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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von Glucose isomerisierendem Enzym durch aerobe Züchtung von Mikroorganismen und Isolierung des Enzyms.
Fructose wird allgemein für wesentlich süsser als Glucose gehalten. Glucose ist jedoch leicht aus billigen Quellen erhältlich. Daher besteht ein Bedarf nach einem praktischen und wirtschaftlichen Verfahren zur Umwandlung von Glucose in Fructose. Die Alkali-Isomerisation von Glucose in Fructose ergibt entweder eine geringe Ausbeute oder neigt zur Bildung unerwünschter Nebenprodukte in Ausbeuten von mehr als 40%. Eine Alternative zur Verwendung von Alkali stellt die Verwendung von Enzymen zur Bewirkung dieser Umwandlung dar, und es wurden bereits beträchtliche Versuche unternommen, dies in wirkungsvoller und dabei wirtschaftlicher Weise zu erreichen.
Es gibt mehrere Enzyme, die D-Glucose in D-Fructose über ein oder mehrere chemische Zwischenpro-
EMI1.1
sein. Aussichtsreicher sind Enzyme, welche D-Glucose direkt in D-Fructose umwandeln. Eine Anzahl sol- cherEnzyme wurde aus Mikroorganismen der Arten Lactobacillus, Pseudomonas, Pasteurella, Leuconostoc, Streptomyces und Aerobacter gewonnen (s. die Übersicht von Yamaka in Biochim. Biophys. Acta Bd. 154 [1968], S. 670 bis 680). Damit eine merkliche Menge Glucoseisomerase von irgendeinem der vorstehenden Mikroorganismen gebildet werden kann, muss Xylose oder Xylan im Züchtungsmedium vorhanden sein, um die Enzymbildung zu induzieren.
Reine Xylose ist verhältnismässig kostspielig, und wenn Xylan in dem Züchtungsmedium verwendet wird, muss der Mikroorganismus gleichzeitig auch Enzyme produzieren, die befähigt sind, das Xylan zu hydrolysieren.
Um die Umstände und Kosten der Züchtung des Mikroorganismus in einem Xylose oder Xylan enthaltenden Medium zu vermeiden, wurden die Bemühungen auf die Auffindung eines Bakteriums gerichtet, das das Enzym auf Grund seiner eigenen Konstitution erzeugt. Lee, Hayes und Long (USA-Patentschrift Nr. 3, 645, 848) fanden, dass gewisse Mikroorganismenstämme, die der Gattung Arthrobaeter angehören, imstande sind, Enzyme zu produzieren, welche Glucose oder Xylose direkt in die entsprechende Ketose überführen, wenn sie in einem Medium, das keine Xylose oder Xylan enthält, gezüchtet werden. Ungünstigerweise werden nur verhältnismässig kleine Mengen anisomerase erzeugt und das Züchtungsmedium benötigt relativ teuere Stickstoffquellen wie Hefeextrakt und Fleischprotein.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus der Gattung Actinoplanes in einem Kulturmedium, insbesondere Maisquellwasser, lösliche Brennereirückstände, Caseinhydrolysat, Sojabohnenhydrolysat, Pepton, Hefeextrakt oder Fischproteinhydrolysat züchtet und aus diesem ein Glucose isomerisierendes Enzym gewinnt.
Mikroorganismen der Gattung Actinoplanes wurden bisher noch nie für die Erzeugung von Glucose isomerisierenden Enzymen in Betracht gezogen. Die Untersuchung einer sehr grossen Zahl von ActinoplanesStämmen zeigte nun, dass diese Fähigkeit praktisch allen Vertretern dieser Gattung, wenn auch in verschieden hohem Masse, zuzukommen scheint.
Positive Ergebnisse wurden unter anderen mit folgenden Stämmen erzielt : Actinoplanes missouriensis
EMI1.2
sp. ATCC 23342, Aetinoplanes brasiliensis ATCC 25844, Actinoplanes italicus ATCC 27366.
Ausserdem wurde gefunden, dass Mikroorganismen der Gattung Actinoplanes bei der Züchtung in einem Medium auch in vollständiger Abwesenheit von Xylose und Xylan befähigt sind, Glucoseisomerase zu erzeugen. Dadurch können verhältnismässig grosse Mengen an Glucoseisomerase durch Aetinoplanes in einem Medium erzeugt werden, das aus Maisquellwasser, Salzen und Leitungswasser besteht. Das Enzym zeigt einen hohen Grad von Wärmebeständigkeit, indem Temperaturen in einer Höhe von 80 bis 85 C bei der Isomerisation angewendet werden können, ohne merklichen Verlust an Aktivität. Zur Durchführung der Isomerisation können ganze Zellen oder zellfreie Extrakte verwendet werden.
Vorratskulturen werden im allgemeinen in einem Medium gezüchtet, das Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff (gewöhnlich Maisquellwasser) und anorganische Salze enthält. Das Inoculum kann durch Züchten des Organismus in diesem Medium in einer rotierenden Schütteleinrichtung bei ungefähr 25 bis 300C in Gegenwart von Luft im Verlauf von 1 bis 2 Tagen hergestellt werden. Das Inoculum, das 3 bis 10% des Endvolumens im Fermenter entspricht, wird in das sterile, im Fermenter befindliche Medium eingebracht. Das beimpfte Medium wird unter Bewegen bei 16 bis 40 C, vorzugsweise 25 bis 30 C, und Belüftung mit einem Luftstrom von 1 Volumen pro Minute während 1 bis 7 Tagen inkubiert.
Der Luftstrom kann innerhalb eines Bereiches von 0, 3 bis l, 5 Volumina pro Minute variiert werden. Für eine maximale Enzymausbeute soll der pH-Wert bei der Fermentation zwischen 6,0 und 8, 5, vorzugsweise zwischen 6, 4 und 7, 5 gehalten werden. Unter diesen Bedingungen wird maximale Isomeraseaktivität in 3 bis 5 Tagen erreicht. Die ganzen Zellen werden dann geerntet und als solche verwendet, oder das Enzym wird aus den Zellen nach an sich bekannten Methoden extrahiert.
Aktivitätswerte von annähernd 30 Einheiten je ml Kulturbrühe wurden in 3 Tagen erreicht. Eine Aktivitätseinheit ist definiert als jene Menge Enzym, welche 1 Mikromol Fructose aus Glucose in 1 min bei 75cL'
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in einer Lösung, enthaltend 1, 5 Mol Glucose, 0, 03 Mol Phosphatpuffer von pH 7, 0, 003 Mol Magnesiumsulfat und 0,0003 Mol Kobalt (n) sulfat, erzeugt.
Die bei der praktischen Durchführung der Erfindung erzielbaren Isomerase-Aktivitätswerte schwan- ken je nach dem speziell angewendeten Stamm und Züchtungsmedium. Aktivitätswerte von 50 Einh./ml Kulturbrühe wurden im Falle von Actinoplanes missouriensis NRRL B-3342, in Maisquellwasser gezüchtet, beobachtet.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, ohne sie darauf zu beschränken.
Insbesondere sollen beim erfindungsgemässen Verfahren Subkulturen, natürliche Mutanten, Varianten u. dgl., sowie aus den genannten Organismen durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder ultraviolettem Licht, Behandlung mit Chemikalien u. dgl. künstlich erzeugte Mutanten mitumfasst sein.
Beispiel l : Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von Glucose isomerisierendem Enzym durch eine Anzahl Aetinoplanes-Stämme, nämlich Aetinoplanes missouriensis NRRL B-3342, Aetinoplanes philippinensis ATCC 12427, Actinoplanes armeniaeus ATCC 15676 und Aetinoplanes sp. ATCC 23342.
Diese Mikroorganismen werden gesondert in Vorrats-Schrägkulturen, bestehend aus 1, 7% Trypton, 0, 3% Soyton, 0, 25% Glucose und 2, 0% Agar konserviert. Das Inoculum wird hergestellt, indem man den Mikroorganismus aus der Vorratskultur in eine Proberöhre überträgt, die 8 ml eines sterilisierten Mediums, bestehend aus 1, 7% Trypton, 0, 3% Soytone, 0, 25% K2 HPO4 und 0, 25% Glucose enthält. Das Inoculum wird in dieser Proberöhre unter Schütteln bei 28 C 2 bis 3 Tage lang gezüchtet. Dann wird es einem der folgenden Züchtungsmedien zur Erzeugung von Glucose isomerisierendem Enzym zugesetzt :
Medium Nr. I.
EMI2.1
<tb>
<tb>
Trypton <SEP> 1, <SEP> 7%
<tb> Soyton <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP>
<tb> HP04 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> D-Xylose <SEP> 1, <SEP> 0
<tb>
mit Leitungswasser auf das erforderliche Volumen aufgefüllt.
Der pH-Wert des Mediums wurde auf ungefähr 7, 0 eingestellt. Zucker und andere Nährstoffe wurden gesondert sterilisiert und dann beigemischt.
Medium Nr. IL Das Medium wird wie Medium Nr. I hergestellt, doch wird 0, 25% D-Glucose an Stelle der gesamten D-Xylose verwendet.
Medium Nr. m
EMI2.2
<tb>
<tb> Maisquellwasser <SEP> 3 <SEP> %
<tb> CUS04 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> mM <SEP>
<tb> CUS04 <SEP> 0,05 <SEP> mM
<tb>
Die Herstellung des Züchtungsmediums aus Maisquellwasser ist im nachstehenden Beispiel 2 beschrieben.
Der pH-Wert der Kultur betrug in allen Fällen 7, 0.
Andere geeignete Medien sind z. B. losliche Brennereirüokstände, Pepton-Hefeextrakt, Caseinhydrolysat, Sojabohnenhydrolysat und Fischproteinhydrolysat. Auch Gemische der beschriebenen Medien können verwendet werden.
Die Züchtung wurde durch Zusatz von 5 ml des betreffenden Inoculums zu 75 ml Trypton-Soyton-Medium oder zu 95 ml Maisquellwasser-Medium in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben eingeleitet. Die Zellen wurden 96 h bei 28 C unter Schütteln auf einem G-25 New Brunswick Scientific Gyrotary Shaker bei 280 Umdr/min inkubiert.
Die Zellen wurden durch Zentrifugieren von 30 ml der Kultur bei 15000 Umdr/min während 10 min abgetrennt. Dann wurden sie einmal mit Leitungswasser gewaschen und in 14 ml 0, 12 m Phosphatpuffer (PH 7, 0) suspendiert. Die Zellsuspension wurde dann bei 40C während 4 min in einem Branson Sonifier J-17A beschallt und anschliessend bei 15000 Umdr/min 15 min zentrifugiert. Der Überstand wurde als Rohquelle von Glucose isomerisierendem Enzym verwendet.
Die Aktivität der Glucoseisomerase wurde wie folgt bestimmt : 3 ml einer Lösung von 2,0 m Glucose, 0, 004 m MgS04 und 0, 0004 m CoS04 wurde mit einer Lösung des Rohenzyms in 0, 12 m Phosphatpuffer (PH 7, 0) bis zu einem Endvolumen von 4, 0 ml versetzt. Die Reaktion wurde bei 750C durchgeführt. Aliquote Anteile wurden nach 10,15, 20 und 25 min entnommen und mit 0,02 m HCl verdünnt.
Der Fructosegehalt der Proben wurde in einem automatischen Analysator unter Anpassung der Skatol-
EMI2.3
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gung berechnet und in Einheiten (E) ausgedruckt. Eine Aktivitätseinheit ist definiert als jene Menge Enzym, welche aus der Glucose 1 Mikromol Fructose in 1 min bei 75 C unter den im vorhergehendenAbsatz be- schriebenen Bedingungen erzeugt.
Die Produktion von Glucose isomerisierendem Enzym durch verschiedene Arten von ActinoplanesMikroorganismen nach Züchtung in Trypton-Soyton-Medium oder Maisquellwasser ist in Tabelle I angegeben. Alle diese Mikroorganismen sind imstande, Glucose isomerisierendes Enzym in Gegenwart oder in Abwesenheit von D-Xylose im Züchtungsmedium zu erzeugen. Die Anwesenheit von D-Xylose führt jedoch zu einer merklichen Erhöhung der Produktion dieses Enzyms.
Tabelle I
Produktion von Glucose-Isomerase durch verschiedene
Species von Actinoplanen
EMI3.1
<tb>
<tb> Spezifische <SEP> Aktivität <SEP> U/mg/Protein
<tb> Mikroorganismus <SEP> Medium <SEP> Nr. <SEP> 1 <SEP> Medium <SEP> Nr. <SEP> 2 <SEP> Medium <SEP> Nr. <SEP> 3
<tb> (keine <SEP> (D-Xylose) <SEP> (MaisquellXylose <SEP> wasser)
<tb> Actinoplanes
<tb> missouriensis
<tb> NRRL <SEP> B-3342 <SEP> 15, <SEP> 2 <SEP> 20, <SEP> 6 <SEP> 17, <SEP> 8 <SEP>
<tb> Actinoplanes
<tb> philippinensis
<tb> ATCC <SEP> 12427 <SEP> 0, <SEP> 87 <SEP> 2,0 <SEP> 0, <SEP> 29 <SEP>
<tb> Aetinoplanes
<tb> armeniacus
<tb> ATCC <SEP> 15676 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP> 0, <SEP> 82 <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP>
<tb> Aetinoplanes <SEP> sp.
<tb>
ATCC <SEP> 23342 <SEP> 0, <SEP> 48 <SEP> 1,70 <SEP> 0, <SEP> 41 <SEP>
<tb>
Maisquellwasser kann als Züchtungsmedium für die Erzeugung von Glucose isomerisierendem Enzym in Abwesenheit von D-Xylose verwendet werden. Die grösste Produktion von Glucose isomerisierender Akti- vität wurde bei dem Stamm Actinoplanes middouriensis NRRL B-3342 festgestellt. Alle nachfolgenden Beispiele wurden unter Verwendung dieses speziellen Mikroorganismus durchgeführt.
Beispiel 2 : Das Herstellungsverfahren des Maisquellwassers hat eine deutliche Wirkung auf die Er- zeugung von Enzym mit Actinoplanes missouriensis. Es wurden verschiedene Methoden zur Neutralisation des Maisquellwassers untersucht. Nach Neutralisation auf PH 7, 0 mit Alkali wurde das Maisquellwasser filtriert, um Schlamm, der zum Grossteil aus Phytaten bestand, zu entfernen ; dann wurde es für die Züchtung gemäss der Arbeitsweise des Beispiels 1 unter Zusatz von Kobalt (II) sulfat und Kupfer (in) sulfat in einer Konzentration von 0, 1 mM bzw. 0, 05 mM verwendet.
Die Verwendung von Natriumhydroxyd gibt im Vergleich zu Kalk oder Ammoniumhydroxyd die beste Enzymproduktion, wie aus Tabelle n ersichtlich ist. Kaliumhydroxyd ist gleichfalls ein geeignetes Alkali.
Tabelle II
Wirkung von Neutralisationsmitteln für Maisquellwasser auf die Erzeugung von Glucoseisomerase
EMI3.2
<tb>
<tb> Neutralisationsmittel <SEP> Produktion <SEP> von <SEP> Enzym
<tb> U/ml <SEP> Kulturbriihe <SEP>
<tb> Kalk <SEP> 17, <SEP> 2 <SEP>
<tb> NH40H <SEP> 23, <SEP> 3 <SEP>
<tb> NaOH <SEP> 27, <SEP> 8 <SEP>
<tb>
Die Entfernung des Schlammes nach der Neutralisation ist wesentlich, wie aus den Ergebnissen in Ta-
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belle m hervorgeht. Maisquellwasser wurde auf pli 7,0 neutralisiert und in einem 11-Erlenmeyer-Kolben auf 600 ml aufgefällt (entsprechend 3% Feststoffe). Die Berechnung des Prozentsatzes der Feststoffe beruht auf den vom Hersteller angegebenen ursprünglichen Feststoffen.
Irgendwelche Feststoffe, die durch Filtreren entfernt werden können, sind bei der Berechnung des End-Feststoffgehaltes nicht berücksichtigt. Kobaltund Kupfersalz wurde wie oben zugesetzt. Die Zellen wurden bei Umgebungstemperatur 4 Tage auf einem New Brunswick G-50 Shaker bei 280 Umdr/min gezüchtet.
Tabelle III
Wirkung der Entfernung von Schlamm aus Maisquellwasser auf die Erzeugung von Glucoseisomerase durch Actinoplanes missouriensis
EMI4.1
<tb>
<tb> Züchtungsmedium <SEP> Erzeugtes <SEP> Enzym <SEP> (Einh./ml
<tb> Kulturbrühe)
<tb> Schlamm <SEP> nicht <SEP> entfernt <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Schlamm <SEP> entfernt <SEP> 23,2
<tb>
Beispiel 3 : Die von dem Mikroorganismus erzeugte Menge an Glucoseisomerase wird durch die in dem Medium anwesende organische Stickstoffquelle beeinflusst, wie aus Tabelle IV hervorgeht. Die Daten der Tabelle IV wurden durch 3-tägige Züchtung des Mikroorganismus in 100 ml Brühe in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben auf einem G-25NewBrunswickShaker bei 28 C und 280 Umdr/min erhalten.
Die Menge der organischen stickstoffhaltigen Feststoffe wurde auf 2% eingestellt, dann wurde neutralisiert und filtriert, wo-
EMI4.2
und 11 mg MgSOerntet und beschallt, und die Aktivität des Enzyms wurde gemessen. Die Ergebnisse sind als Aktivitätsein- heiten je ml Kulturbrühe ausgedrückt.
Maisquellwasser ergab die grösste Aktivität und ist die bevorzugte Stickstoffquelle.
Tabelle IV
Wirkung organischer Stickstoffquellen auf die Erzeugung von Glucoseisomerase.
EMI4.3
<tb>
<tb>
Organische <SEP> Stickstoff-Hersteller <SEP> Aktivität
<tb> quelle <SEP> E/mIKultur <SEP> % <SEP>
<tb> Maisquellwasser <SEP> Anheuser-17, <SEP> 8 <SEP> 100
<tb> Busch
<tb> O. <SEP> M.-Pepton <SEP> Amber <SEP> Lab. <SEP> 13, <SEP> 4 <SEP> 75
<tb> Caseinhydrolysat
<tb> (Amber <SEP> EHC) <SEP> Amber <SEP> Lab. <SEP> 13,0 <SEP> 73
<tb> Bacto-Soytone <SEP> Difco <SEP> Lab. <SEP> 11, <SEP> 8 <SEP> 66
<tb> Hefeextrakt
<tb> (BYF-100) <SEP> Amber <SEP> Lab. <SEP> 10, <SEP> 3 <SEP> 58
<tb> Lösliche <SEP> Brennereirückstände <SEP> National
<tb> Distiller's
<tb> Products <SEP> 7, <SEP> 9 <SEP> 44
<tb> Hefeextrakt
<tb> (BYF-300) <SEP> Amber <SEP> Lab. <SEP> 5, <SEP> 8 <SEP> 33
<tb> Bactopepton <SEP> Difoo <SEP> Lab. <SEP> 5, <SEP> 2 <SEP> 29
<tb> Hefeextrakt
<tb> (BYF <SEP> 50 <SEP> X) <SEP> Amber <SEP> Lab.
<SEP> 4, <SEP> 3 <SEP> 24
<tb>
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Tabelle IV (Fortsetzung)
EMI5.1
<tb>
<tb> Organische <SEP> Stickstoff-Hersteller <SEP> Aktivität
<tb> quelle <SEP> E/mIKultur <SEP> % <SEP>
<tb> Malzextrakt <SEP> Difco <SEP> Lab. <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 14
<tb> Atlantic <SEP> Menhaden-Haynie <SEP> products <SEP> l, <SEP> l <SEP> 6
<tb> Pepton
<tb>
Beispiel 4 : Die optimale Konzentration von nèutralisiertem Maisquellwasser (als Feststoffe), aus dem der Schlamm entfernt worden war, wurde mit 3% festgestellt, siehe Tabelle V. Die Konzentration kann
0, 5 bis 7% des Gewichts des Mediums betragen. Die Züchtungsbedingungen waren die gleichen wie in Beispiel 3, nur dass das Züchtungsmedium keine Glucose enthielt und mit 2, 5 mg CoSO4. 7H2 0 ergänzt war.
Die
Zellen wurden 4 Tage lang gezüchtet, geerntet und nach der Methode des Beispiels 1 untersucht.
Tabelle V
Wirkung der Konzentration von Maisquellwasser auf die Erzeugung von Enzym
EMI5.2
<tb>
<tb> % <SEP> Maisquellwasser <SEP> Produktion <SEP> von <SEP> Enzym
<tb> E/mL <SEP> Kultur
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> 9, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> 22, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 2, <SEP> 0 <SEP> 23, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 3, <SEP> 0 <SEP> 29, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 4, <SEP> 0 <SEP> 23, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 5, <SEP> 0 <SEP> 23, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 6,0 <SEP> 21,8
<tb>
Beispiel 5 : Der Effekt verschiedener Kohlehydratquellen auf die Erzeugung von Glucoseisomerase durch Actinoplanes missouriensis wurde untersucht. Eine mässige stimulerende Wirkung wurde im Fall von Fructose festgestellt. Ungefähr 0, 1 bis 2% Fructose, bezogen auf das Gewicht des Mediums, ist der bevorzugte Bereich für allenfalls zugesetzte Fructose.
Die Daten der Tabelle VI wurden durch Zusatz von 0, 25% (Gew. /Vol) Kohlehydrat zu dem Züchtungsmedium erhalten, das 3% Maisquellwasser enthielt, wobei die andern Nährstoffe und Bedingungen wie in Beispiel 1 waren.
Tabelle VI
Wirkung von Kohlehydraten auf die Erzeugung von Enzym
EMI5.3
<tb>
<tb> Kohlehydrat <SEP> Enzym <SEP> Aktiv.
<tb>
E/ml. <SEP> Kultur
<tb> keines <SEP> 28, <SEP> 0 <SEP>
<tb> D-Xylose <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP>
<tb> D-Fructose <SEP> 35, <SEP> 2 <SEP>
<tb> D-Galactose <SEP> 31,5
<tb>
Wie aus Tabelle VI ersichtlich, ist D-Xylose für die Erzeugung von Glucoseisomerase nicht notwendig, und ihr schwacher stimulierender Effekt würde ihre kommerzielle Verwendung nicht rechtfertigen.
Beispiel 6 : Es zeigte sich, dass der Zusatz verschiedener Metallionen zum Züchtungsmedium von Actinoplanes missouriensis die Erzeugung von Glucoseisomerase beeinflusst. Zellen wurden nach der Arbeitsweise des Beispiels 4 in 3% igem Malsquellwasser gezüchtet mit der Ausnahme, dass zusätzliche Salze nur soweit in Tabelle VIf angegeben, zugegeben wurden.
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Tabelle VII Wirkung von Metallionen auf die Erzeugung von Glucoseisomerase durch Actinoplanes missouriensis.
EMI6.1
<tb>
<tb>
Zusatz <SEP> Enzymproduktion
<tb> E/ml. <SEP> Kulturbrühe
<tb> keiner <SEP> 22, <SEP> 8 <SEP>
<tb> CO-l+ <SEP> (O, <SEP> l <SEP> mM) <SEP> 27, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Co++ <SEP> (0,1 <SEP> mM) <SEP> Mg++(0,45 <SEP> mM) <SEP> 27,0
<tb> Co++ <SEP> (0, <SEP> l <SEP> mM) <SEP> Cu* <SEP> (0, <SEP> 05 <SEP> mM) <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP>
<tb>
EMI6.2
05Beispiel 7: Es zeigte sich, dass die Erzeugung von Glucoseisomerase durch den Anfangs-pH-Wert des Züchtungsmediums beeinflusst wird. Als optimaler Anfangs-pH-Wert erwies sich 7, 0, wie aus Tabelle VIII ersichtlich. Das Züchtungsmedium wurde durch Neutralisieren von Maisquellwasser mit NaOH, Filtrieren und anschliessende Einstellung des gewünschten pH-Wertes hergestellt und unter den Bedingungen des Beispiels 4 verwendet.
Tabelle VIII
Wirkung des Anfangs-pH des Züchtungsmediums auf das Wachstum und die Erzeugung von Enzym
EMI6.3
<tb>
<tb> Anfangs-pH <SEP> Produktion <SEP> von <SEP> Enzym <SEP> mg <SEP> Wachstum
<tb> E/ml <SEP> Kultur <SEP> lösliches <SEP> Protein/ml
<tb> Kultur
<tb> 8, <SEP> 5 <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 20 <SEP>
<tb> 8, <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 17 <SEP>
<tb> 7, <SEP> 5 <SEP> 18, <SEP> 3 <SEP> 1, <SEP> 14 <SEP>
<tb> 7, <SEP> 0 <SEP> 27, <SEP> 8 <SEP> 1, <SEP> 80 <SEP>
<tb> 6, <SEP> 5 <SEP> 18, <SEP> 7 <SEP> 1, <SEP> 35 <SEP>
<tb> 6, <SEP> 0 <SEP> 11, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 95 <SEP>
<tb> 5, <SEP> 5 <SEP> ---- <SEP> kein <SEP> Wachstum
<tb> 5, <SEP> 0 <SEP> ---- <SEP> kein <SEP> Wachstum
<tb>
Die Proteinbestimmungen erfolgten nach der Methode von Lowery (J. Biol. Chem. Bd. 193 [1951], S. 265 an Enzymextrakten.
Beispiel 8: Actinoplanes missouriensis wächst und produziert Glucoseisomerase-Aktivität innerhalb eines weiten Temperaturbereiches. Die optimale Züchtungstemperatur wurde, wie aus Tabelle IX er-
EMI6.4
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Tabelle IX Wirkung der Züchtungstemperatur auf die Erzeugung von Enzym
EMI7.1
<tb>
<tb> Züchtungs- <SEP> Züchtungszeit <SEP> Produktion <SEP> von <SEP> mg <SEP> lösliches
<tb> temperatur <SEP> Tage <SEP> Enzym <SEP> E/ml <SEP> Protein/ml
<tb> oc <SEP> Kultur <SEP> Kultur
<tb> 16 <SEP> 4 <SEP> 5, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 92 <SEP>
<tb> 20 <SEP> 4 <SEP> 18, <SEP> 4 <SEP> 1, <SEP> 68
<tb> 24 <SEP> 4 <SEP> 24, <SEP> 4 <SEP> 2,04
<tb> 28 <SEP> 4 <SEP> 29, <SEP> 4 <SEP> 2, <SEP> 40 <SEP>
<tb> 32 <SEP> 4 <SEP> 21, <SEP> 4 <SEP> 1,83
<tb> 36 <SEP> 2 <SEP> 16,0 <SEP> 1,66
<tb> 40 <SEP> 2 <SEP> 6,6 <SEP> 0, <SEP> 47 <SEP>
<tb> 45 <SEP> 3 <SEP> -- <SEP> kein <SEP> Wachstum <SEP>
<tb>
Beispiel 9 :
Die Erzeugung von Enzym durch Actinoplanes missouriensis NRRL B-3342 wurde in einem New Brunswick MF 114 Fermenter mit automatischer PH- und Schaumregelung durchgeführt. 10 1 Medium wurden unter Verwendung von Maisquellwasser hergestellt, das mit NaOH auf PH 7, 0 eingestellt, filtriert und mit Leitungswasser auf das genannte Volumen aufgefüllt worden war. Es wurde so viel Maisquellwasser (50% Feststoffe) verwendet, dass die Endkonzentration 4% betrug. Verluste an Feststoffen durch Neutralisation und Filtrieren wurden bei der Berechnung des End-Feststoffgehaltes nicht berücksichtigt. Das Medium wurde mit 0, 1 mM Kobaltsulfat und 0, 05 mM Kupfer (ill) sulfat ergänzt und bei 121 C 30 min sterili-
EMI7.2
Zugabe von 2m H2SO .
Es wurde mit 200 Umdr/min gerührt und mit 1 Volumen Luft/min belüftet. Die Fermentation wurde durch Zusatz von 10% eines 24 h-Inoculums, hergestellt in demselben Medium, eingeleitet. Am Ende der Züchtungsperiode enthielt die Kulturbrühe eine Aktivität von 56 Einh./ml.
Die Isomerisation von Glucose zu Fructose kann unter Verwendung von ganzen Zellen oder zellfreie Extrakten durchgeführt werden. Der pH-Wert bei der Isomerisation kann. zwischen etwa 5, 5 und 9 betragen, doch erwies sich ein pH-Wert von 7, 0 als Optimum, wie in Tabelle X gezeigt wird. Das Enzym ist bemerkenswert temperaturbeständig, wobei noch bei 900C eine merkbare Aktivität verbleibt. Das in diesen Versuchen verwendete Enzym stammt von Actinoplanes missouriensis, der in dem in Beispiel 1 beschriebenen Trypton-Soyton-Medium ohne D-Xylose gezüchtet worden war.
Die Enzymaktivität wurde inEinheiten je ml Rohenzymlösung hergestellt nach der inBeispiell beschriebenen Arbeitsweise, ausgedrückt. Die Versuchsbedingungen waren dieselben wie bei der Aktivitätsprüfung, ausser es wurde ein geeigneter Phosphatpuffer für die Erzielung eines gewünschten pH-Wertes wie in Tabelle X verwendet, oder die Temperatur wurde wie in Tabelle XI geändert. Die Daten der Tabelle X wurden auf nicht-enzymatische Umwandlung korrigiert. Die Glucosekonzentration ist grösser als ungefähr 0, 1 Mol.
Tabelle X
Wirkung des PH auf die Aktivität von Glucoseisomerase
EMI7.3
<tb>
<tb> PH <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP> 6, <SEP> 0 <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> 8, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Akt.
<tb>
E/ml <SEP> 6,5 <SEP> 16,1 <SEP> 28,0 <SEP> 45,0 <SEP> 50,5 <SEP> 45,0 <SEP> 39,4
<tb>
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Tabelle XI Glucoseisomerase-Aktivität als Funktion der Temperatur
EMI8.1
<tb>
<tb> Temperatur <SEP> C <SEP> Aktivität <SEP> E/ml
<tb> 40 <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 50 <SEP> 9, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 60 <SEP> 20, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 70 <SEP> 43, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 75 <SEP> 57, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 80 <SEP> 74, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 85 <SEP> 127, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 90 <SEP> 158,4
<tb>
Beispiel 10 : Zweiwertige Kationen haben eine tiefgreifende Wirkung auf die Aktivität von Glucose- isomerase, die wie für das vorhergehende Beispiel hergestellt wurde. Der stärkste Effekt wurde mit Magne- sium und Kobalt festgestellt.
Tabellen XII und Xin beschreiben die Ergebnisse des Zusatzes von Magnesium i zu einem zellfreienEnzymextrakt und die zusätzliche Aktivitätssteigerung durch Kobalt. Die Versuchsbedin- gungen waren dieselben wie bei der Aktivitätsprüfung mit Ausnahme der Konzentration an zweiwertigen Ka- tionen. wurde in einer Menge von ungefähr 0, 1 bis 9 mM, vorzugsweise von 0, 3 mM zugesetzt; Co++ wur- de in einer Menge von ungefähr 0, 5 bis 0, 6 mM, vorzugsweise von 0, 1 bis 0, 3 mM, zugesetzt.
Tabelle XII
Wirkung von Mg au die Aktivität von Glucose isomeri- sierendem Enzym
EMI8.2
<tb>
<tb> Konzentration <SEP> von <SEP> MgSo4 <SEP> (mM) <SEP> Enzym-Aktivität <SEP> E/ml
<tb> 0 <SEP> 4,8
<tb> 0,5 <SEP> 25,0
<tb> 1,0 <SEP> 41,2
<tb> 2,0 <SEP> 44,3
<tb> 3,0 <SEP> 43,5
<tb> 4,0 <SEP> 43,5
<tb>
Tabelle XIII Aktivität von Glucoseisomerase als Funktion der Co-
Konzentration in Gegenwart von 3, 0 mM MgSO,
EMI8.3
<tb>
<tb> Konzentration <SEP> von <SEP> CoSC <SEP> (mM) <SEP> Enzym-Aktivität <SEP> E/ml <SEP>
<tb> 0 <SEP> 44, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 2 <SEP> 49, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 3 <SEP> 54, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 0,4 <SEP> 54,0
<tb>
EMI8.4
11 :
0, 32 M Phosphat(K)-Puffer, pH 7,5, suspendiert und in einem Wasserbad 4 h bei 75 C inkubiert.Die Zellen wurden durch Filtrieren durch ein Whatman-Filterpapier Nr. 1 entfernt. 50% der Glucose waren in Fructose übergeführt worden. Die Identifizierung der Produkte erfolgte durch Dünnschichtchromatographie (J.
Chromatog. Bd. 34 [1968], S. 26 bis 34). Die Identifizierung und Mengenbestimmung bei vergleichbaren Umwandlungen wurden durch Gaschromatographie der Trimethylsilylderivate bestätigt (R. L. Whistler und J. N.
BeMiller, Methods in Carbohydrate Chemistry, Vol. VI, S. 2, Academic Press, New York [1972].