DE2549924A1

DE2549924A1 - Verfahren zur herstellung von l-cystein und l-cystin

Info

Publication number: DE2549924A1
Application number: DE19752549924
Authority: DE
Inventors: Keizo Matsuda; Koji Mitsugi; Ichiro Noda; Konosuke Sano; Fumihide Tamura; Kazuhiko Yamada; Naohiko Yasuda
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1974-11-06
Filing date: 1975-11-06
Publication date: 1976-05-13
Also published as: FR2290423B1; IT1054363B; FR2290423A1; DE2549924C2; US4006057A; GB1529315A

Description

Priorität : 6. November 1974, Japan , Nr. 127 153 3. Dezember 1974, Japan , Nr. 137 697

Verfahren zur Herstellung von L-Cystein und L-Cystin

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Cystein und L-Cystin.

Bisher wurde L-Cystin aus Hydrolysaten von proteinreichen Materialien, wie Haar, isoliert. L-Cystein wurde durch Reduktion von L-Cystin hergestellt. Diese Verfahren sind jedoch nachteilig, weil Haar nicht in wirtschaftlicher Weise technisch zugänglich ist.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von L-Cystein und L-Cystin zugänglich zu machen, das mit niederen Kosten großtechnisch anwendbar ist.

Es wurde nun festgestellt, daß 2-Amino-thiazolin-4-carbonsäure (nachstehend auch als ATC bezeichnet) die ein leicht in großer Menge zugängliches und wirtschaftliches Ausgangsmaterial darstellt, enzymatisch in sehr hoher Ausbeute in L-Cystein und L-Cystin umgewandelt werden kann. Es wurde ferner gefunden, daß das erforderliche Enzym, welches Aktivität für die Umwandlung von ATC in L-Cystein und L-Cystin zeigt (nachstehend als ATC hydrolysierendes Enzym be-

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zeichnet) durch verschiedene Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, produziert wird. Die Mikroorganismen, welche das ATC hydrolysierende Enzym bilden, können als wachsende Kulturen in einem ATC als Stickstoffquelle enthaltenden Medium selektiert werden.

Die Erfindung wird nachstehend ausführlicher erläutert. Mikroorganismen, die ATC hydrolysierendes Enzym produzieren, sind weit verbreitet, speziell unter Bakterien. Die Mikroorganismen können in einem Medium wachsen, das ATC als einzige Stickstoffquelle enthält und werden aus natürlichen Quellen in einfacher Weise nach folgender Methode erhalten :

Proben aus natürlichen, Mikroorganismen enthaltenden Quellen werden in das Selektionsmedium eingeimpft, welches pro Deciliter 0,3 g DL-ATC.3H₂O, 1,0 g Glycerin, 0,01 g Hefeextrakt, 0,1 g KH₂PO₄ 0,05 g MgSO₄.7H₂O und 2,0 g Agar enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat. Das beimpfte Medium wird 1 bis 5 Tage bei 30⁰C bebrütet.

Fast alle Mikroorganismen, die auf dem oben angegebenen Medium wachsen, bilden das ATC hydrolysierende Enzym.

Die Herstellung von L-Cystein und/oder L-Cystin aus ATC mit Hilfe der auf dem Selektionsmedium gezüchteten Mikroorganismen kann bestätigt werden, indem das nachstehende Reaktionsgemisch während Stunden bei 3O⁰C mit dem Enzym des Mikroorganismus im Gemisch gehalten wird: ein Reaktionsgemisch, enthaltend 1,0 g DI-ATC.3H₂O, 0,01 g Pyridoxalphosphat und 1,0 g KH₂PO₄ mit einem pH-Wert von 8.

L—Cystein und I-Cystin, die in dem Reaktionsgemisch gebildet werden, sind durch Papierchromatographie nachweisbar.

Geeignete Beispiele für Mikroorganismenkulturen, die zur Bildung des Enzyms befähigt sind, sind nachstehende Mikroorganismen:

Sarcina lutea ' AJ 1217 ATCC 272 Achromobacter delmarvae AJ 1983 PERM-P 21

Alcaligenes denitrificans AJ 2553 ATCC 15173

Bacillus brevis AJ 1282 ATCC 8185

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549924

Brevibacterium flavum Enterobacter aerogenes Erwinia carotovora Escherichia coli Micrococcus sodonensis Mycoplana dimorpha Serratia marcescens Flavobacterium acidoficum Pseudomonas ovalis Pseudomonas thiazolinophilum Pseudomonas ovalis Pseudomonas desmolytica Pseudomonas desmolytica Pseudomonas cohaerens Pseudomonas ovalis Pseudomonas ovalis Pseudomonas ovalis Pseudomonas ovalis Pseudomonas desmolytica Pseudomonas desmolytica Pseudomonas desmolytica Pseudomonas desmolytica

AJ 3854, AJ 3863, AJ 3868, AJ 3869, AJ 3874, AJ 3865, AJ 3871, AJ 3870, AJ 3864, AJ 3866, AJ 3867, AJ 3873 und AJ 3872 wurden von der Anmelderin neu isoliert.

Die neu isolierten Stämme haben folgende taxonomische Eigenschaften :

AJ	1516	ATCC 13826	2764	2765	2762
AJ	2643	FERM-P	2766	ATCC 8366	2810
AJ	2753	FERM-P	2763	FERM-P	2811
AJ	2592	FERM-P	ATCC 11880	FERM-P	2816
AJ	1753	ATCC 4279	FERM-P	2817
AJ	2809	FERM-P	FERM-P	2831
AJ	2698	FERM-P	2812
AJ	2494	FERM-P	2813
AJ	2236	FERM-P	2814
AJ	3854	FERM-P	2815
AJ	3863	FERM-P	2818
AJ	3868	FERM-P	2819
AJ	3869	FERM-P	2820
AJ	3874	FERM-P	2821
AJ	3864	FERM-P
AJ	3865	FERM-P
AJ	3866
AJ	3867
AJ	3870
AJ	3871
AJ	3872
AJ	3873

809820/1189

	AJ 3854	AJ 3863	AJ 3868	AJ 3869	AJ 3874
Zellform	Stäbe 0,6-0,8 X 1,5-2 ^u	Stäbe 0,6-0,8 X 1,3-1,8 ρ	Stäbe 0,6-0,8 X 1,4-1,8 μ	Stäbe 0,6-0,8 X 1,4-1,8 ρ	Stäbe 0,6-0,8 X 1,2-2 u
Pleomorphis- mus	keiner	keiner	keiner	keiner	keiner
Motilität	beweg lich	beweg lich	beweg lich	beweg lich	beweg lich
Begeißelung	polar	polar	polar	polar	polar
Sporen	fehlen	fehlen	fehlen	fehlen	fehlen
Säurebestän digkeit	nega tiv	nega tiv	nega tiv	nega tiv	nega tiv
Gram-Färbung 12 h 24 72	negativ Il η	negativ π η	negativ Il Il	negativ π Il	negativ Il H
Agarkolo- nien Wachstum Form Erhebung Kanten begrenzung Farbe	mäßig kreis förmig konvex voll ständig beige	reichlich kreis förmig konvex voll ständig rosa beige	mäßig kreis förmig konvex voll ständig stroh gelb	mäßig kreis förmig konvex voll ständig beige- rosa beige	reich lich kreis förmig konvex voll ständig blaß orange- gelb

ΒΠ9820/1 189

	AJ 3854	AJ 3863	AJ 3868	AJ 3869	AJ 3874	89
Schrägagar
Wachstum	gut	reich lich	reich lich	reich lich	reich lich
Oberfläche	glatt	glatt	glatt	glatt	glatt
Farbe	beige	rosa beige	stroh gelb	rosa beige	blaß- orange gelb
Glanz	opak	opak	' opak	opak	opak
Form	faden förmig	faden förmig	faden förmig	faden förmig	faden förmig
Nährbrühe
Trübung	trüb	trüb	trüb	trüb	trüb
Oberflächer wachstum	keines	keines	Ring	keines	keines
Sedimenta tion	Sedi ment	Sedi ment	Sedi ment	Sedi ment	Sedi ment
Gelatine- Stichkultui
2O⁰C (1 Mo nat) 37⁰C (1 Mo nat)	—	-	—	-	++ +++
Gelatine platte	+	+	+	+	++
Verflüssi gung		-	-	—	++
Wachstum aui King-Mediun B Wasserlös liches Pig ment	++ keines	+++ gelblich- grün	+++ keines	+++ keines	+++ keines
		fluores zierend
	6	09820/1 *

	AJ 3854	AJ 3863	AJ 3868	AJ 3869	AJ 3874
Wachstum auf Glutamat- Medium wasserlösli ches Pigment	++ keines	++ gelblich grün fluores zierend	++ keines	++ keines	++ blaß braun
Lackmus-Milch Reduktion Verflüssigung	nicht re duziert	nicht re duziert	nicht re duziert	leicht re duziert	nicht re du ziert +++
BCP-Milch PH Verflüssi gung	alka lisch	alka lisch	alka lisch	alka lisch	alka lisch +++
Tyr os in Bouillon- Platte Wachstum wasserlös liches Pigment	++	++	+++	+++	j +++ ■
Reduktion von Nitraten Bouillon- Medium synthetisches Medium	++ +	+++ +++	+ +	+ +	\ ¥ ++ ί. ■; ++ ; {■
MR-Test	-	—	-	-	f ί.
VP-Test pH (1 Woche)	5.1	4.9	7.5	' 7.5	i NT ;

609820/118

	AJ 3 863	AJ 3868	AJ 3869	AJ 3874
Indol	- "	-	-	-
H₂S	+	+	+	+
Hydrolyse von Stärke	-	-	-	-
Ausnutzung von Zitronensäure Koser-Medium Christensen- Medium	+ +++	+ +++	++ +++	++ +++
Assimilation von anorgani schem Stick- ' stoff Nitrate Ammoniak	+++ +++	+ +++	-	+++ +++
wasserlösli ches Pigment	gelblich grün fluores zierend	keines	keines	.keines
Katalase	-	-	-	-
Urease	++	++	++	+
Oxydase	+++	+++	+++	-
Wachstum pH	5-9	5-9	5-9	6-9
Maximale Wachs- tuinstemperatur	39°C	37°C	38°C	38°C
AJ 3854
-
+
-
+ ++
+++ +++
keines
-
-
+++
5-9
35°e

609820/1 189

	D-Mannose	AJ 3854	AJ 3863	AJ 3868	AJ 3869	AJ 3874
Optimale Wachs - tumstempera tur	D-Fructose	20-35⁰C	20-37⁰C	25-37°C	28-38°C	B 37°C
Aerob!öse	D-Galactose	aerob.	aerob.	aerob	aerob	aerob
Bildung von Säure und Gas aus Kohlen hydraten	Maltose	Säure Gai	i Säure Gas	Säure Gas	Säure Gas	Säure Ga»
L-Arabinose	Saccharose	- -	- -	- -	_ _	+
D-Xylose	Lactose	- -	-H-+	- -	- -	- -
D-Glucose 0	Trehalose	++	++	++	++	++
F	D-Sorbit	- -	- - —	_ _	- _	- -
D-Mannit	++	+++	++	+++	+
Inosit	- -	++	-	- -	- -
Glycerin Stärke	++ T-	+++	- -	++	-
D-Ribose	- -	- -	_	- -	- _
L-Rhamnose	- -		_ -	- -	- -
L-Raffinose	- -	- -	_ _	-. -	+++
_ _	- -	_ _	-	-
- -	- -	- -	- -	- -
- -	-	- -	- -	- -
.- _	- -	_ _	- -	_ _
— mm		— —	++	— —
- -	+++	_ _	- -
- -	- -	-	- -	- —
- -	-	- -	- -	- -

609820/1189

AJ 3854 AJ 3863 AJ 3868 AJ 3869 AJ 3874

Bildung von Säure und Gas .aus Kohlen-

¹ hydraten

Erythrit DuIcit Cellobiose Melibiose Adonit Salicin Aesculin

Säure Gas Säure Gas Saure Gas Säure Gas Säure Gas

ι (Hydrolyse von 'Casein rdrolyse von

! !Wachstum auf

iWaCl-

toedium

kein Wachs- Wachstum auf tum auf

2 g/dl

5 g/dl Wachst.
auf

weniger
als
g/dl

Wachst,
auf

weniger
als
g/dl

Wachstum auf

g/dl

'.Assimilation

i p-Hydroxy-I benzoesäure

Gluconsäure Lactose Mannit

Ammoniumacetat

Milchsäure Glucose Xylose

Protocatechusäure +4-
+ 4

NT

NT NT

NT

NT NT

	Desoxycholsäu- re-Medium von "EIKEN" Co. Wachstum (35 C 1 Tag)	AJ 3854	AJ 3863	AJ 3868	AJ 3869	AJ 3874
1	ι GC-Gehalt in DNS		++	++	+	+
Zersetzung von Riboflavin	58.3%	NT	NT	NT	NT
I Bildung von ; Indigotin aus Indol i	-	NT	NT	NT	NT
	-	NT	NT	NT	NT

0 9 82 0/1189

	AJ 3865	AJ 3871	AJ 3870	AJ 3864	AJ 3866	AJ 3867	AJ 3873	AJ 3872
Zellform	Stäbe	Stäbe	Stäbe	Stäbe	Stäbe	Stäbe-	Stäbe	Stäbe
Gram-Färbung	negativ	negativ	negativ	negativ	negativ	negativ	negativ	negativ
MotilitSt	bewegl.	bewegl.	bewegl.	bewegl.	bewegl.	bewegl.	bewegl.	bewegl.
O ■'•° Begeißelung	polar	polar	polar	polar	polar	polar	polar	polar
d Katalase ..V	positiv	positiv	positiv	positiv	positiv	positiv	positiv	positiv
oo Oxydase	positiv	positiv	positiv	positiv	positiv	positiv	positiv	positiv
Aerobiose	aerob	aerob	aerob	aerob	aerob	aerob	aerob	aerob
Wachstum auf King-B-Medium wasserlösliches Pigment	++ gelblich grün fluores zierend	++ keines	+ keines	+ keines	++ gelblich grün fluores zierend	++ gelblich grün fluores zierend	+ keines	+ keines

	AJ 3865	AJ 3871	AJ 3870	AJ 3864	AJ 3866	AJ 3867	AJ 3873	AJ 3872	cn
Glutaminsäure- Medium									CD CO
* Wachstum	+++ .	+++	+++	+++	+++	+++	++ ■;■	'.*+■■"	ΓΌ
wasserlösli ches Pigment •or?	gelblich grün fluores zierend	keines	keines	gelblich grün fluores zierend	gelblich grün fluores zierend	gelblich grün fluores zierend	keines	keines
*J Gelatine- ^ platte	nicht ver flüssigt	-nicht ver flüssigt	-nicht ver flüssigt	-nicht ver flüssigt	-nicht ver flüssigt	-nicht ver flüssigt	-nicht ver flüssigt	- nicht ver flüssigt
^ Desoxycholat- 4O Medium
Wachstum	⁺			+	+	+		⁺
Wachstum bei 38° C			₊	mm	mm	++	₊	++
37° C	+	+	++	+	+	++	+	++
42° C	-	-	⁺	-	—	⁺⁺	±
Lackmus-Milch
Reduktion	-	—	—	—	— :		—
Verflüssigung	-	—	-	—	-	-	—

en

CD OD

OO

	AJ 3865	AJ 3871	AJ 3870	AJ 3864	AJ 3866	AJ 3867	AJ 3873	AJ 3872
BCP-Milch PH Verflüssigung	alkalisch	alkalisch	alkali sch	alkalisch	alkalisch	alkalisch	alkalisch	alkalisch
Assimilation von p-Hydroxybenzoe- säure		♦			-			-♦
Reduktion von Nitrat	-H-
Ausnutzung von Zitronensäure ' Koser-Medium Christensen- Medium
Hydrolyse von Stärke	-	-	-	-	-	-	-	-

cn CD ro

Die vorstehend aufgeführten Versuche zur Identifizierung wurden nach dem "Manual of Microbiological Methods", M.J. Pelczar Jr. McGraw Hill (1957), durchgeführt. Die Züchtung erfolgte bei 30⁰C.

Die Identifizierung wurde entsprechend "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7. Auflage (1957) durchgeführt.

1) AJ 3854

Dieser Stamm ist oxydasepositiv, gramnegativ, bildet Stäbchen und zeigt polare Geißeln. Er gehört daher dem Genus Pseudomonas an. Dieser Stamm gleicht Ps. riboflavina, Ps. denitrificans und Ps. indoloxydans im Hinblick darauf, daß der Stamm keine wasserlöslichen Pigmente bildet, Gelatine nicht verflüssigt und bei 25°C, nicht jedoch bei 37°C wächst.

Dieser Stamm unterscheidet sich jedoch von Pseudomonas riboflavina darin, daß Ps. riboflavina Riboflavin zersetzt und Ammoniak und Nitrate nicht ausnutzt. Der Stamm unterscheidet sich ferner von Ps. denitrificans, dadurch, daß er keine Denitrifizierung von Nitraten verursacht. Der Stamm unterscheidet sich von Ps. indoloxydans, indem er aus Indol kein Indigotin bildet.

Es handelt sich daher bei diesem Stamm um eine neue Species des Genus Pseudomonas, der als Pseudomonas thiazolinophilum bezeichnet wird.

Dieser Stamm wurde bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Inage, Chiba City, Japan, unter der Hinterlegungsnummer PERM-P 2810 hinterlegt.

2) AJ 3863, AJ 3864, AJ 3865, AJ 3866 und AJ 3867

Diese Stämme wurden als Pseudomonas ovalis identifiziert und wurden bei-dem Fermentation Research Institute unter den Hinterlegungsnummern PERM-P 2811 (AJ 3863), PERM-P 2812 (AJ 3864), PERM-P 2813 (AJ 3865), PERM-P 2814 (AJ 3866JmId PERM-P 2815 (AJ 3867) hinterlegt.

3) AJ 3868, AJ 3869, AJ 3870, AJ 3871, AJ 3872 und AJ 3873 Diese Stämme wurden als Pseudomonas desmolytica identifiziert und sind bei dem Fermentation Research Institute ueter den Hinterle-

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gungsnummern FERM-P 2816 (AJ 3868), FERM-P 2817 (AJ 3869), PERM-P 2818 (AJ 3870)_Λ PERM-P 2819 (AJ 3871), PERM-P 2820 (AJ 3872) PERM-P 2821 (AJ 3873) hinterlegt.

4) AJ 3874

Dieser Stamm wurde als Pseudomonas cohaerens identifiziert und ist bei dem Fermentation Research Institute unter der Hinterlegungsnummer PERM-P 2831 hinterlegt.

um ATC-hydrolysierendes Enzym zu bilden, werden die vorstehend angegebenen Mikroorganismen in einem üblichen Medium vom pH 6 bis 9, das Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Ionen und erforderlichenfalls organische Spurennährstoffe enthält, gezüchtet.

Als Kohlenstoffquellen werden übliche Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Saccharose, Glycerin, Äthanol und Essigsäure, eingesetzt. Geeignete Stickstoffquellen sind beispielsweise Ammoniumionen und gasförmiges Ammoniak. Als organische Spurennährstoffe eignen sich beispielsweise Vitamine und Aminosäuren sowie Rohmaterialien, welche diese organische Spurennährstoffe enthalten, wie Hefeextrakt, Pepton, Bouillon und Maiquellflüssigkeit.

Es werden übliche anorganische Ionen verwendet, wie Manganionen, Ferriionen, Ferroionen, Phosphationen, Kaliumionen oder Magnesiumionen. Manganionen und Perroionen werden vorzugsweise in einer Menge von mehr als 0,01 mM, insbesondere 0,1 mM, eingesetzt. Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen bei 20 bis 40⁰C während 1 bis 3 Tagen durchgeführt.

In der erhaltenen Kulturbrühe und insbesondere in den Mikrobenzellen liegt hohe Enzymaktivität vor. Als Enzymquelle werden vorzugsweise die Kulturbrühe, intakte Zellen, Zellhomogenisat, das durch Ultraschall erhaltene Zerkleinerungsprodukt der Zellen, gefriergetrocknete Zellen, mit Lösungsmittel getrocknete Zellen usw. eingesetzt. Außerdem werden als bevorzugte Enzymquelle aus diesen Materialien abgetrennte Proteinfraktionen, beispielsweise Protein-

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fraktionen, die aus dem Homogenisat von Zellen oder den mit Ultraschall zerkleinerten Zellen mit Hilfe üblicher Methoden, wie durch Gelfiltration oder durch Aussalzen, abgetrennt worden sind, verwendet.

Speziell-Zellen, die mit einem organischen lösungsmittel oder einem oberflächenaktiven Mittel behandelt worden sind, Zellhomogenisate, mit Ultraschall behandelte Zellen und Zellen, die mit lysierenden Enzymen von Mikrobenzellen behandelt worden sind, werden vorteilhaft eingesetzt.

Zu bevorzugten organischen lösungsmitteln gehören niedere Alkanole, wie Methanol und Äthanol, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Toluol und Xylol, Alkylketone, wie Aceton, Methyläthylketon, und chlorierte Alkane, wie Chloroform. Gewöhnlich werden die Zellen in dem organischen Lösungsmittel oder in einer wässrigen Lösung des organischen Lösungsmittels suspendiert und 10 bis 120 Minuten bei 20 bis 60⁰C gehalten.

Die verv/endeten oberflächenaktiven Mittel sind vorzugsweise kationische oder anionische» oberflächenaktive Mittel, wie Salze von höheren Fettsäuren, Sulfonsäure-alkylester, wie Alkylbenzolsulfonat, Salze von Gallensäuren, Alkylamine und quaternäre Ammoniumsalze. Die Zellen werden in einer Lösung des oberflächenaktiven Mittels, die 0,0005 bis 0,1 % des oberflächenaktiven Mittels enthält, suspendiert und mit dieser in Berührung gehalten.

Die Zellhomogenisate und die ultraschallbehandelten Zellen können in üblicher und wohlbekannter Weise hergestellt werden.

Lysierende Enzyme von Mikrobenzellen werden durch verschiedene Mikroorganismen, wie Bacterium, und durch Actinomyceten, produziert.

Das wässrige Reaktionsgemisch enthält das Enzym oder die Enzymquelle, die vorstehend erwähnt wurden, ATC und erforderlichenfalls

Pyridoxalphosphat und/oder Metallionen.

Wenn das Reaktionsgemisch zusätzlich 0,03 bis 2 mM Ferroionen oder

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0,03 bis 2 mM lerriionen enthält, werden höhere Ausbeuten an !-Cystein und L-Cystin erzielt. Hydroxylamin oder Semicarbazid verhindert die Zersetzung des in dem Reaktionsgemisch angereicherten L-Cysteins oder 1-Cystins.

Die Menge von ATC in dem Reaktionsgemisch beträgt vorzugsweise 0,1 bis 30 ?έ, insbesondere 0,5 bis 10 $>. Während der Reaktion wird der pH-Wert des Reaktionsgemisches bei 5 bis 11, vorzugsweise 7 bis 9,5, gehalten. Die Temperatur wird vorzugsweise bei 15 bis 60⁰C und insbesondere bei 30 bis 50⁰C, gehalten.

Gewöhnlich werden in dem Reaktionsgemisch sowohl !-Cystein als auch !-Cystin angereichert. Es ist jedoch auch möglich, ausschließlich !-Cystin zu bilden, indem die Reaktion unter oxydierenden Bedingungen durchgeführt wird. Im Gegensatz dazu können höhere Mengen an !-Cystein unter reduzierenden Bedingungen gebildet werden.

Da !-Cystin weniger löslich ist als !-Cystein, wird gewöhnlich !- Cystein in dem Reaktionsgemisch zu !-Cystin oxydiert und das gebildete !-Cystin kristallisiert aus dem Reaktionsgemisch aus. !-Cystin wird in einfacher Weise durch elektrolytische Reduktion in !-Cystein umgewandelt.

!-Cystein und !-Cystin wurden in dem Reaktionsgemisch durch ]plüssigkeitschromatographie und durch die biologische Prüfmethode (Bioassay-Methode) unter Verwendung von !euconostoc citrovorum ATCC 8081 nachgewiesen. Dieser Stamm spricht sowohl auf !-Cystein als auch auf !-Cystin an, spricht Jedoch nicht auf D-Cystein und D-Cystin an. Wenn daher !-Cystein und !-Cystin mit Hilfe der biologischen Prüfmethode bestimmt werden, so wird die Gesamtmenge an !-Cystein und !-Cystin erhalten. Diese Gesamtmenge wird in dieser Beschreibung als Menge an !-Cystin bezeichnet.

Beispiel 1

Eine Bodenprobe wurde auf dem nachstehend angegebenen Selektionsmedium ausgebreitet und das Medium wurde 4 Tage bei 30⁰C inkubiert:

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Serektiönsmedium

DI-ATC.3H₂O	pH-7 (NaOH)	0,3	g/dl
Glycerin	1,0	Il
Hefeextrakt	0,01	Il
KH₂PO₄	0,1	Il
MgSO₄.7H₂O	0,05	It
Agar	2,0	It

Die auf dem Selektionsmedium gewachsenen Stämme wurden isoliert und in das nachstehend angegebene Kulturmedium eingeimpft und 24 Stunden bei 30⁰C gezüchtet :

	Kulturmedium	1,0	g/dl
Glycerin		0,5	H
Hefeextrakt		0,5	Il
Pepton		0,5	Il
Bouillon		0,5	Il
NaCl		0,2	Il
DL-ATC.3H₂O
pH	7,0 (KOH)

Die auf dem Kulturmedium gezüchteten Zellen wurden gewonnen und in einem wässrigen Reaktionsgemisch suspendiert, welches, pro Deciliter, 1,0 g DL-ATC.3H₂O und 1,0 g KH₂PO₄ enthielt und einen pH-Wert von 8 hatte. Die Suspension wurde 24 Stunden bei 30⁰C gehalten. Das in dem Kulturmedium angereicherte L-Cystein und L-Cystin wurden bestimmt.

Die wirksamsten L-Cystin bildenden Stämme, AJ 3854, AJ 3863, AJ 3864, AJ 3865, AJ 3866, AJ 3867, AJ 3868, AJ 3869, AJ 3870,

4.

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AJ-3871, AJ 3872, AJ 3873 und AJ 3874 wurden in der vorstehend angegebenen Weise durch Selektion gewonnen.

Beispiel 2

Zellen von Pseudombnas thiazolinophilum AJ 3854 (PERM-P 2810) wurden auf einem Medium gezüchtet, welches pro Deciliter 1 g Glycerin, 0,5 g Hefeextrakt, 0,5 g Pepton, 0,5 g Bouillon, 0,5 g NaCl und 2 g Agar enthielt und einen pH-Wert von 7,0 hatte. Die Züchtung wurde 24 Stunden bei 30⁰C durchgeführt. Danach wurden die Zellen gewonnen und in ein wässriges Kulturmedium eingeimpft, welches pro Deciliter 2 g Glucose, 0,3 g (NH^^SO^, 0,2 g DI-AOiC. 3H₂O, 0,1 g KH₂PO₄, 0,05 g MgSO₄.7H₂O, 2 g CaCO₅, 1 mg FeSO₄. 7H₂Q, 0,8 mg MnSO₄.4H₂O und die in Tabelle 1 gezeigte Menge an MnSO₄.4H₂O enthielt. 50 ml des Kulturmediums wurden in 500 ml-Kolben gegeben und unter Schütteln 24 Stunden bei 30⁰C gehalten.

Bin Volumteil des Kulturmediums, das mit jeder in !Tabelle 1 aufgeführten Züchtungsdauer erhalten wird, wird mit einem Volumteil einer ATC-lösung vermischt, die pro Deciliter 2 g DI-ATC.3H₂O, 2 g KH₂PO₄ und 0,28 g NH₂OH.HCl enthält und einen pH-Wert von 8,2 hat, und das Gemisch wird 2 Stunden bei 40⁰C gehalten. Die Gesamtmenge an L-Cystein und I-Cystin wurde mit Hilfe der biologischen Prüfmethode (Bio-assay-Methode) bestimmt. ■

Das Wachstum des Mikroorganismus in dem wässrigen Kulturmedium wurde bestimmt, indem die optische Dichte der Kulturbrühe, die mit 0,1 η HCl auf das 26-fache verdünnt worden war, bei 562 nm gemessen wurde (O.D.).

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

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TABELLE 1

σ :ο co .XJ

zugesetztes MnSO₄.4H₂O	Wachstum L-Cystin pg/ml/O.D	Züchtungsdauer (h)
	Wachstum L-Cystin pg/ml/O.D	0 3 6 9 12 15 18' 21 24
10 mM	0.005 0.025 0.143 0.468 0.74 0.75 0.74 0.72 0.71 1140 2620 , 1860 1060 1100 1000 853 1090
	0.006 0.019 0.094 0.312 0.62 0.75 0.73 0.73 0.71 526 21800 3890 2160 1810 1870 1280 1280

f\3

LO CD

7549974

In dem Medium, das 10 mM MnSO..4HpO enthielt, wurde Ps. desmolytica AJ 3871 6 Stunden lang gezüchtet.

Zu 100 ml der so erhaltenen Kulturbrühe wurden 3 g DL-ATO.3H₂O und 0,14 g NHp^0I*·^H^l zugesetzt und das Gemisch wurde 20 Stunden lang inkubiert. Danach hatten sich 2,3 g L^-Cystin gebildet.

Beispiel 3

Ps. thiazolinophilum AJ 3854 wurde 6 Stunden lang in dem in Beispiel 2 gezeigten Medium bei 30⁰C gezüchtet, jedoch mit der Abänderung, daß das Medium anstelle von 10 mM MnSO..4HpO die in Tabelle 2 angegebene Menge des gleichen Mangansalzes enthielt. Unter Verwendung jeder so erhaltenen Kulturbrühe wurde in einem analogen Reaktionsgemisch wie in Beispiel 2 die in Tabelle 2 gezeigte Menge an I-Cystin gebildet, nachdem das Reaktionsgemisch 2 Stunden bei 40⁰C gehalten worden war.

Tabelle 2

MnSO..4H₂O gebildetes I-Cystin

0	1 mM	i
	5
o,
1
5 10
Beis/piel 4

446 ug/ml	(100)
1214	(272)
1386	(311)
1444	(324)
1480	(332)
1472	(330)

Pseudomonas thiazolinophilum AJ 3854 (FERM-P 2810) wurde 15 Stunden bei 30⁰C in einem wässrigen Medium gezüchtet, das in Anteilen von je 50 ml in 500 ml-Kolben gegeben worden war. Dieses Medium enthielt pro. Deciliter 2 g Glycerin, 0,5 g Hefeextrakt, 0,5 g

609820/1189

Pepton, 0,25 g NaCl, 0,2 g DL-ATC.3H₂O und hatte einen pH-Wert von 7,0. Die gebildeten Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen und mit 0,8 $iger NaCl-Lösung gewaschen.

5 ml eines Reaktionsgemisches, welches 1 g DI-ATC.3HpO, 1 g KH₂PO. und 5 g der gewaschenen Zellen enthielt, wurde 2 Stunden bei 40⁰C gehalten.

Der in dem Reaktionsgemisch gebildete Niederschlag wurde durch Zugabe von 6 η HCl zu dem Gemisch gelöst und die in dem Reaktionsgemisch gebildete Menge an L-Cystin wurde mit Hilfe der Bio-assay-Methode bestimmt.

Außerdem v/urden die gewaschenen Zellen in einer Lösung eines oberflächenaktiven Mittels suspendiert, welche die in Tabelle 3 angegebene jeweilige Menge an Natrium-dodecylsulfat oder Cetyltrimethylammoniumchlorid enthielt. Die Suspension wurde 1 Stunde bei 30⁰C gehalten.

Die Zellen wurden in dem gleichen Reaktionsgemisch wie oben suspendiert und die Suspension wurde 2 Stunden bei 40⁰C gehalten. Dabei wurden die in Tabelle 3 gezeigten Ergebnisse erzielt.

609 820/1 189

TABELLE 3

Oberflächenaktives Mittel	gebildetes L-Cystin ^₁	Relative Aktivi tät %
O.Ol Natrium- dodecylsulfat 0.05 0.1 0.5	2420 3600 3370 33 O	110 162 152 1 O
0.01 0.05 Cetyltrimethyl- ammoniumchlorid ο. 1 0.5 1	. 23.20 2990 156 30 14	104 135 7 1 1
keines -' .	2220	100

609820/1189

Beispiel 5

Pseudomonas thiazolinophilum AJ 3854 wurde in dem gleichen Medium wie in Beispiel 4 während 24 Stunden bei 30⁰G gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen und mit 0,8 $iger NaCl-Lösung gewaschen.

Die Zellen wurden in dem gleichen Reaktionsgemisch wie in Beispiel 4 SU;
ten.

4 suspendiert und die Suspension wurde 2 Stunden bei 30⁰C gehal-

Außerdem wurden in gleicher Weise zubereitete gewaschene Zellen während einer in Tabelle 4 gezeigten Dauer mit Ultraschallwellen behandelt, die durch einen Ultraschallgenerator Modell UR-200P der Tomy-Seiko Co., ltd. erzeugt wurden. Die ultraschallbehandelten Zellen wurden anstelle der gewaschenen Zellen in der gleichen Reaktion wie vorher verwendet.

Das in jedem Reaktionsgemisch gebildete L-Cystin wurde mit Hilfe der Bio-assay-Methode bestimmt. Die optische Dichte des auf das 26-fache verdünnten Reaktionsgemisches wurde ebenfalls bei 562 nm bestimmt.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.

. Tabelle 4

Behandlung mit Ultraschall O.D. gebildetes !-Cystin

0 . min

1,20	590	pg/ml
0,78	700
0,372	910
0,318	950
0,285	630

809 8 20/1189

Beispiel 6

Pseudomonas ovalis AJ 3865 (FERM-P 2813) wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 4 gezüchtet. Zu 10 ml der erhaltenen Kulturbrühe wurde 0,5 ml Toluol zugesetzt, das Gemisch wurde 30 Minuten bei 30⁰C gehalten und danach wurden außerdem 10 ml einer Lösung zuge setzt, die 2 g/dl DL-ATC.3H₂O, 1 g/dl KH₂PO₄ und 0,14 g/dl HCl enthielt.

Das Gemisch wurde auf einen pH-Wert von 8,2 eingestellt und 2 Stunden bei 40⁰C gehalten.

Das Reaktionsgemisch, das mit den Toluol-behandelten Zellen erhalten worden war, enthielt 1100 ug/ml L-Cystin, während das Reaktionsgemisch, das unter Verwendung von intakten Zellen erhalten worden war, 310 ug/ml L-Cystin enthielt.

Beispiel 7

Zellen von Pseudomonas desmolytica AJ 3891 (PERM-P 2819), die in gleicher Weise wie in Beispiel 5 gebildet worden waren, wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 6 mit 5 1° Chloroform behandelt. Bei Verwendung der mit Chloroform behandelten Zellen wurden 350 ug/ ml L-Cystin gebildet, während bei Verwendung der intakten Zellen 240 pg/ml L-Cystin gebildet wurden.

Beispiel 8

Pseudomonas thiazolinophilum AJ 3854 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 5 gezüchtet.

Außerdem wurde Bacillus subtilis YT-25, das zur Bildung eines die Zellen lysierenden Enzyms befähigt ist, 30 Stunden bei 30⁰C in einem Medium gezüchtet, welches, pro Deciliter, 1 g Pepton und 1 g Bouillon, 0,3 g NaCl und 0,5 g Glucose enthielt und einen pH-Wert von 6,0 hatte, wie in Agr. Biol. Chem. 38, 2305 (1974) beschrieben ist.

Die Kulturbrühe von AJ 3895 (9 ml) wurde mit 1 ml der Kulturbrühe von YT-25 oder mit 1 ml Wasser vermischt. Jedes Gemisch wurde 1

609820/1189

Stunde bei 3O⁰C gehalten.

Danach wurde zu beiden Gemischen, pro Deciliter, 1 g DL-ATC.3H_?0 und 1 g KHpPO. zugesetzt und die Gemische wurden 2 Stunden bei 40⁰C gehalten.

In dem zuerst genannten Gemisch wurden 390 ug/ml L-Cystin gebildet, während in dem zuletzt genannten Gemisch 290 ug/ml L-Cystin gebildet wurden.

Beispiel 9

Es wurden gewaschene Zellen von Pseudomonas thiazolinophilum AJ 3854 gewonnen.

Dann wurde ein Reaktionsgemisch hergestellt, welches pro Deciliter 5 g der gewaschenen Zellen, Ig DI-ATC. 3H₂O, 0,14 g HH₂OH.HCl und 1 g KH₂PO. enthielt und einen pH-Wert von 8 hatte. Dieses Gemisch wurde bei 40⁰C gehalten. Die nach jeder in Tabelle 5 gezeigten Reaktionszeit gebildeten Mengen an !-Cystein und L-Cystin wurden mit Hilfe der Bio-assay-Methode und durch FlüssigkeitsChromatographie bestimmt.
Dabei wurden die in Tabelle 5 aufgeführten Ergebnisse erzielt.

	1	Tabelle 5	24	48
•	2,48 1,22		1,83 3,79	0,63 4,96

	Reaktionszeit (h)
L-Cystein L-Cystin ·	7
Beispiel 10	2,51 1,89

Es wurde ein wässriges Kulturmedium hergestellt, welches pro Deciliter 1 g Glycerin, 0,5 g Hefeextrakt, 0,5 g Pepton, 0,5 g Bouillon,

609820/1189

0,5 g NaCl und 0,2 g DL-ATC.3HpO enthielt, und auf einen pH-Wert ■von 7 eingestellt.

50 ml-Anteile des wässrigen Kulturmediums wurden in 500 ml.-Kolben gegeben, mit Jedem der in Tabelle 6 gezeigten Mikroorganismen angeimpft und 16 Stunden unter Schütteln bei 30⁰C gehalten. Die in der Kulturbrühe gebildeten Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen und gefriergetrocknet.

Die gefriergetrockneten Zellen (3 g/dl) wurden in 1 1 einer wässrigen lösung suspendiert, die 1 g/dl DI-ATC.3H₂O, 1 g/dl

_{2 2}

und 0,14 g/dl NHgOH.HCl enthielt und einen pH-Wert von 8 hatte und das Reaktionsgemisch wurde 53 Stunden bei 30⁰C gehalten.

Danach wurde dem Reaktionsgemisch 6 η NaOH zugesetzt, um den gebildeten Niederschlag aufzulösen. Die Menge an L-Cystin in der überstehenden Flüssigkeit des Reaktionsgemisches wurde mit Hilfe der Bio-assay-Methode bestimmt.

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TABELLE 6

CD CO NJ CD

OO

Microorganismus	FERM-P 21	gebildetes L-Cystin pg/ml
Achromobacter delmarvas	ATCC 15173	237
Alcalgenes denitrificans	ATCC 8185 ■	50
Bacillus brevis	ATCC 13826	43
Brevibacterium flavum	FERM-P 2764	22
jSnterobacter aeroaenes	IAM 1183'	184
Enterobacter aeroqenes	FERM-P 2766	173
Ervinia carotovora	FERM-P 2763	24
Escherichia coli	ATCC 11880	10
Micrococcus sodonensis	ATCC 4279	206
Mycoplana dimorpha	FERM-P 2765	146
Serratia marcescens ,	ATCC 8366	28
Flavobacterium acidoficum	FERM-P 2762	10
Pseudomonas ovalis	ATCC 272	68
Sarcina lutea	5100

ω ι

ro

CD

2549974 -zs-

Die Isolierung der L-Cystin-Kristalle aus der Kulturbrühe von Sarcina lutea ATCC 272 wurde in folgender Weise durchgeführt : die überstehende Flüssigkeit des Reaktionsgemisches wurde durch Zentrifugieren gewonnen und dazu wurden 5 g Aktivkohle zugegeben und das Gemisch wurde erhitzt. Nach der Filtration wurden 990 ml des Filtrats über Nacht belüftet und auf ein geringes Volumen konzentriert. Die gebildeten Kristalle wurden filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Die endgültig erzielte, molare Ausbeute betrug 63 £ (3,8 g).

Beispiel 11

Jeder der in Tabelle 7 aufgeführten Mikroorganismen wurde 24 Stunden bei 30⁰C auf einem Agarmedium gezüchtet, das aus 1 g/dl Glycerin, 0,5 g/dl Hefeextrakt, 0,5 g/dl Pepton, o,5 g/dl Fleischextrakt, 0,5 g/dl NaCl und 0,2 g/dl DI-ATC.3H₂O (pH 7,0) und 2 g/ dl Agar bestand. Etwa 250 mg der feuchten Zellen wurden in 5 ml eines Reaktionsgemisches suspendiert, welches 1 g/dl DI-ATC.3HpO, 1 g/dl KH₂PO₄, 0,14 g/dl NH₂OH.HCl (pH 8,0) enthielt, und 24 Stunden bei 30⁰C gehalten. In dem Reaktionsgemisch wurden die in Tabelle 7 gezeigten Mengen an I-Cystin gebildet.

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TABELLE 7

	ovalis	AJ	2236	gebildetes L-Cystin mg/ml
Ps.	Il	AJ	3863	0.068
■	Il	AJ	3864	3.945
Il	π	AJ	• 3865	2.345
π	Il	AJ	3866	6.145
η	Il	AJ	3867	4.050
η	desmolytica	AJ	3868	5 .690
PS.	Il	AJ	3869	3.631
H	Il	AJ	3870	6.050
η	H	AJ	3871	5.445
η	I Il	AJ	3872	6.240
η	Il	AJ	3873	0.720
Il	cohaerens	AJ	3874	0.930
PS.	thxazolinophilum	AJ	3854	4.737
Ps.			6.050

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Beispiel 12

Ps. thiazolinophilum AJ 3854 wurde unter aeroben Bedingungen "bei 30 C während 14 Stunden in einem Medium gezüchtet, welches 2 g/dl Glucose, 0,5 g/dl Hefeextrakt, 0,5 g/dl Pepton, 0,25 g/dl NaCl, 0,1 g/dl KH₂PO₄, 0,05 g/dl MgSO₄.7H₂O und 0,2 g g/dl DL-ATC.3H₂O enthielt und einen pH-Wert von 7 hatte. Die aus 100 ml der Kultur-"brtihe gewonnenen Zellen wurden in dem in Beispiel 11 beschriebenen Reaktionsgemisch suspendiert und das Gemisch wurde 20 Stunden bei 30⁰C gehalten. Die Meng
0,595 g (molare Ausbeute 98

bei 3O⁰C gehalten. Die Menge des gebildeten I—Cystins betrug

Der überstehenden Flüssigkeit des Reaktionsgemisches wurde 0,1 g Aktivkohle zugesetzt, das Gemisch wurde erhitzt, filtriert und der pH-Wert wurde auf 7 eingestellt. Nach dem Belüften über Nacht war 0,488 g L-Cystin erhalten worden (endgültige Ausbeute 80 5ε).

Beispiel 13

3 g Zellen von Ps. thiazolinophilum AJ 3854,die in Beispiel 12 erhalten wurden, wurden in 50 ml einer 0,1 m K-Phosphat-Pufferlösung suspendiert und während 5 Minuten mit Ultraschall von 20 KHz behandelt. Zu der überstehenden Lösung des ultraschallbehandelten Gemisches wurden 0,5 g DL-ATC.3H₂O und 0,07 g MgOH.HCl zugesetzt und der pH-Wert wurde auf 8 eingestellt. Nach 24-stündiger Reaktion bei 30⁰C waren 6,1 mg/ml L-Cystin gebildet worden.

Beispiel 14

Zellen von Ps. thiazolinophilum AJ 3854 wurden gewonnen und die Enzymreaktion wurde mit Hilfe der in Beispiel 12 beschriebenen Verfahrensweise durchgeführt, mit der Abänderung, daß 0,02 # Natriumdodecylsulfat zugesetzt wurde. Nach 5 Stunden war das gesamte DL-ATC verschwunden und es hatten sich 6,05 mg/ml L-Cystin gebildet (molare Ausbeute 99 $).

60982 0/1189

Beispiel 15

In 100 ml Kulturbrühe von Ps. ovalis AJ 3865, die mit Hilfe der gleichen Verfahrensweise wie in Beispiel 12 erhalten wurde, wurden 50 mg Cetyltrimethylammoniumchlorid, 1 g DL-ATC.3H₂O und 0,14 g NH₂OH.HCl gegeben.

Nach 7-stündigem Bebrüten bei 3O⁰C hatte sich 0,59 g L-Cystin gebildet (molare Ausbeute 97 %).

Beispiel 16

Die feuchten Zellen von Ps. desmolytica AJ 3871, die mit Hilfe der in Beispiel 12 beschriebenen Verfahrensweise erhalten wurden, bildeten 1890 pg/ml/h L-Cystin. Die angewendete Zellkonzentrrtion betrug 5 %. Andererseits bildeten die entsprechenden lyophilisierten Zellen L-Cystin in einer Menge von 2750 ug/ml/h.

Beispiel 17

Zellen von Ps. thiazolinophilum AJ 3854, die in analoger Weise wie in Beispiel 12 erhalten wurden (Naßgewicht 1 g) wurden in 4 ml Wasser suspendiert und abgekühlt. Zu der Suspension wurden 45 mg Methylen-bis-acrylamid gegeben, das mit gasförmigem N~ eingeführt wurde, und außerdem wurden 3,5 mg Ammoniumpersulfat und 8 iil N,N'-Dimethylaminopropionitril zugesetzt. Nach 1-stündigem Kühlen wurde das gebildete Gel mit Maschendraht-Gaze (50-Maschen) filtriert und mit 0,8 $iger NaCl-Lösung gewaschen. 1 g des Gels wurde in 2 ml des in Beispiel 12 gezeigten Reaktionsgemisches suspendiert. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei 3O⁰C gehalten und mit Hilfe der Bio-assay-Methode wurden in dem Reaktionsgemisch 5,40 mg/ml L-Cystin aufgefunden.

Beispiel 18

Ps. thiazolinophilum AJ 3854 wurde bei 30⁰C während 24 Stunden in dem gleichen Medium wie in Beispiel 4 gezüchtet und die Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen.
Dem in Beispiel 4 gezeigten Reaktionsgemisch wurden außerdem die in Tabelle 8 aufgeführten Verbindungen in den dort angegebenen

60 9 820/1189

2549974

Mengen zugesetzt.

Die Reaktion wurde 7 Stunden bei 30⁰C durchgeführt und danach enthielt das Reaktionsgemisch die in Tabelle 8 gezeigten Mengen an L-Cystin.

Tabelle 8

Zugesetzte Verbindung	Gebildetes !-Cystin (g/dl)
mM 0	0,14
1	0,34
5	0,55
10	0,57
NH₉OH.HCl ^ά 20	0,61
30	0,60
50	0,57
100	0,46
0	0,17
0,1	0,15
NHoNHCONH₀ ^{ά ά} 1	0,19
10	0,40
100	0,33

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Claims

Patentansprüche

"λ ( 1. Verfahren zur enzymatischen Herstellung von L-Cystein und/ oder L-Cystin, dadurch gekennzeichnet , daß man

a) 2~Aminoⁱ-thiazolin-4-carbonsäure in einer wässrigen Lösung bei einem pH-Wert von 5 bis 11 mit einer wirksamen Menge eines durch einen Mikroorganismus gebildeten Enzyms hält, das zur Umwandlung von 2-Amino-thiazolin-4-carbonsäure in L-Cystein und/oder L-Cystin befähigt ist und welches durch einen Mikroorganismus gebildet wurde, der zumYfetchstum in einem Medium befähigt ist, welches 2-Amino-thiazolin-4-carbonsäure als Stickstoffquelle enthält, und

b) das gebildete L-Cystein und/oder L-Cystin aus der wässrigen Lösung gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Enzym verwendet, das durch einen Mikroorganismus des Genus Sarcina, Achromobacter, Alcaligenes, Bacillus, Brevibacterium, Enterobacter, Ervinia, Escherichia, Micrococcus, Mycoplana, Serratia, Flavobacterium oder Pseudomonas gebildet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Enzym verwendet, das durch einen Mikroorganismus der Spezies

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³⁵ 254992A

Sarcina lutea Achromobacter delmarvae Alcaligenes denitrificans Bacillus brevis Brevibacterium flavura Enterobacter aerogenes Ervinia carotovora Escherichia coli Micrococcus sodonensis Mycoplana dimorpha Serratia marcescens Pseudomonas thiazolinophilum Pseudomonas ovalis Pseudomonas desmolytica oder Pseudomonas cohaerens gebildet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß man ein Enzym verwendet, welches durch einen der folgenden Mikroorganismen gebildet worden ist:
Sarcina lutea ATCC 272

Achromobacter delmarvae FERM-P Alcaligenes denitrificans ATCC 15173 Bacillus brevis ATCC 8185

Brevibacterium flavum ÄTCC 13826 Enterobacter aerogenes FERM-P 2764 Ervinia carotovora FERM-P 2766

Escherichia coli FERM-P 2763

Micrococcus sodonensis ATCC 11880

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Mycoplana dimorpha ATCC 4279

Serratia marcescens PERM-P 2765

Pseudomonas thiazolinophilum FERM-P 281-0

Pseudoraonas ovalis FERM-P 2762, FERM-P 2811 ,

EERM-P 2812, FERM-P 2813, FERM-P 2814 oder FERM-P 2815

Pseudomonas desmolytica FERM-P 2816, FERM-P 2817,

FERM-P 2818, FERM-P 2819 _oder FERM-P 2820, FERM-P 2821

Pseudomonas cohaerens FERM-P 2831.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Enzym verwendet, das von einem Mikroorganismus gebildet wird, der zum Wachstum in einem Medium befähigt ist, welches, pro Deziliter, Of.3 g 2-Amino-thiazolin-4-carbonsäure-trihydrat, 1 g Glycerin, 0,01 g Hefeextrakt, 0,1 g KH₂PO^, 0,05 g MgSO^.7H₂O und 2 g Agar enthält.
6. Verfahren nach Einern'der Ansprüche 1 bis 5, dadurch g e kenn ze lehnet , daß man ein Enzym verwendet, welches durch Züchten des Mikroorganismus in einem 2-Aminothiazolin-4—carbonsäure enthaltenden Medium gebildet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch g ekennzeichnet , daß man ein Enzym verwendet, das durch Züchtung des Mikroorganismus in einem Medium gebildet wird, das Manganionen in einer Menge von mehr als 0,1 mM entält. 609820/118 9
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Enzym verwendet, das durch Züchtung des Mikroorganismus in einem Medium gebildet wird, das Ferroionen in einer Menge von mehr als 0,1 mM enthält.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß man das Enzym in Form einer Enzymquelie einsetzt, die aus intakten Zellen des Mikroorganismus, einem Homogenisat der Zellen, gefriergetrockneten Zellen oder mit Utraschall behandelten Zellen besteht.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet , daß man als Enzymquelle Zellen des Mikroorganismus verwendet, die mit einem organischen Lösungsmittel behandelt worden sind.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennze ichn e t , daß man als organisches Lösungsmittel ein niederes Alkanol, einen aromatischen Kohlenwasserstoff, ein Alkylketon oder ein chloriertes Alkan verwendet.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet , daß man als Enzymquelle Zellen des Mikroorganismus verwendet, die vorher mit einem oberflächenaktiven Mittel behandelt v/orden sind.

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13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man ein kationisches oder anionisches oberflächenaktives Mittel verwendet.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9» dadurch gekennzeichnet , daß man als Enzymquelle Zellen des Mikroorganismus verwendet, nachdem diese mit einem aus Mikrobenzellen stammenden lysierenden Enzym behandelt worden sind.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet , daß man eine wässrige Lösung verwendet, die Hydroxylamin oder Semicarbazid enthält.
16. Verfahren nach" einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet , daß man eine wässrige Lösung verwendet, die Ferriionen in einer Menge von mehr als 0,036 mM enthält.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet , daß man eine wässrige Lösung verwendet, die Ferrionen in einer Menge von mehr als 0,036 mM enthält.

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