittel benötigte.

Die Schritte, die im einzelnen bei diesem Verfahren vollführt wurden, waren im einzelnen wie folgt ι S. olivochromogenes ATGG 21 114 wurde auf Difco-Stärke-Agar mit 2 # Agar gezüchtet, bis die Kultur völlig in den Spörenzustand übergegangen war. Diese Sporen wurden dann gewonnen und in 20 ml einer 0,1 $igen Lösung des oberflächenaktiven Mittels Tween 80 ( Handelsname für ein Polyoxyalkylen-Derivat von Snrbitanoleat, Hersteller Atlas Powder Go.) suspendiert. Dann wurde 0,1 ⁰Jo eines Dispersionsmittelij, Marasperse G (Handelsname für ein Ligninsulfonsäure-Dispersiorii;niittel, Hersteller Marathon Paper Mills Co.), zugesetzt, und die Suspension wurde mit zwei Stössen von 15 Sekunden beschallt, um Ketten und Klumpen der Sporen zu zerteilen. Die erhaltene Sporensuspencion wurde untersucht und erwies sich alü relativ frei von Sporenketten.

Die Sporerii$uf5jjenuion wurde in einer flachen Schale unter Rühren den Strahlen einer ultravioletten Lichtquelle, einer Westinghouoe 'Jtori] amp T^-¹H-IO uujir.eu-t::·!., utid zwar in einem Abstand von 10,16 cm für otwa- 8 Mi nut im. Durch die ßeutrahlung wurden

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97 # der Sporen abgetötet. Die Suspension wurde dann verdünnt, und bei einer geeigneten Verdünnung, die etwa 100 Kolonien je Platte ergab, auf Petrischalen übertragen, die das folgende Medium enthielten: ■

Tabelle 1: Agar-Medium

15 D.E.-Trockenglucosesirup 1,0 i»

Difco-Hefeextrakt 0,05 #

Difco-Bactöpepton 0,05 f»

Difco-Bactotrypton 0,05 #

Agar 1,5 $> pH auf 7,5 mit NaOH

Je Platte wuchsen etwa 40 bis 80 Kolonien, die daraufhin isoliert wurden. Die isolierten Kolonien wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Xylose zu isomerisieren, geprüft, nachdem sie auf einem Medium gewachsen waren, das weder Xylose noch ein xyloseliefemdes Material enthielt.

Isolierung und Fermentation mit der Mutante

Es wurde eine Kolonie isoliert, welche während des Wachstums in Abwesenheit von Xylose Isomerase-Aktivität produzierte. Die erzeugte Isomerase-Aktivität wurde zu 0,155 Einheiten je ml ermittelt. Nach einer zweiten Übertragung war die Aktivität auf 0,6 Einheiten/ml angestiegen.

Die Kultur wurde dann mehrmals übertragen und zur erneuten Isolierung ausgestrichen. Elf Kolonien wurden ausgewählt, auf Schrägplatten wachsen gelassen und dann über zwei Impfstufen wachsen gelassen. Die elf Kolonien wurden dann dazu verwendet, um zwei Kulturmedien, die weiter unten näher definiert und als Medium A und Medium B bezeichnet werden, damit zu beimpfen. Vergleichsweise wurde auch ein Impfmaterial von der Stammkultur S. olivochromogenes ATCG 21 IH dafür verwendet, um damit die gleichen beiden Kultur-

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medien zu beimpfen.

Das angewandte Verfahren und die Beobachtungen, die dabei gemacht wurden, werden nachfolgend im einzelnen beschrieben.

Das für die beiden Impfstufen verwendete- Medium hatte die in
Tabelle 2 angegebene Zusammensetzung :

Tabelle 2: Medium für die erste und zweite Impfstufe

15 D.E.-Trockenglucosesirup 1,0 $

Maisquellwasser ( 55 i° Feststoffe) 3,6 i»

MgSO₄. 7 H₂O 0,05 1°

GoGl₂.6 H₂O 0,024 1°

pH auf 7,0 mit NaOH, 1 Tropfen Antischaummittel Je
Kolben

Die erste Impfstufe wurde zwei Tage lang mit 100 ml des Medium; in Jedem der erforderlichen Anzahl an 500 ml-Erlenmeyer-Kolben durchgeführt, wobei eine gelegentlich schüttelnde Apparatur bei 28⁰G verwendet wurde. Es wurden Sporen'von jeder einzelnen
Schrägplatte dazu verwendet, um Jeden dieser Kolben anzuimpfen.

Die zweite Impfstufe wurde dann einen Tag lang mit 200 ml des Mediums in Jedem der erforderlichen Anzahl an 1000 ml-Hinton-Kolben durchgeführt, wobei ein Gump-Drehshaker bei 28⁰G verwendet wurde. Mengen von 10 ml der ersten Impfstufe wurden zum Beimpfen der Kolben der zweiten Impfstufe verwendet.

Je 5 ml des Materials von den zweiten Impf stuf en wurden uanri zuu Beimpfen von Kulturmedien der folgenden Zusammensetzung verwendet (Tabelle 3):

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Tabelle 3: Kulturmedien A und B

Medium A

15 D.E.-Trockenglucosesirup 2,0 $

Maisquellwasser ( 55 °ß> Peststoffe) 3,6 $ NII₄NO₃ 0,2 i»

Glycin . 0,3 S*

MgSO₄.7H₂O 0,05 #

GoCl₂.6H₂O 0,024 $

pH auf 7,0 mit N_aOH

Medium B

Xylose 2,2 ^

15 D.E.-Trockenglucosesirup 1,2 "/> Maisquellwasser ( 55 # Feststoffe) 3,6 i»

NH₄NO₃ . 0,2 #

Glycin 0,2 #

MgSO₄.7H₂O 0,05 #

CoGl₂-GH₂O 0,024 f pH auf 7,0 mit NaOH

Für die fermentation wurden je 100 ml des jeweiligen Kulturmediums in jeden der erforderlichen 1-Liter Hinton-Kolben gegeben. In jeden Kolben wurde 1 Tropfen Antischaummittel gegeben. Dann wurden die Kolben sterilisiert und gekühlt. Nach dem Beimpfen gelangten die Kolben in einen Gump-Drehuhaker und wurden 2 Tage lang bei 2O⁰C gehalten.

!isolierung der Enzymzubereitung

Nach der Permon tation wurde der Inhalt jeden Kolbens 15 Minuten lang beil der LO OUO-fachen ülrdbeachLeim Igung zentrifugiert. Dann wurde die Zel.linass« abgetrennt, guwoguri und zur Lagerung eingefroren.

3 0 '■) Ü 12 / i I b Ij

Zur Untersuchung oder zur Verwendung wurde die Zellmasse oder eine bestimmte Menge von ihr mit destilliertem Wasser auf ihr Originalvolumen verdünnt, und die Zellen wurden erneut suspendiert. Nachdem sie sich rekonstituiert hatten, wurde die Zellsuspension in der nachfolgend beschriebenen Vl/eise untersucht.

Überführung der Zellsuspension in löslichen Zustand

Um das Enzym für die Untersuchung brauchbar zu machen, ist es zunächst erforderlich, es in löslichen Zustand zu überführen. Eine geeignete Methode, um dies zu erreichen, ist die Beschallung.

Zellen von bekanntem Volumen der Kulturbrühe werden erneut suspendiert in 0,05-molarer Phosphatpufferlösung ( pH 7,5 ). Die Suspension wird dann unter Verwendung eines Branson Sonifiers, Modell 185-D (20 kc) beschallt, bis die mikrobiologischen Zellen der Probe genügend zerstört sind, um das Isomerase-Enzym im wesentlichen in Freiheit gesetzt ist. Durch Kühlen des Probenrohres in einem Eisbad während der Beschallung wird ein Überhitzen und eine Inaktivierung des Enzyms vermieden.

Die erhaltene Enzyinzubereitung war eine ^osung von in Lösung gebrachter Xylose-Isomerase.

Prüfung der Isomerase-Aktivität

Das Prüfungsverfahren beruhte auf einer spektrophotometrischen Bestimmung der Ketosen, die am; einer Glucoselösung unter standardisierten Bedingungen gebildet wurden.

Es wurde eine StammlöGung folgender Zusammensetzung angesetzt (Tabelle 4).

Zunächst wurde die Enzymzubereitung, die untersucht werden sollte, soweit v< rdurint, da:is sie 1 bis b Ifjomerase-Einheiten Je ml enthielt.

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Tabelle 4: Stammlösung für die Prüfung

Bestandteile Menge

O, l-m-MgSO₄.7H₂O 1 ml

O,Ol-m-G0Gl₂.6H₂O 1 ml

1-m-Phosphatpuffer, pH 7,5 0,5 ml Dextroseanhydrid 1,44 g

Destilliertes Wasser um auf ein Gesamtvolumen von 7t5 ml aufzufüllen

Es wurde eine enzymatisch^ Isomerisierung in der Weise durchgeführt, dass 1 ml der Enzymzubereitung zu 3 ml der Stammlösung hinzugefügt wurde. Dann wurde 30 Minuten bei 60⁰G inkubiert. Bei Beendigung der Inkubationszeit, wurde 1 ml durch 9 ml einer 0,5-n-Perchlorsäure inaktiviert. Die aliquote inaktivierte Menge wurde dann auf ein Gesamtvolumen von 250 ml verdünnt. Als Kontrolle wurde für Vergleichszwecke auch eine reine Glucoselösung untersucht, wobei zu Beginn der Inkubationszeit anstelle der Enzymzubereitung 1 ml Wasser zugesetzt wurde.

Dann wurde der Gehalt an Ketosen nach einer Cystein-Schwefelsäure-Methode bestimmt. Bei der Auswertung der Ergebnisse wurde eine Isomerase-Einheit als die Menge Enzym-Aktivität definiert, die erforderlich ist, um unter den beschriebenen Isomerisierungsbedingungen ein Mikromol Fructose je Minute zu erzeugen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengestellt worden.

Für die weitere Untersuchung wurden die Mutanten-Stämme GPC3, CPC4 und GPG8 ausgewählt. Eine Woche nachdem die erwähnten Ergebnisse vorlagen ( Tabelle 5) » wurde jede dieser 3 Mutanten dazu verwendet, um erneut die beiden Kulturmedien zu beimpfen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefasst worden.

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Tabelle 5: Kultur

Versuchsergebnisse

Medium A (ohne Xylose)

Isomerase- Trocken-Aktivität zellgewicht

( E/ml) (g/Liter)

Medium B (	mit Xylose)
Isomerase-	Trocken
Aktivität	zellgewicht
( E/ml)	(g/Liter)
7,46	8,75
6,63	9,32
2,73	8,81
5,51	5,82
3,72	5,39
3,00	9,58
5,37-	8,08
3,54	6,93
2,70	7,17
3,46	5,99
5,50	8,08
2,16	10,27
6,05	7,14

Aus gangsstamm Ausgangsstamm

Mutante Mutante Mutante Mut: aite Mutante Mutante Mutanti;· Mutante Mutante Mutante Mutante

GPC GPC GPG GPG GPG CPG GPGlO GPGIl GPGl 2 GPGl 3 GPCl 4

0,24	6,45
0,04	6,56
5,48	6,87
2,06 .	6,44
3,02	5,87
1,45	6,66
3,11	6,45
1,95	6,52
2,14	6,72
1,58	6,33
2,88	7„27
2,05	. 7,33
2,37	7,17

Tabelle 6; Versuchsergebnisse nach nochmaligem Beimpfen

Kultur

Medium A (ohne Xylose)

Isomerase- Trocken-Aktivität zellgewicht

( E/ml ) ( g/Liter )

Medium B (mit Xylose)

Isomerase- Trocken-Aktivität zellgewicht

( E/ml) ( g/Liter)

Mutante CPC3	4	,80	5	,39	11,	42
Mutante CPG4	5	,70	6	,44	9,	68
Mutante GPG8	2	,97	6	,10	4,	43

7,53 7,30 6,39

Diese Untersuchungsergebnisse bestätigten, dass die Mutanten die Fähigkeit hatten, Xylose-Isoiuerase zu produzieren, ohne dass als Beatandteil des Nährmediums Xylose erforderlich war..Wie ausserdem beobachtet wurde, produzierten einige Kulturen deutlich mehr Enzym als der AusgangsuLamm, wenn sie in einem xylosehaltigen Kulturmedium zum Wachsen gebracht wurden. Diese Eigenschaft ist für die technische Herstellung äusserst wichtig, weil grössere Produk-

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-M-

W 22Λ5Α02

tivität bedeutet, dass weniger Fermenter-Kapazizät für eine bestimmte Menge Enzymproduktion erforderlich ist.

Wirkung der Kohlenhydratquelle im Kulturmedium

Um die Wirkung der Kohlenhydratquelle im Kulturmedium zu zeigen und gleichzeitig die Fähigkeit des mutierten Stammes CPG 3 , Enzym zu produzieren, wenn er in Gegenwart verschiedener Kohlenhydrate als einziger Kohlenstoffquelle kultiviert wird, zu demonstrieren, wurden verschiedene ausgewählte Stämme von Streptomyces kultiviert. Das Kulturmedium war in jedem Fall identisch, mit Ausnahme des Kohlenhydrats. Alle übrigen Bedingungen wurden konstant gehalten. Über die Ergebnisse wird in Tabelle 7 berichtet.

Tabelle 7: Wirkung der Art des Kohlenhydrats auf die Isomeraseproduktion mit Streptomyces-Kultüren

Organismus Glycerin Mannose Glucose 15 D.E.- 15 D.E.-

( 2ß> ) ( 2ji ). ( 1,5'^) Stärkehy- Stärkehydrolysat drolysat ( 2J6 ) ( 1°A )

XyI öse (i/o)

Glucose-Iiiiomerase-Aktivi tat ( Einheit en/ml)

S.	phaeochromogenes NRRL B 2119		_		0,3	0,2	1.4
S.	griseoruber	0,	4	0,4	0,3	0,2	4.5
S.	olivochromogenes ATGO 21 114	1,	3	1,9	0,2	0,2	3,4
S.	olivochromogenes Mutante GPG 3			2,2	2,3	6,3

Wie diese Beobachtungen zeigen, produzierten die Stämme mit Ausnahme des mutierten Stammeu UPG 3 sehr wenig Enzym, wenn sie in den Medien, die keine Xylose enthielten, kultiviert wurden. Demgegenüber produzierte die Mutante in Abwesenheit von Xylose reichliche Mengen Enzym und ebenfalls grösnere Mengen in Gegenwart von Xylose.

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■Kennzeichnung der Mikroorganismen

Um die Mikroorganismen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung Verwendung finden, im Detail zu kennzeichnen, werden die folgenden Einzelheiten mitgeteilt. Dabei erfolgt die Beschreibung der Eigenschaften in einer Form, die ähnlich ist der Beschreibung der Gattung Streptomyces der Actinomycetales in Bergey¹s "Manual of Determinative Microbiology", 7. Auflage.

Die erste Beschreibung bezieht sich auf den Ausgangsstamm, von dem die Mutanten abstammen. Die weiteren Beschreibungen betreffen zwei mutierte Stämme, GPG 3 und GPG 15? die bevorzugt für die Verwendung im Rahmen der Erfindung geeignet sind. Stamm CPG 15 stellt eine Einzelkolonie dar, die aus Stamm GPG 3 isoliert wurde.

Streptomyces olivochromogenes, ATGG 21 114 ( Ausgangsstamm)

Luftmycel : Fäden mit Mittleren bis geschlossenen Spiralen. Gonidien ellipsoidisch bis uphärisch«

G elatine-Stichkultur s Gutes Wachstum«, Verflüssigung innerhalb

von 10 Tagenο

A^ar s Runzeliges, bräunliches bis graues Wachstum«, Bildung von "braunem bis braun-schwarzem löslichem Pigment,»

Synthetischer Agar : Weisses Luft- und Oberflächenmycel«, Keine

Pi guierit bildung»

S tarkeagar : Reichliches Wachstum in gelber !''arbe» Stärke wird hydrolysiert«,

<}:iucoseagar : Reich} iclies Wachstum in bräunlicher bis grauer bis dunkelgrauer Farbe»

Lackmusmilch : Dunkelbrauner Ring! schnelle Ausflockung.

Kartoffelscheiben : Reichliches Wachstum in weisser Farbe» Bildung

von löslichem braunem bis schwarzem Pigment.

Bildet Kitrite auu Nitraten .

Aerob.

Gutes Wachstum bei 28 Mu 37⁰G.

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- Streptomycei olivochromogenes, Mutante OPC 3

Luftmycel t Fäden mit mittleren bia geschlossenen Spiralen. Conidien ellipBOidisch bis sphärisch.

Gelatine-Stichkultur : Geringes Wachstum in 30 Tagen} anscheinend keine Verflüssigung.

Agar ; Runzeliges, bräunliches bis graues Wachstum. Bildung von braunem bis braun-schwarzem löslichem Pigment.

Synthetischer Agar s Weisees Luft- und Oberflächenmyoel. Keine

Pigmentbildung.

Stärkeagar : Kein Wachstum! Stärke wird nicht hydrolysiert.

Glucoaeagar : Reichlichts Wachstum in bräunlicher, grauer bis dunkelgrauer Farbe.

Glucosebouillon t Dünnes braunes Wachstum, flockiges Sediment,

Lackmusmilch j Dunkelbrauner Ring ; Ausflockung bei 37⁰C , geringe Ausflockung bei 28 C.

Kartoffelscheiben : Reichliches Wachstum. Bildung von löslichem

braunem bis schwarzem Pigment.

Bildet Nitrite aus Nitraten.

Aerob.

Gutes Wachstum bei 28 bis 37⁰C.

StreptomyoeB olivochromogenes, Mutante CPC 15

Luftmycel t Jaden mit mittleren bis geschlossenen Spiralen. Conidien ellipsoidisch bis sphärisch.

'Gelatine-Stichkultur : Geringes Wachstum in 30 Tagen* anscheinend keine Verflüssigung.

Agar : Runzeliges, bräunliches bis graues Wachstum. Bildung von '"" braunem bis braun-schwarzem löslichem Pigment.

Synthetischer Agar i Weiases Luft- und Oberflächenmycel. Keine

Pigmentbildung.

Stärkeagar : Reichliches Wachstum ; Stärke wird hydrolysiert.

Glucoseagar : Reichliches Wachstum in bräunlicher, grauer bis dunkelgrauer Farbe.

GlucoBCbouillon ι Dünnes braunes Wachstum, flockiges Sediment.

Lackmusmilch : Dunkelbrauner Ring ; Ausflockung bei 37⁰C, geringe Ausflockung bei 28⁰G.

Kartoffelscheiben : Reichliches Wachstum. Bildung von löslichem

schwarzem Pigment.

Bildet Nitrite aus Nitraten.

Aerob.

Gutes Wachstum bei 28 bis 27⁰C.

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Die nachfolgend aufgeführten mutierten Stämme wurden "bei der American Type Culture Collection hinterlegt und werden dort auf Grund eines Vertrags zwischen der Collection und der Änmelderin dieses Patentes aufbewahrt" ( Tabelle 8).

Tabelle 8 : . Hinterlegte Stämme

Mutierter Stamm Kr. Kiiltur-₈Hinterlegunga_>«Hr_!._i

CPC 3 · 21 ?13

CPC 4 21 714

CPC 15 21 715

Die American Type Culture Collection hat die folgende Anschrift;

American Type Culture Collection 12301 Parlclawn Drive
Rockville, Maryland 20852

Der Vertrag mit der Cultur Collection sieht vor, dass die Kulturen der Öffentlichkeit ständig zur Verfügung stehen, wenn das Patent erteilt wird. Die Anmelderin des Patents hat zugestimmt, während der Laufdauer des Patents die Kulturen durch lebende Kulturen der gleichen Organismen zu ersetzen, sofern eine der Kulturen während der Lagerung abstirbt.

Kennzeichnung des Enzyms

Es wurde eine Bestimmung der Michaelis-Konstanten ( Km ) für die Umsetzung von Xylose und von Glucose durchgeführt.

Ea war beabsichtigt, zu zeigen, welche relativen Affinitäten der Enzymzubereitung für diese Substrate vorhanden sind. Bisher sind alle Isomerasen, die untersucht wurden und die Glucose direkt in Fructose umwandeln, Xylose-Jsomerasen. Die Bestimmung wurde unter Verwendung beschallter Extrakte der Kulturen durchgeführt.

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Wie gefunden wurde, war die erhaltene Km niedriger, wenn die Enzymzubereitung auf Xylose einwirkte als wenn sie auf Glucose einwirkte« Hierdurch wurde sichergestellt, dass Xylose das natürliche Substrat der Isomerase , und dass das Enzym eine echte Xylose-Isomeraae ist.

Die Eigenschaft der Xylose-Isomerase , die von den Mutanten der vorliegenden Erfindung gebildet wird, Glucose als Substrat anzunehmen, ist vermutlich auf die strukturelle Ähnlichkeit der Xylose und Glucose zurückzuführen. Da die Mutanten das Isomerase-Enzym sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Xylose produzieren, wird die Ennymbildung eher konstitutionellbedingt als notwenig in dem Kulturmedium durch Xylose induziert. Wenn das Kulturmedium Xylose enthält , kann die Enzymbildung sowohl konstitutionsbedingt als auch induziert sein.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie hierdurch zu beschränken.

BEISPIEL 1 Enzymproduktion durch den mutierten Stamm GPQ 3

Dieses Beispiel erläutert die Herstellung von Isomerase entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrene.

Sporen von einer Schrägkultur des mutierten Stammes GPC 3 wurden auf einen 500 ml-Erlenmeyerkolben überimpft, der 100 ml eines sterilen Mediums enthielt, das in Tabelle 9 beschrieben wird.

Das pH des Kulturmediums wurde auf etwa 7»1 mit Natriumhydroxid eingestellt und 30 Minuten bei 121⁰O sterilisiert. Der Kolben wurde beimpft und dann etwa 60 Stunden bei einer Temperatur von etwa 28⁰O bebrütet und gleichzeitig auf einer Schüttelmaschine mit 120 Perioden je Minute gesohüttelt.

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Tabelle 9 : Zusammensetzung des Mediums für die Impfmasse⁴ "'

Bestandteile Gew.-$

15' D.E.-Trockenglucosesirup 2,0

Maisquellwasser ( 55 $ Peststoffe} 3,6

Magnesiumsulfat ( MgSO₄.7 Ii₂O) ■ 0,05

Destilliertes Wasser auf 100

⁺ 'Das Kulturmedium ist eine wässrige Lösung, bei der sich alle Proζentangaben einschliesslich des Wassers auf Gewicht beziehen.

Pur die zweite Entwicklungsstufe wurde eine Menge von etwa 200 ml eines sterilen Kulturmediums, das die Zusammensetzung entsprechend Tabelle 9 hatte, in je 1000 ml nach Hinton modifizierte Erlenmeyer-Kolben gegeben. Es wurde dann eine Menge von 10 ml dem 500 ml-Erlenmeyerkolben entnommen und auf den . Einton-Kolben übertragen. Der beimpfte Kolben wurde auf einem Gump-Drehshaker bei 224 Perioden je Minute und bei einer Temperatur von etwa 28⁰G 48 Stunden lang bebrütet.

In einer dritten Entwicklungsstufe irardea 4 Mter äes in Tabelle 9 beschriebenen Kulturmediums in einen 7 1/2 Liter-Tischferment er eingebracht und etwa 30 Minuten "bei etwa 121⁰G sterilisiert. Der Tischferment er wurde mit Material aus dein 1000 ml-Schüifctelkolben beimpft und mit 4,0 Standardlitern Luft je Minute beschickt. Der Fermenter war mit einem !uhrwerk mit zwei Impellern von je 7_t62 cm Durchmesser ausgerüstet. Das Eührwerk arbeitete mit einer Geschwindigkeit τοη 500 Upm. Die Fermentation wurde 48 Stunden bei 28⁰G durchgeführt«,

Schliesslich wurde ein 40 Liter-Versuehsfermenter mit 30 Litern eines Kulturmediums beschickt, das entsprechend Tabelle 10 zusammengesetzt war, und ea wurde 30 Minuten bei etwa 121⁰G sterilisiert.

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Tabelle 10 : Zusammensetzung des Kulturmediums

Bestandteile Gew.-j6

I/i:iisquellwasser ( 55 $ Feststoffe) 3,6

Xylose · 1,0

15 D.E.-Trockenglucosesirup 2,0

Glycin 0,1

NH₄NO₃ 0,2

Der Versuchsfermenter wurde dann mit Material von dem Tisch-Fermenter beimpft und bei einem Druck von 1,05 kg/cm kontinuierlich mit 24,0 Standardljjern Luft je Minute beschickt. Der Permenter war mit einem Rührwerk mit zwei Impellern ausgerüstet, deren Blattdurchmesser 11,43 cm betrug. Das Rührwerk arbeitete mit einer Geschwindigkeit von 485 Upm. SitJNnitntation wurde 48 Stunden bei etwa 28⁰G durchgeführt.

Nach Beendigung der fermentation wurde in der Pementationsbrühe die Isomerase-Aktivität bestimmt und zu 10 bis 11 Einheiten/ml "ermittelt.

Der Enzym-Herstellungsprozess wurde dann wiederholt, wobei das Medium in dem 40 Liter-Permenter in der Weise modifiziert wurde, dass es an Stelle von 15 D.E.-Trockenglucosesirup Stärke enthielt. Dabei wurde Stärke in der gleichen Menge angewendet wie Trockenglucosesirup. Dieses Nahrmedium produzierte etwas geringere Mengen Enzym, weil der Organismus Stärke hydrolysieren musste. Die Endergebnisse zeigten hinsichtlich der Verwendung von Stärke an Stelle von Trockenglucosesirup keine Vorteile, soweit es die Enzymprodulttion betrifft.

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BEISPIEL 2 Enzymproduktion durch den mutierten Stamm CPQ

Das Verfahren zur Erzeugung von Enzym wurde entsprechend Beispiel 1, wie für die Mutante GPG 3 beschrieben, durchgeführt. Es wurde eine vergleichbare Menge Enzym gebildet, und es waren keine Anzeichen dafür vorhanden, dass der Ersatz von Trokkenglucosesirup durch Stärke im Nährmedium eine andere Wirkung auf die Enzymerzeugung ausübte als diejenige, dass in dem Nährmedium mit dem Trockenglucosesirup eine grössere Menge Enzym produziert wurde, wobei der Peak etwa 8 Stunden eher erreicht wurde. Bei allen 4 Fermentationen lag die Aktivität der Kulturbrühe im Bereich von etwa 10 bis etwa 11 Einheiten/ ml .

BEISPIEL 3 Enzymproduktion bei Änderung des Kulturmediums

und anderer Versuchsparameter

Um Kulturbrühen mit Isomerase-Aktivität zu erhalten, wurden weitere Fermentationsversuche durchgeführt.

Bei einigen dieser Versuche wurde das Kulturmedium in den 7 1/2- und 40-Liter-Stufen modifiziert. Für diese Versuchsreihe wurde ein Fermentationsmedium entsprechend der in Tabelle 11 angegebenen Zusammensetzung verwendet.

Tabelle 11 : Zusammensetzung des FermentationsmeiUums B Bestandteile$

Maisquellwasser 4,0

Xylose 1,0

Glycin 0,1

NH₄NO₃ 0,2

MgSO₄.7H₂O 0,05

Dextrose · 0,2

Stärke 2,0

Bei verschiedenen Fermentationsversuchen wurde das Medium in

der Weise verändert, dass geringe Mengen Zusatzstoffe, wie

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Maisquellwaßaer und Trockenglucosesirup, zusätzlich hinzugefügt wurden.

Bei allen dienen Fennentationen wurden Kulturbrühen mit zufriedenstellenden Mengen an Isoinerase-Aktivität erhalten, und zwar wurden dabei die beiden mutierten Stämme GPG 3 und GPG 4 verwendet. KeinStaiiün benötigte Kobalt im Medium, um die Enzymerzeugung zu vermehren, und beide Stamme produzierten Glucose-Isomerase in wesentlich grösseren Mengen als der Ausgangsstamm. Es wurden Enzymaktivitäten in Höhe von 15 Einheiten/ml erreicht, was wesentlich höher ist als die Aktivität, die im allgemeinen bei der Fermentation mit dem Ausgangsütamm zu erhalten ist.

BEISPIEL 4 Enzymatic-he Isomerisierung

Um die Wirkungsweise der Isomerase, die durch die mutierten Stämme produziert wird, hinsichtlich der Umwandlung von Glucose in Fructose zu demonstrieren, wurden verschiedene Konversionen durchgeführt. Die verwendete Enzymzubereitung bestand aus gefrorenen ganzen Zellen entweder der Mutante GPG 3 oder der Mutante CPG 4. Wie sich ergeben hat, bestehen hinsichtlich dieser beiden Enzymzubereitungen keine merklichen Unterschiede.

Es wurden Serien von Konversionen von 95 D.E.-Maisstärkehydrolysaten durchgeführt, wobei verschiedene Enzymdosierungen vorgenommen wurden. Die Konversionen wurden bei 70°ü und bei einem pH von 6,25 durchgeführt. Dem Hydrolysat wurde Magnesiumsulfat in einer 0,01 m-Menge zugesetzt. Der Trockensubstanzgehalt des Hydrolysate lag bei etwa 600 mg/ml. Während der Isomerisierung wurde das Hydrolysat unter Sticks Lof fatmoi.phäre gehalten, und das pH wurde erforderlichenfalls durch Titration aufrechterhalten. In dem Konveruionsreuktor wurde das Hydrolysat durch Stäbe gerührt, die durch einen magnetischen Rührmotor angetrieben wurden. Die Ergebnisse der Vertmclie uind in Tabelle 12 zumuiunengeatellt.

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is

Tabelle 12 :	Versuche mit ve	rs chi ed er	- 44	64 - 66 88-90
Zusatzmenge Einheiten/g	ien Enzymmengen ohne Kobalt	30,2".	35,2 38,1
	$ Umwandlung des 95 D.E.—Stärkehydrolysats in Ketosen, Konversionszeit in Stunden	35,6	40,4 43,0
0,8	16 - 18 40	37,5	41,3 42,0
1,0	17,7	40,1	43,4
1,2	21,9	41,0	43,2
1,4	24,7	43,2	45,2
1,6	26,0
2,0	28,1 '
33,4

Wie aus diesen Daten zu ersehen ist, reicht eine Enzymmenge von 1,0 Einheiten je Gramm aus, um ohne Kobalt in 66 Stunden soviel Fructose zu bilden, wie es 40 °/o Ketosen entspricht, und eine Enzymmenge von 1,4 Einheiten je Gramm ist ausreichend, um in 4 2 Stunden Konversionszeit 40 $ Ketosen zu erzeugen.

Weitere erfolgreiche Konversionsversuche wurden bei 65 G durchgeführt und bei etwss höheren pH-Werten. Über die Ergebnisse berichtet Tabelle 13.

Tabelle 13 : Konversion bei 65⁰C ohne Kobalt

pH Zusatzmenge Einheiten/g

"/ο Umwandlung des 95 D.E.-Stärkehydrolysats in Ketosen, Konversionszeit in Sunden

6,25	0,7
6,25	1,0
6,50	0,7
6/50	1,0
6,75	0,7
6,75	1,0

22

69

88

16,5	24,1	30,0	36,9
20,3	30,0	36,6	42,1
16,9	25,9	31,9	36,3
23,4	33,3	38,8	42,6
18,,9	28,2	33,6	37,2
22,1	30,1	36,0	39,5

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Die erhaltenen Ergebnisse lassen erkennen, dass die Anwendung der höheren Konversionstemperatur von 7O⁰G vorteilhafter ist, während die höheren pH-Werte offenbar keine Vorteile bringen.

Zunamiuenfasüend lässt sich sagen, dass-sich sehr zufriedenstellende siis3e Sirup-Erzeugnisse herstellen lassen, wenn die Konversionen bei 'Iu⁰G , bei einem pH von etwa 6,25 und bei einem Trokkensubstanzgehalt der Hydrolysate im Bereich von etwa 600 mg/ml bis 800 mg/ml mit einer Enzynuiienge von etwa 1,2 bis 1,4 Einheiten je Gramm bei einer Reaktionszeit von 40 bis 48 Stunden und in Gegenwart von etwa ü,ülm Magnesiumsulfat bei Abwesenheit von Kobalt unter Einleiten von Stickstoff durchgeführt werden. Es werden Zuaiimmensetzungen der in Tabelle 14 angegebenen Art erhalten :

'!'übel 1 e 14 : Süsgo Si rup-Erzeugnisse

Bestandteile Gew.-56, bezogen auf Trockensubstanz

Fructose 40 - 44

Glucose 45 - 50

Höhere Saccharide 7 - 8

Wie diese Daten zeigen, lässt sich ein Sirup mit 40 i» Fructose in wirtschaftlicher Weise aus einem 95 -D.E.-Stärkehydrolysat herstellen, wenn man Enzymzubereitungen verwendet, die sich von den erfindungsgemässen Mutanten ableiten, ohne dass dabei Kobalt zugesetzt werden muss.

Obwohl in den vorangehenden Ausführungen über die systematische Einordnung verschiedener Stämme von Mutanten von Mikroorganismen berichtet worden ist, wobei der Morphologie einige Aufmerksamkeit gewidmet wurde, liegt es offensichtlich Im Bereich fachmännischen Könnens, dass die Herstellung von physiologischen Mutanten mit morphologischen Änderungen verbunden istj die Änderung

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der biochemischen Aktivität bezieht sich Jedoch nicht auf eine spezifische morphologische Änderung. Offenbar lassen sich besondere Mutanten sowohl aus natürlichen Quellen als auch aus überlebenden Organismen, wenn die Organismen künstlichen mutagenen Mittfln ausgesetzt werden, isolieren.

Darüberhinaus kann offenbar innerhalb der Gattung Streptomyces der gleiche Mutanten-Typ aus verschiedenen Arten von Xylose-Isomerase-Erzeugern erhalten werden, und der Typ der Mutante, der bei der Behandlung mit mutagenen Mitteln erhalten wird, ist nicht von der Art des verwendeten mutagenen Mittels abhängig.

Obwohl im einzelnen über die systematische Einordnung eines Ausgangsstammes und zweier mutierter Stämme berichtet worden ist, die aus dem Aus gangs st amii. durch Ultraviolett-Bestrahlung erhalten wurden, werden durch die Beschreibungen der Mutanten nicht unbedingt alle Stämme, Varianten oder Sub-Mutanten der neuen Mutanten charakterisiert .. Auch unterscheiden sich die neuen mutanten Formen nicht unbedingt von anderen Stämmen von Streptomyces Qlivochromogenes.

Mutanten-Stämme von Mikroorganismen_P die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, lassen sich durch Heran·?- ziehen der folgenden Kriterien identifizieren s

1. Systematische Einordnung hinsichtlich der charakteristischen Eigenschaften der Gab bung Streptomyces.

2. Erzeugung von wenigstens 50 $> mehr und vorzugsweise doppelt so viel Xylose-Xsomerase-Aktivität wie durch Streptomyces olivochromogenes 21 114 unter identischen Bedingungen der Kultivierung und insbesondere unter den hler beschriebenen Bedingungen. ,,„._-.. ,

3» Erzeugung von nennenswerten Mengen an Xylooe-Isomerase beim Kultivieren in Nährmedieiij die frei von Xylose und xyloseliefernden Materialien sind.

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4. Außerdem zusätzlich Erzeugung von nennenswerten Mengen von Xyl.ose-IiJOincru.ue bei der huitivierung in IMährmedien, die frei von zugesetztem Kobalt sind.

Die bevorzugten mutierten Stumme be/.iehung iweise Mutanten— ΓΗ amine leiten sieh von S, olivochromogenea ab.

Die Bezeichnungen "eine StreptoiiiyceM-Mutante" und ein "mutierter ntannn von S. olivochroiuogenes" bzw. "ein Mutanten-Stamm von S. oLivochroinogenes", wie sie hier verwendet werden, sollen jene Kulturen von Mikroorganismen der Gattung Streptomyces einschliessen, welche durch die oben angeführten Kriterien zu identifizieren sind. Diese Begriffe umfassen deshalb auch natürlich vorkommende Varianten und künstlich erzeugte Varianten von Stämmen, die im Rahmen der Erfindung besonders charakterisiert werden und die ebenfalls durch die angeführten Kriterien zu identifizieren sind.

Die Enzymzubereitung, welche von den mutierten Stämmen von Mikroorganismen erzeugt wird» die im tiahinen der vorliegenden Erfindung verwendet worden können, kann im wesentlichen in jeder gewünschten Form vorliegen. Gute Isomoriuiei'ungsergebniase wurden beobachtet, wenn mit Alkohol entwässerte Zellen in einer Menge von etwa 1,3 Aktivitätsuinheiten je Gramm Trockensubstanz für die 1 irchführung der Konversion verwendet wurden. Wenn beispielsweise ein 30° Be-MaLastärkehydrolysat mit 95 D.E. mit einer Enzymmenge von 1,3 Ak ti vitatseinhei ten je ti ramm Trockensuba tanz bei 70⁰O unter Verwendung von mit ALkohol dehydratiaierten Zellen 46 Stunden bei pH b,23 konvertiert wurde, konnte in 37 Stunden ein Fructosegehalt von 40 /u erreicitt werden, und am Ende der Konversioriszei t betrug tier Fructose gehalt etwa 41 "/»» Das erhaltene nüsse LJLruperzeugnis liess sich leicht filtrieren und gut raffinieren.

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-Si-

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Auch andere Formen von Enzymzubereitungeii können v/irksam eingenetzt werden. Eine bevorzugte Form von Enzyiuzubereitung ist die Kulturbrülie, die auf kontinuierlichem Wege während der kontinuierlichen Konversion aus einem Fermenter abgezogen wird. Auf
diene Weise lanut ijjch eine sehr wirtschaftliche Produktion
technisch durchführen.

Die erfindungsgeiiiäss erhaltenen Enzymzubereitungen werden im
allgemeinen dafür verwendet, um Glucose bei einem pH im Bereich von etwa 6 bis etwa 7 und bei einer Temperatur im Bereich von
eW/a 60 bis etwa 70 U zu isomerisieren. Sie üben aber auch aussui'halb dieser Bereiche eine wirksame isomerisierende Wirkung
aus.

In der vorstehenden Buschreibung und in den Beispielen ist die
Isrfindung hinsichtlich spezieller Ausführungsformen beschrieben worden. Selbstverständlich sind im iiahmen der Erfindung weitere Abwandlungen möglich, soweit sie im Bereich fachmännischen Könnens liegen.

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Claims

" 2 2 A 5 A 0 2 Pate ntansprüche

1. Verfahren zur Herstellung einer XyIoseisomerase-Enzymzubereitung durch Züchten eines Mikroorganismus in einem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Genus Streptomyces oder eine Mutante davon, der bei Züchtung in einem von Xylose und Xylose lieferndem Material oder von Kobaltzusatz freiem Nährmedium zur Erzeugung einer beträchtlichen Menge an Xyloseisomerase befähigt ist, verwendet.

2. f. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge. kennzeich

net, daß ein Mikroorganismus verwendet wird, der eine beträchtliche Menge an Xyloseisomerase bei Züchtungen in einem Nährraedium erzeugt, das weder Xylose und Xylose lieferndes Material noch zugesetztes Kobalt enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus verwendet wird, der bei Züchtung in einem xylose- und/oder kobalthaltigem Nährmedium zur Erzeugung einer beträchtlichen größeren Menge Xyloseisomerase befähigt ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeich net, daß ein Mikroorganismus verwendet wird, der in einem xylosehaltigen Nährmedium eine beträchtlich größere Menge an Xyloseisomerase bilden kann.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ein Streptomyces olivochromogenes Stamm oder eine Mutante davon verwendet wird.

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6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß eine Mutante von S. olivochromogenes ATCC 21114 verwendet wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus verwendet wird, der unter identischen Züchtungsbedingungen mindestens 50 % mehr Xyloseisomeraseaktivität liefert als Streptomyces olivochromogenes ATCC 21114.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Organismus S. olovochromogenes

'atcC 21713, 21714 oder 21715 verwendet wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8j dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus eine natürlich auftretende Variante des Mutantenstammes verwendet wird.

10» Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorgmismus eine künstliche induzierte Variante des Mutantenstammes verwendet wird.

11, Xyloseisomerasezubereitung, hergestellt nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10.

12* Xyloseisomerasezubereitung nach Anspruch 11, hergestellt in einem Nährmedium, das Xylose und/odei Kobalt.enthält,

13. Xyloseisomerasezubereitung nach Anspruch 11 oder 12, hergestellt aus einem Mutantenstamm von S. olivochromogenes,

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14-, Xyloseisomerasezubereitung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, worin das Enzympräparat konstitutiv ist.

15. Xyloseisomerasezubereitung nach einem der Ansprüche 11 bis 13» worin das Enzympräparat wenigstens teilweise ein induziertes Enzympräparat ist.

16. Verwendung der Xyloseisomerasezubereitung nach einem der Ansprüche 11 bis 15 zur Isomerisierung von Dextrose durch Einwirkung des Enzympräparates auf eine Lösung, die Dextrose enthält.

17. Verwendung eines durch Züchtung von S. olivochromogenes ATCC 21713» 2171*·oder 21715 enthaltenen Xyloseisomerasezubereitung nach Anspruch 16.

18. Verwendung nach Anspruch 16 oder 1? zur Herstellung von Lävulose durch Mutieren eines Mikroorganismus der Streptomyces Genus durch Einwirkung eines mutagenen Mittels, Isolieren eines mutagenen Stammes des Mikroorganismus der befähigt ist, eine beträchtliche Menge Xyloseisomerase bei Züchtung in einem von Xylose und Xylose liefernden Material freien Näh__rmedium zu bilden, Fermentieren eines Nährmediums mit der Mutanten der Bildung von Xyloseisomerase und Isomerisieren der Dextrose mit dieser Isomerase zu Lävulose.

19· Verwendung eines Mikroorganismus von S. olivochromogenes nach Anspruch 18.

20. Verwendung eines Mikroorganismus der bei Züchtung in einem Xylose haltigen Nährmedium eine noch größere Menge an Xyloseisomerase bildet nach Anspruch 18, wobei die Fermentation in einem xylosehaltigen Nähnnediuo erfolgt.

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