DE2413939C3

DE2413939C3 - Verfahren zur Herstellung von Fructose und Sirups, die Fructose und Glucose enthalten

Info

Publication number: DE2413939C3
Application number: DE2413939A
Authority: DE
Inventors: Ludwig Dr. Degen; Nicola Dr. Oddo; Roberto Dr. Mentana Rom Olivieri
Original assignee: SnamProgetti SpA
Current assignee: SnamProgetti SpA
Priority date: 1973-03-22
Filing date: 1974-03-22
Publication date: 1979-05-31
Also published as: LU69675A1; DE2413939B2; FR2241617A1; DE2413939A1; CA1022097A; GB1457177A; BE812572A; NL7403951A; JPS49125588A; FR2241617B1; IT981540B; CH626918A5

Description

Süße Sirups werden weit verbreitet in der Nahrungsmittelindustrie verwendet. Diese Sirups enthalten im allgemeinen Saccharose oder Produkte, die Glucose enthalten, die durch Hydrolyse von Stärke erhalten werden.

Wird ein Sirup benötigt, der süßer ist als der aus Saccharose, so wird ein Sirup verwendet, der aus Invertzucker besteht.

Es ist bekannt, daß Glucose eine Inversion zu Fructose unter alkalischen oder sauren Bedingungen erfahren kann. Diese Methoden gelangten zu keinem wirtschaftlichen Erfolg, da bei der Inversion ein Teil der Glucose zersetzt wird und darüber hinaus das Produkt einen hohen Gehalt an anorganischen Salzen aufweist, die schwer zu entfernen sind.

Es gibt viele Arten von Mikroorganismen, die in Anwesenheit von Xylose Glucoseisomerase produzieren, wie beispielsweise Pseudomonas, Streptomyces, Aerobacter, Escherichia, Lactobacillus.

Es ist darüber hinaus bekannt, daß einige Streptomyces dazu befähigt sind, das Enzym Isomerase in Anwesenheit von Substanzen zu produzieren, die Xylane enthalten. Die Verwendung von Isomerase bzw. von Stämmen, die Isomerase erzeugen, ist jedoch mit Nachteilen verbunden. So steigt nämlich die Startgeschwindigkeit der Umwandlung von Glucose in Fructose proportional zu der Temperatur an und erreicht schließlich ein Optimum bei 65 bis 70°C. Bei einer derartigen Temperatur wird jedoch die Isomerase von mesophilen Mikroorganismen rasch desaktiviert.

Es wurde nun gefunden, daß es auch möglich ist, Fructose und Fructose und Glucose enthaltende Sirups durch Anwendung eines wärmebeständigen Enzyms herzustellen. Dieses Enzym läßt sich aus einem Bakterienstamm gewinnen, der bisher nicht als Quelle für Glucoseisomerase verwendet wurde.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von Fructose und Sirups, die Fructose und G lucose enthalten, auf enzymatische Weise, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Glucoseisomerase, die aus dem Stamm CBS 404.73 vom Genus Bacillus stearothermophilus erhalten wurde oder die Zellen dieses Stammes in Gegenwart von geringen Mengen von Mg⁺+-und Co⁺ +-Ionen verwendet.

Der erfindungsgemäß eingesetzte Stamm CBS 404.73 wurde beim Centraalbureau voor Schimmelcultures — Baarn (Niederlande), Oosterstraat 1, hinterlegt; er wurde aus heißem Sand von den Meeresstränden von Ischia isoliert und weist die nachfolgend aufgeführten Charakteristika auf:

Mikroskopische Morphologie:

Kleine Stäbchen von 0,6- bis 0,8mal 3 bis 5 Mikron; Bildung von kurzen Fasern bzw. Fäden, motil, gram-positiv (in alten Kulturen gram-labil), gequollene Sporenträger bzw. Sporenkapseln, ellipsoide terminale und subterminale Sporen, leicht anfärbbar (Z i e h I — N e e 1 s e η), dicke Wände. Makroskopische Morphologie:

Kolonien auf Agar-Nährboden von 1—3 mm Durchmesser; rund mit leicht eingedrückten Rändern; rauhe Oberfläche; graue Farbe im durchscheinenden Licht
Agar-Gel:

weite Hydrolysezone
Glucose-Agar-Schrägkulturen:

Sie wachsen auf einem Agar-Nährmedium ohne Glucose besser als auf einem Glucose enthaltenden Agar-Nährmedium.

Proteose-Pepton-Agar-Schrägkulturen vom pH-Wert 5:

kein Wachstum
Agar-Milch:

Hydrolyse

Biochemische Charakteristika:
sauer, ohne Gas von Glucose

lndol:

negativ
Voges-Proskauertest:

negativ
Hydrolyse von Gel und Casein:

positiv
Wachstumsbedingungen:

Sie wachsen gut bei 7O⁰C und wachsen nicht bei 36° C. Sie wachsen gut auf allen Laboratoriumsmedien, aerob (fakultativ anaerob).

Durch Vergleich der vorstehenden Charakteristika mit dem »Bergeys Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Auflage, gehören die erfindungsgemäßen Stämme zu

Familie	Bacillaceae
Genus	Bacillus
Species	Bacillus stearothermophilus

Gemäß der Erfindung werden die Zellen von Bacillus stearothermophilus, die in den enzymatischen Verfahren verwendet werden, unter aeroben Bedingungen in Kohlenstoff-, Stickstoff- und Mineralsalzquellen enthaltenden Kulturmedien bei einer Temperatur von 45 bis 70° C, vorzugsweise 55 bis 60° C, während einer Zeit von

10 bis 48 Std., vorzugsweise von 16 bis 24 Std., und bei einem pH-Wert von 6 bis 8. vorzugsweise bei pH 7, kultiviert.

Als Kohlenstoffquelle kann man Glucose, Pepton, Fleischextrakt und als Stickstoffquelle Natrium- oder

«> Kaliumnitrat, Ammoniumsalze, hydrolysierte Fleischderivate, Casein oüer Soja verwenden. Xylose und Kobaltchlorid können direkt zu dem Kulturmedium vor der Inoculation gefügt werden oder während oder am Ende des Wachstums der logarithmischen Phase. Die

·>> Induktionszeit kann von 8 bis 48 Std. variieren. Vorzugsweise werden Xylose und Kobaltchlorid in der letzten Phase des logarithmischen Wachstums zugesetzt.

Die am Ende der Fermentation gewonnenen Zellen können als solche oder als trockener Staub verwendet werden.

Andererseits können auch rohe oder gereinigte Extrakte dieser Zellen verwendet werden. Zu diesem Zwecke werden die Zellen nach einer der üblichen Methoden gebrochen, und es wird der rohe oder gereinigte, das Enzym enthaltende Extrakt verwendet

Die als Ausgangsmaterial beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Glucose kann entweder als wäßrige gepufferte Lösung, vorzugsweise mit 50% (Gew7Gew.), oder als Glucoselösung, die durch Behandlung von Stärke mit Ghicoamylase erhalten wurde, verwendet werden. Die Temperatur, bei der der Isomerisierungsprozeß durchgeführt wird, variiert von 30 bis 70° C, vorzugsweise von 60 bis 70° C; der pH-Wert von 5,0 bis 9,0, vorzugsweise etwa 7,5.

Das Enzym kann in dem Zellextrakt auf polarimetrischem Wege (bei 20⁰C, A=589nm) bestimmt werden, und die Proteine werden durch eine Differentialablesung bei 224 und 223 nm gegen eine Standradkurve bestimmt, die anhand einer bekannten Konzentration von Rinderalbumin aufgestellt wurde. Eine wichtige Abänderung des erfindungsgemäßen Verfahrens, die jedoch in den Rahmen der Erfindung fällt besteht darin, daß die Herstellung von Fructose und Sirups, die Fructose und Glucose enthalten, auf einem Fermentationswege erfolgen kann, bevor der Enzymextrakt von dem Kulturmedium abgetrennt wird.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung; aus ihnen lassen sich weitere Arbeitseinzelheiten entnehmen.

Beispiel 1

Es wurde ein Kulturmedium der folgenden Zusam mensetzung hergestellt:

Fleischextrakt

Pepton

Hefeextrakt

K₂HPO₄

KH₂PO₄

MgSO₄ χ 7 H₂O

MnSO₄ χ 5 H₂O

5 g/l 5 g/I lg/l 03 g/l 0,5 g/l 0,1 g/l 0,1 g/l

erhielt 03 g feuchte Zellen aus 100 ml Kulturmedium.

Diese Zellen wurden in 3 ml 0,05 m-Triäthanolamin-HCl-Puffer vom pH-Wert 8,5 suspendiert und im kalten Zustand 7 Minuten Ultraschallwellen ausgesetzt (MSE, 7 Mikron).

Die enzymatische Aktivität wurde in dem überstehenden Teil des wie vorstehend erhaltenen Produkts bestimmt 03 g feuchte Zellen enthielten 30 Enzymeinheiten, und die spezifische Aktivität betrug 1 (Enzymeinheit)/mg Protein.

Beispiel 2

Kulturmedien des Stammes 429, hergestellt gemäß Beispiel 1, wurden unter Rühren bei 50⁰C inkubiert

Nach 12 Std„ beginnend mit der Inoculation jedes Kolbens wurden 0,75 g Xylose und 0,01 g Kobaltchlorid zugesetzt. Nach weiterer 12stündiger Inkubation bei 50⁰C wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.

1,08 g feuchte Zellen wurden aus 100 ml Kulturmedium erhalten, die 530 isomeraseeinheiten enthielten. Die spezifische Aktivität des Rohprodukts betrug 3,6 (Enzymeinheiten)/mg Protein

B eispi el 3

300 ml Kulturmedium, hergestellt gemäß Beispiel 1, wurden zentrifugiert die gewonnenen Zellen (3,25 g) wurden in Einern 0,02-m-Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 gewaschen und anschließend erneut zentrifugiert und in 40 ml der folgenden Reaktionsmischung suspendiert:

Dabei wurden die vorstehenden Produkte in einem demineralisierten Wasser aufgelöst und der pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 7 gebracht

Das Kulturmedium wurde in 500 ml Weithalskolben gegossen, wobei in jeden Kolben 100 ml gefüllt wurden. Es wurde 20 Minuten bei 121°C sterilisiert Es folgte eine Inoculation mit einer Suspension des Stammes 429 ( = CBS 404.73), gewachsen während 12Std. bei 55° C auf einem Agar-Schrägmedium, in sterilem, destilliertem Wasser.

Die Inkubation wurde unter Rühren (220 UpM) bei 70⁰C durchgeführt. 6 Std. nach der Inoculation jedes Kolbens wurden 0,75 g Xylose und 0,01 g

CaCl₂ χ 6 H₂O

zugesetzt, und nach 5 weiteren Stunden Inkubationszeit wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen. Man

Glucose MgSO₄ χ 7 H₂O CoCl₂ χ 6 H₂O

1,13 m 5 χ ΙΟ-³m 10-« m

in einem 0,05-m-Phosphatpuffer vom pH 7,0.

Die Zellsuspension wurde unter leichtem Rühren bei 65°C inkubiert. Nach 18 Std. war eine 32,5%ige Umwandlung erzielt.

Die gleichen Zellen wurden erneut zur Isomerisierung einer gleichen Reaktionsmischung verwendet und ergaben nach 16stündiger Inkubation bei 65°C eine 14,5%ige Inversion.

Beispiel 4

3,25 g Zellen, hergestellt gemäß Beispiel 1, wurden in 4 ml eines 0,02-m-Phosphatpuffers vom pH 7,0 susp. und 15 Minuten Ultraschallwellen ausgesetzt Die zertrümmerten Teile wurden durch Zentrifugieren entfernt, und die überstehende Flüssigkeit wurde in destilliertem Wasser auf ein Volumen von 20 ml gelöst und zu 20 ml einer Lösung gefügt, die

Glucose MgSO₄ χ 7 H₂O CoCl₂x6H₂O

2,26 m 10-²m 5x 10~³m

in einem 0,04-m-Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 enthielt. Die Reaktionsmischung wurde unter leichtem Rühren bei 65⁰C inkubiert. Man erhielt nach 16 Std. eine w> 35%ige Umwandlung.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Fructose und Sirups, die Fructose und Glucose enthalten, auf enzymatische Weise, dadurch gekennzeichnet, daß man Glucoseisomerase, die aus dem Stamm CBS 404.73 vom Genus Bacillus stearothermophilus erhalten wurde oder die Zellen dieses Stammes in Gegenwart von geringen Mengen von Mg⁺ + - und Co ⁺ + -Ionen verwendet.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Reaktion bei einer Temperatur von 30 bis 70° C, vorzugsweise von 50 bis 70° C, durchgeführt wird.

3. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Reaktionsmediums von 5 bis 9 und vorzugsweise 7,5 beträgt.