DE2408708A1 - Verfahren zur herstellung von glucoseisomerase - Google Patents
Verfahren zur herstellung von glucoseisomeraseInfo
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Description
Es ist bekannt, dass verschiedene Mikroorganismen in der
Lage sind, mittels einer Glucose-Isomerase Glucose zu Fructose zu isomerisieren. Dabei handelt es sich beispielsweise um
Vertreter des Genus Streptorayces, Bacillus, Lactobacillus,
Aerobaeter und Pseudomonas, Unter den Streptomyccten sind es
vor allem die Species Str. olivochromogenes, Str. wedmorensis,
Str. olivaceus, Str. venezuelae, Str. phaechromogenes,'Str.
albus und Str. rubiginosus, die, nach Induktion mit Xylose, in der Lage sind, eine Glucose-Isomerase zu produzieren.
Es wurde nun gefunden, dass auch die bekannte Species v
Streptomyces glaucescens, insbesondere der Stamm.ETH 22794,
bekannt als Produzent von Antibiotika, insbesondere von Ilydroxystreptomycin (beschrieben in "Systematik der Streptomyceten
unter besonderer Berücksichtigung der von ihnen gebildeten Antibiotika*1, R. Hütter, Verlag S. Karger, Basel und
409836/1010
New York, Bibl. Mikrobiol, £ (1967), 90-92), überraschenderweise
in der Lage ist, auf einem geeigneten JTährboden eine Glucose-Isomerase zu synthetisieren. Str. glaucescens zeichnet sich als
Isomeraseproduzent gegenüber anderen bekannten und diese Eigenschaft besitzenden Mikroorganismen dadurch aus, dass er
einen sehr hohen Anteil an extrazellulärer Glucose-Isomerase enthält, was von Vorteil bei der Isolierung ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft demgemäss ein Verfahren
zur Herstellung einer Glucose-Isomerase, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man Mikroorganismen der Species
Streptomyces glaucescens in einem Nährmedium züchtet und die Glucose-Isomerase daraus isoliert. Die Erfindung betrifft
ferner die Verwendung dieser Glucose-Isomerase zur Herstellung
von Fructose aus Glucose, sowie ein Verfahren zur Herstellung
von Fructose aus Glucose dadurch, dass man eine Glucose enthaltende Lösung mdt einer Kultur von Str. glaucescens oder
einer daraus isolierten Glucose-rlsomerase inkubiert und die
erhaltene Fructose aus dem Reaktionsgemisch isoliert.
.Ein erfindungsgemäss bevorzugter Stamm ist Streptomyces
glaucescens ETH 22794.
Die Züchtung des erfindungsgemäss verwendbaren Mikroorganismus kann in an sich bekannter Weise unter aeroben Bedingungen
erfolgen, beispielsweise in Oberflächen- oder, vorzugsweise, in Submerskulturen, unter Verwendung von Rühr- oder
Schüttelfermentern.
Ein geeignetes Nährmedium, das fest oder flüssig sein kann, enthält eine assimilierbare Kohlenstoff- und eine assimilierbare
Stickstoffquelle, sowie zweckmässigerweise Mineralsalze
und Spurenelemente. Als assimilierbare Kohlenstoffquellen eignen sich beispielsweise Malzextrakt, Glucose, Maltose,
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Saccharose, sowie andere Zucker, Glycerin,' Cornsteepliquor, Aminosäuren, Peptide, Fette und Fettsäuren. Als assimilierbare
Stickstoffquellen kommen mikrobielle, pflanzliche, tierische
und anorganische Stickstoffverbindungen in Frage wie Hefeextrakt, Peptone, Bactotrypton, Fleischextrakt, Aminosäuren,
pankreatisch- oder Säure-hydrolysiertes Casein, Sojabohnenmehle
und NaNO-. Schliesslich ist für ein gutes Wachstum djs Anwesenheit
einer Reihe von Makro- und Spurenelementen, vorzugsweise anorganischen Ursprungs, vorteilhaft,wie beispielsweise
Magnesium, Kobalt, Phosphor, Schwefel. Nach Bedarf oder Wunsch können noch spezielle Wachsturnsfaktoren oder -stimulantien,
z.B. Vitamine wie Biotin oder Pyridoxin oder Auxine zugesetzt werden. >
-—
| Ein geeignetes Nährmedium hat | 5-20 | z.B. | folgende Zusammen- |
| Setzung: | 10 | ||
| Hefeextrakt | 50 | δ | |
| Glucose | 20, MgSO4 | g | |
| CoCl2*6H2O | 1000 | mg | |
| Spuren von K2HPO. *3H | -7H2O | . und CaC0„ | |
| aaua dest a.s. ad | ml | ||
Die Lösung wird mit NaOH oder 0,05 fin Phosphatpuffer
auf pH 7,0 eingestellt.
Der für die Züchtung geeignete pH-Bereich ist etwa 5-9, vorzugsweise 6,8-7,3; die Temperatur sollte zweckmässigerweise
20-400C, vorzugsweise 29-31°C, betragen^
Durch Zusatz von Xylose zum Nährmedium wird die Bildung
von Glucose-Isomerase bei Str. glaucescens induziert. Xylane,
aus Xylose aufgebaute Polysaccharide, die in der Natur weit verbreitet sind, können ebenfalls als Induktoren eingesetzt
werden, da Str. glaucescens über eine eigene Xylanase verfügt.
409836/1010
Xylane sind "beispielsweise im Stroh von G-etreidearten (15-20$),
in Zuckerrohrpressrückständen (30$), in Baumwollsamenhülsen, im Koniferenholz (7-12$) und im Holz von Laubbäumen (20-25$)
enthalten. Durch saure Hydrolyse oder enzymatischen Abbau von XyIanen
erhält man Xylose, die jedoch als bevorzugtes Induktionsmittel anzusehen ist, weil bei der sauren Hydrolyse von Xylanen unerwünschte
Nebenprodukte wie Furfural, Hydroxymethylfurfural und Lävulinsäure entstehen, die für die Mikroorganismen z.T. toxisch
sind und die Isomeraseproduktion beeinträchtigen können, Zur Induktion der Isomerasebildung setzt man dem Nährmedium in der
Induktionsphase zweckmässigerweise 0,5 - 2,0$ Xylose zu.
Es hat sich als sehr vorteilhaft erwiesen, die Induktionsphase von der Viachstumsphase zu trennen, was dadurch geschehen
kann, dass der Induktor erst nach einer Zeit des reinen Wachstums
der Mikroorganismen, beispielsweise nach 24 Stunden, dem
Nährmedium zuzugeben wird oder, was noch günstiger ist, dass man das Mycel nach der Wachstumsphase z.B. in einer Durchlaufzentrifuge
erntet, wäscht und zwecks Induktion der Isomerasebildung in das xylosehaltige Induktionsmedium überführt. Diese
Methode hat den Vorteil, dass Verbindungen, wie z.B. die Glucose, die wohl gute Substrate für das Wachstum sind, die
aber einen unerwünschten Einfluss auf die Synthese der Isomerase haben und sie mehr oder weniger hemmen, während der Induktionsphase im Nährmedium fehlen. Für eine gute Enzymbildung
,ι ι
ist die Anwesenheit von Co ■
Induktionsphase zweckmässig.
Induktionsphase zweckmässig.
,ι ι
ist die Anwesenheit von Co - und Mg^-Ionen während der
Ein geeignetes Nährmedium während der Induktionsphase · (pH 6,5) enthält z.B. folgende Komponenten:
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| Caseinhydrolysat | (pankreatisch) | 0 | 1 - | 2 $ |
| Xylose | ,5 - | 2,0 io | ||
| Coöl2--6H20- | 0, | 024 % | ||
| K0HPO.·3H^O 2 4 2 |
0 | 0, | 05 fo | |
| MgSO4* 7HO | ,025 | - 0,3 | ||
V/ährend der Wachstumsphase stört ein allfälliges Absinken
des pH-Wertes kaum, was jedoch während der folgenden Induktionsphase möglichst zu vermeiden ist, um nicht schlechte Ausbeuten
an Glucose-Isomerase zu erhalten. Es empfiehlt sich, den pH-Wert während der Induktionsphase etwa zwischen 6 und 8, vorzugsweise
zwischen 6,2 und 6,8, zu halten.
Die.von Streptomyces glaucescens gebildete Glucose-Isomerase
liegt intra- und extrazcllulär vor, bei einem relativ
grossen extrazellulären Anteil. Der extrazelluläre Anteil kann
nach 64-69stündiger Induktion des zuvor 24 Stunden gewachsenen Mycels beispielsweise bis zu 50$ (bezogen auf gesamte Isomerase)
betragen und bei 136stündiger Induktion sogar bis auf 75$
steigen. Das Verhältnis der beiden Anteile hängt vor allem von den Milieubedingungen ab.
Die Isolierung der gebildeten Glucose-Isomerase kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Dabei bietet die extrazelluläre
Isomerase den Vorteil der einfacheren Isolierbarkeit. Sie kann nämlich aus dem Kulturfiltrat in einfacher Weise durch Fällung,
vorzugsweise mit Aceton oder Aethanol,und anschiiessende
Filtration oder Zentrifugieren erhalten wer den. l&ch Waschen mit 79&-
igem Aethanol kann .sie getrocknet werden; üblicherweise wird sie
in einer Pufferlösung, vorzugsweise einem Phosphatpuffer vom pH 5-8, vorzugsweise pH 6,5 - 7,0, aufgenommen. Die -Isolierung
des intrazellulären Glueose-Isomeraseanteils erfordert einen
vorherigen Aufschluss der Zellen. Dieser kann in an sich bekannter Weise erfolgen, z.B. durch Ultraschallbehandlung, wobei
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das Mycel zerbrochen wird,, durch Herstellung eines Aceton-Troekenpulvers
oder durch Lyophilisierung. ÜTach der Ultraschallbehandlung
zentrifugiert man in einer hochtourigen
Zentrifuge (12-151OOO U/min.) bei tiefer Temperatur (0-40C) *
und erhält sehr gute Ausbeuten an Isomerase. Das Aceton-Trockenpulver oder Lyophilisat wird bei" 250C mit einem der
üblichen Puffer (0,05-0,1 m, pH 5 - 9), vorzugsweise einem 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,0) extrahiert, wodurch man etwa
der Isomeraseaktivität des Mycels erhält.
Die erfindungsgemäss erhältliche G-luc öse-Isomerase aus
Streptom3rces glaucescens ist ein sehr stabiles Enzym, das vor
allem eine sehr gute Hitzestabilität aufweist und sich gut bei Temperaturen bis zu 700C zur Isomerisierung von Glucose in
Fructose verwenden lässt. Bei 600C kann Glucose, beispielsweise
in lO^iger Lösung, zu 56^ und bei 700C zu 60-62^ in Fructose
überführt werden.
Die erfindungsgemässe Isomerisierung von Glucose zu
Fructose mittels Glucose-Isomerase aus Streptomyces glaucescens kann in an sich bekannter Weise erfolgen. So kann eine Glucoselösung
direkt mit einer Kultur des Mikroorganismus behandelt werden, d.h. mit frisch geerntetem oder gelagertem, mit acetongetrocknetem
oder lyophilisiertem Mycel. Hierbei wird das Mycel zweckmässigerweise einer Hitzestabilisierung zur Fixierung
der Isomerase in den Zellen unterworfen, was z.B. dadurch geschehen kann, dass man das Mycel bei pH 7,5 innerhalb von
30 Minuten auf 750C erhitzt und 5 Minuten bei dieser Temperatur
belässt. Andererseits kann die Behandlung der Glucose mit dem JCulturfiltrat, das überwiegend extrazelluläre Isomerase enthält,
erfolgen oder mit isoliertem Enzym bzw. mit an einen festen. Träger gebundenem Enzym. Die Vorteile der Verwendung von durch
Fixierung an einen festen Träger unlöslich gemachten Enzymen sind bekannt und können auch im Zusammenhang mit der vorliegenden
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Erfindung ausgenutzt werden. Es kommen dazu die bekannten, gegebenenfalls
aktivierten Träger in Präge, an die die Glucose-Isomerase
sehr leicht gebunden werden kann; u.U. genügt bereits einmaliges Filtrieren, vorteilhafterweise nach der Säulentechnik,
von Eulturfiltraten durch das Trägermaterial, um Enzympräparat emit
hoher Aktivität zu erhalten.
Ein besonders geeignetes Trägermaterial kann beispielsweise aus 1,3-Phenylendiamin und Glutardialdehyd in Gegenwart
von Silicagel auf folgende Weise erhalten werden:
Zu einer Lösung von 2,0 g 1,3-Phenylendiamin in 50 ml Benzol werden unter Rühren 30 g Silicagel gegeben. Nach
lCtoinütigera Rühren bei Raumtemperatur wird das Silicagel über
einen Büchner-Trichter abfiltriert und trocken gesaugt. Am Silicagel noch haftendes Benzol stört den weiteren Reaktionsverlauf nicht. Die mit 1,3-Phenylendiamin imprägnierten Silica- ■
geipartikel werden dann schnell unter kräftigem Rühren zu einem Gemisch aus 50 g Glutardialdehyd (25/^ige lösung in Wasser),
10 ml konz. Salzsäure und 340 ml Wasser gegeben. Estritt sofort
Polymerisation ein. Das orange-rote Polymer wird eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt, über einen Büchner-Trichter unter
vermindertem Druck abfiltriert und mit Wasser neutralgewaschen.
Die Isomerisierung der Glucose zu Fructose mittels Glucose-Isomerase aus Str. glaucescens kann bei Temperaturen
bis zu 8O0C, vorzugsweise 60-700C, einem pH-Wert von 6-9»
vorzugsweise 6,5 - 7»0, um alkalische Nebenreaktionen zu vermeiden, gewünsentenf alls in Gegenwart von Co -Ionen (vorzugsweise
0,0015 Mol/l) und Mg++-Ionen (vorzugsweise 0,01 Mol/l)
vorgenommen werden. Zweckmässigerweise wird mit einer Substratkonzentration
von 10 - 50$ gearbeitet.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung: 409836/1010
In einem 1-Liter Brlenmeyer-Kolben mit einer Schikane
wurden 400 ml eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung mit Sporen von Streptomyces glaucescens ETH 22794 angeimpft:
24OH2O 0,5 g
MgSO4-7H2O 0,25 g
Hefeextrakt 5,0 g
CaCO3 3,0 g
CoCl2·6Η20 50 mg
G-lucose 10 g
Es wurde mit 0,05 W Phosphatpuffer (pH 7,0) auf 1000 ml
aufgefüllt. Die Sporen wurden auf folgendem Medium erhalten:
| Glucose | 5,0 g |
| Asparaginsäure | 0,5 g |
| K2HPO4-JH2O | 0,5 g |
| MgSO4-.7H2O | 0,5 g |
| NaCl | 0,5 g |
| CaCO | 0,05 g |
| KOH 3#ig | 10 ml |
| Agar | 20 g |
Es wurde mit aqua dest. auf 1000 ml aufgefüllt und mit
NaOH ein pH von 7,0 eingestellt. Zum Animpfen wurde eine sterile wässrige Sporensuspension hergestellt. Nach 24stündiger submerser
Züchtung bei 300C auf einer rotierenden Schüttelmaschine
(110 UpM) wurde die Bildung der Glucose-Isomerase durch Zugabe von 2.% Xylose und 0,0025$ CoCl2 . 6H3O induziert.Die Bildung der
Glucose-Isomerase nahm folgenden Verlauf:
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— g _
| Induktionszeit (Std.) | Glucose-Isomerase (Einheiten*/ml) |
ext raz ellulär |
| 16 1/2 40 1/2 64 . 69 139 |
intrazellulär | 0,028 0,140 0,175 0,228 0,638 |
| 0,097 0,175 0,220 0,220 0,200. |
*) Eine Isomerase-Einheit ist diejenige Enzymmenge, die
aus einer 10$igeii Glucoselösung bei 700C und pH 7,0
in 1 Minute IpMoI Fructose bildet.
•Das extrazellulär gebildete Enzym wurde durch eine
Aethanolfällung vom Kulturfiltrat abgetrennt. Der Niederschlag
wurde in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7,0) aufgenommen.
Eine Kultur von Streptomyces glaucescens wurde, wie in
Beispiel 1,24 Stunden submers gezüchtet. Durch Zusatz von 0,5$
Xylose, 1,0$ pankreatischem Caseinhydrolysat und 0,0057» CoCl2*
6HpO wurde die Bildung von Glucose-Isomerase induziert.
28 Stunden nach Beginn der Induktion wurde das Mycel abzentrifugiert,
gewaschen und in ein Medium überführt, das nur 0,5$
Xylose, 1,0$ Caseinhydrolysat und 0,005$ CoCl2'6H2O enthielt,
wodurch eine wesentlich stärkere Enzymproduktion e.rreicht wurde. Die Bildung der intrazellulären Glucose-Isomerase nahm
folgenden Verlauf:
409836/1OtO
| Induktionszeit | Intrazelluläre Glueοse-Isomerase (Einheiten/ml KulturIb"sung) |
mit Trennung von Induktions- und Wachstumsphase |
| 28 | ohne Trennung von Induk- tions- und Wachstums phase ■ . |
0,030 |
| 47 | 0,055 | 0,170 |
| 75 | 0,100 | 0,400 |
| 100 | 0,180 | 0,610 |
| 120 | 0,250 | 0,770 |
| 0,310 |
Das intrazellulär gebildete Enzym wurde durch Ultraschallbehandlung
des Myce'ls Unter Kühlung mit Eiswasser für die Isolierung aufgeschlossen.
In einem mit einer Schikane versehenen 1 Liter Erlenmeyer-Kolben wurden 400 ml eines Nährmediums, mit einer sterilen
wässrigen Sporensuspension von Streptomyces glaucescens ETH 22794 angeimpft. Das Nährmedium hatte folgende Zusammensetzung:
Hefeextrakt Difco
MgSO4.7 Glucose
10 g 0,5 g 0,25 g
10 g
Es wurde mit destilliertem V/asser auf 1000 ml aufgefüllt
und mit NaOH ein pH-Wert von 7,2 - 7,3 eingestellt. Nach 40 Stunden wurde das Mycel mit einer Durchlaufzentrifμge
(75OO IT/min.) geerntet, mit O,95$iger steriler Natriumchloridlösung
gewaschen und in das Induktionsmedium übergeführt, das folgende Zusammensetzung hatte:
409836/1010
■ - - 11 -
Caseinhydrolysat (pankreatisch) ' 10,0 g
6H2O 0,24 g
7H2O 0,25 g-
24OH2O 0,50g
Xylose 5,0 g
Es wurde mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt
und mit FaOH ein pH-Wert von 7,0 eingestellt. Nach einer Induktionszeit von 52 Stunden betrug die Ausbeute an Glucose-Isomerase
2,2 Einheiten/ml Kulturlösung. Das Mycel wurde abzentrifugiert, zweimal mit 0,01 m Phosphatpuffer (pH 7,0), der bezüglich
MgCl2*6H2O 0,001 molar, bezüglich MgSO4-TH2O 0,001 molar und
bezüglich CoCl2*6H2O 0,001 molar war, gewaschen und in dieser
Pufferlösung bei 40C aufbewahrt. Das Enzym erlitt innerhalb
von 14 Tagen keine wesentlichen Aktivitätsverluste.
In einem zu Beispiel 3 analogen Ansatz wurde bei einer Induktionsdauer von 120Stunden eine Ausbeute an Glucose-Isomerase
von 3,5 Einheiten/ml Kulturlösung erreicht. Das Mycel wurde acetongetrocknet. Aus dem Trockenpulver wurde die Isomerase
durch Extraktion mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,0) bei 25°C zu 90?o isoliert.
In einem auf "/O1C gehaltenen Rührgefäss wurden 10 Liter
einer Lösung von 1 kg Glucose, 2,4 g CoCl2'6H2O und 2,5 g
MgSO4-7H2O im 0,05 M Acetatpuffer (pH 7,0) 4 Stunden lang
mit 244 g frisch geerntetem und hitzestabilisiertem Mycel (enthaltend 211OOO Isomerase-Einheiten) behandelt. Nach Entfernung
des Mycels durch Zentrifugieren wurden aus dem Filtrat 600 g Fructose in Form des Calcium-Doppelsalzes erhalten. Das
abgetrennte Mycel kann für weitere Isomerisierungen von Glucose
409836/1010
zu Fructose verwendet werden. In analoger Weise und gleich guter Ausbeute konnte Glucose zu Fructose isomerisiert werden, unter
Verwendung von 54,5 g ac e tongetrocknet em Mycel "bzw. unter Verwendung
von 91,1 g lyophilisiertem Mycel.
09836/1010
Claims (1)
1A-44 144
Patentansprüche
fi} Verfahren zur Herstellung einer.Glucose-Isomerase, dadurch
gekennzeichnet , daß man Mikroorganismen
der Species Streptomyces glaucescens in einem Nährmedium züchtet und die Glucose-Isomerase daraus isoliert.
2. Verfahren gemäß Anspruch 4> dadurch g e k e η η zeichnet
, daß man als Mikroorganismus Streptomyces glaucescens ETH-IIr. 22'79'4 verwendet.
5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet , daß das !Jährmedium als Induktionsinittel
Xylose oder ein durch den Mikroorganismus zu Xylose abbaubares Polysaccharid enthält.
4. Anwendung einer gemäß den Anbrüchen 1 Ms 3 erhaltenen
Glucose-Isomerase zur Herstellung von Fructose aus Glucose, indem man eine Glucose enthaltende Lösung mit Glucose-Isomerase
inkubiert und die erhaltene Fructose aus dem Reaktionsgemisch isoliert.
5. Anwendung nach Anspruch 4> dadurch gekennzeich
net , daß man die Glucose-Isomerase in situ erzeugt,
indem man die Glucose enthaltende Lösung mit einer Kultur von Streptomyces glaucescens inkubiert und die erhaltene
Fructose aus dem Reaktionsgemisch isoliert.
6. Anwendung gemäß Anspruch 4 oder 5» dadurch g e k e η η zeichnet
, daß man die Glucose enthaltende Lösung mit einer Kultur von Str. glaucescens ETH-IJr'. 22794 oder
einer daraus isolierten Glucose-Isomerase inkubiert.
- 2 409836/1010
7. Anwendung gemäß den· Ansprüchen 4 bis 6, dadurch ge kennzeichnet
,. daß man einen Mikroorganismus verwendet, in dem durch Züchtung auf einem Xylose oder
. ein durch den Mikroorganismus zu Xylose abbaubares PoIysaccharid
enthaltenden Nährboden die Bildung von Glucose-Isomerase induziert wurde.
409836/1010 original inspected
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
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