DE1960524A1 - Fermentatives Verfahren zur Herstellung von L-Dihydroxyphenylalanin - Google Patents

Description

PATENTANWKLTE

DR.E.WIEGAND DIPL-ING. W. NIEMANN 1960524

DR. M. KÖHLER DlPL-ING. C. GERNHARDT

MÜNCHEN HAMBURG

2. Dez, I960

TELEFON: 555476 8000 Mü N CH EN 15,

TELEGRAMME: KARPATENT NUSSBAUMSTRASSE 10

W. 14 577/69 - Ko/B

Co., ItiG# iokyo, Japan

iermentatives Verfahren zur Herstellung von i-Dihydroxyphenylalanin

Erfindungsgemäß wird 3»4-2)ihydroxyphenyl-Ir-alanin durch enzyraatisohe Umsetzung unter Anwendung der durch Kultivierung bestimmter Mikroorganismen gebildeten Q-fyrosinase aus Catechinen, beispielsweise Brenzcatechin, und einer oder mehreren Aminosäuren aus der Gruppe von Cystein, Cystin, Serin, Alanin und Salzen oder Derivaten hiervon erhalten·

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 3,4-Dihydroxyphenyl-L-alanin, das anschließend als DOPA abgekürzt wird, durch enzymatisch« Umsetzung.

Eine Aufgabe der Erfindung besteht in der Herstellung von DOPA durch ein biochemisches Verfahren mit niedrigen Kosten au» leicht zugänglichen Rohmaterialien und eine weitere Aufgabe besteht in der Herstellung von SOFA in einfacherer und leichterer Arbeitsweise, als dies bisher möglich war·

DOPA stellt «in sehr wichtiges Material der medieinisohtn Behandlung dt« Syndrom· nach Parkinson dar und sein Heilwtrt bti Krankheiten erlangt· «ine stark« öffentlich« Aufmerksamkeit.

Bekanntlich ist DOPA in d«r Rind« oder in d«n Knospen von Vioia fava L enthalten und kann hieraus duroh Extraktion

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erhalten werden. L-s kaiin auch naoh einem syn the tischen Verfahren aus L-Tyrosin erhalten werden» Aivlererseits wurde in jUngater Zeit berichtet, daß DOPA aus Catechin und I»-<£yro8in duroh enzymatiaohe Einwirkung der fl-iPyrosinase erhalten wird, welch© in einera Medium duroh "Kultivierung eine» zum genuo Escherichia gehorsndim Mikroorganienus erhalten wurde»

Jedoch hat daa Verfahren zur Herstellung von DOPA aus Oateohln und L-Tyrosin den großen Mangel "bei der praktischen Anwendung, daß Phenol, welches den Portachritt der umsetzung hemmt, ebenfalls zusammen mit DCtVi in der Heaktionslöaung gebildet wird und daß das gebildete I)OPA und daa in der Reaktionalösung verbliebene L-'üyroain nur sehr schwer voneinander zu trennen sind.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird DOPA durch enzymatisch^ Umsetzung aua Catechin und einer oder mehreren Aminosäuren aus der Gruppe von Cystein, Cystin, Serin und Alanin gebildet· Beim erfindungsgeiaääen Verfahren kann DOPA beispielsweise durch die folgenden Umsetzungen, die durch das Enzym katalysiert werden, gebildet werden:

HO

HO_/ 'N +HS - CHo - CH - COOH

HO

i, HQ „/ ^'■_. CH« - CH - COOK +

\— IH₂

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BAOORIGINAt

HO HO _/' ^v \ + H₂C-S- CH₂ - CH - COOH

	HO	NH2
HO		ι \_ CH9

-CH- COOH + CH₉ - SH HH₂

HO 3)

HO-"" " '■■ + HO - CH., - CK - CJOH

. FO

HO-/'' ·— CIl₀ -CH- COOH + H.,0

HO

4) /—χ

HO ./-' ^ + HCH« - CH - COOH

HO

HO- ^V CH₂-CH- CO(A ♦ H₂

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oni®_NAL

Laß genieß der Erfindung eingesetzte linzyni besteht aus der ß-Tyroeinase und diese kann als kristalline ß-Tyroeinase verwendet werden o.ier in Form von Substanzen, die k-Tyrosinase enthalten.

Lieeea Enzym ß-Tyrosinase, ist als lünzym (Tyrosinphenol-lyaee) bekannt, welches die Zersetzung von L-I'yrosin in Phenol, Brenztraubensäure und KH^ katalysiert. ;„3 wurde gefunden, daß ß-Tyrosinase ebenfalls eine Reaktion zur .Bildung von DOPA, aus Oatechin und L-Iyrosin katalysiert·

Infolge ..eiterer Untersuchungen wurde nun gefunden, daß eilig bemerkenswerte Men^e an DOJ/;. gebildet wird, we.nn i.;-ii;,yr«":f?inaee oder »Substanzen, die k—Tyrosinase enthalten, zu einer Lösung zuije reben werden, die Gatechin und eine oder Biahrere der vorstehend aufgeführten Aminosäuren enthilt, und daß die ft-üyrosinase in einer Kulturflüssi.^Jceit und in c^sen mikrobiellen Zellen gebildet wird, wenn bestimmte f ikroorganißraen in einem Nährmedium, das Tyrosin enthalt, kultiviert werden·

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein geeignetes ünzymausgangeniaterial, nümlich ß-Tyrosinase oder üubstanzen, die ß-Tyrosinase enthalten, mit einer wäßrigen !lösung, die Ca techin und eine oder mehrere Amino säuren aus der Gruppe von Cystein, Cystin, Serin, Alanin und Salze oder Derivate hiervon enthält, vermischt und das Gemisch bei einem pH-Wert von etwa 4 bis 11 stehengelassen, bis das DOPA darin entwickelt ist.

Die ß-Tyrosinase enthaltenden Substanzen werden üblicherweise als Kulturbrühe, worin bestimmte Mikroorganismen kultiviert wurden, oder als zellfreie Filtrate hiervon, als wäßrige Suspensionen von mikrobiellen Zellen, als gemahlene Zellsuspensionen oder ale Filtrate hiervon erhalten«

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IAD ORIGINAL

Die I-Iikroorgandsmen mit der Eigenschaft zur Bildung dec Enzyme* wie sie i"¹ Raiuien der Erfindung angewandt werden, sind Im. Bereich der Mikroben sehr weit verbreitet. LuQbesondere handelt es sich um solche Mikroorganismen, die zu den genera, ,iacherichia, ^erobactor, Erwinia, iseudomonas, Bacillus, ,ächromobaoter, Xanthomonas und Protöua gehören. Insbesondere sind typische Speeien der iiikroorganlöinen mit der iuhi&keit zur Bildung des Ünssyms» welches DOI-¹A bildet, isoherichia intermedia , Aerobacter tierOiienes, Erwinia herbicola, Achromobacter candicana, Alcaligenes faecalis, i^eudoraonas ovalis, Bacillua mega~ theriura, Xanthomonas caiapestris und Proteus mirabilis»

Die zur Kultivierung der Mikroorganismen zwecke Erhalt des Ensyraausgangsmaterials angewandten Medien können übliche Medien sein, die Ausgangsiaaterialien für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff und die Üblichen geringeren Nährstoffe enthalten und die ausaerclen eine geeignete i'en^e an. Xyrosin enthalte2i. Sie wuchsen zufrie<i|enntellencl auf Medien, die Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Saccharose, il&nnoee, rial to se, Mannit, Xylose, Galactose, Stärkehydrolysate und Melassen enthielten. Organische Säuren» wie Essigsäure, Citronensäure, Milch-.?^;iure, yuraarsäure, Apfelsäure, a-Ketoglutaroaure, ßlucon- und Brenetraubeneäure, Alkohole, wie Methanol,

Propanol und üutanol, Fettsäuren und Kohlenwasserstoffe sind ebenfalls als Hauptkohlenetoffquellen oder ergiinaencie Kohlenstoff quellen entsprechend der Vvahl des eingesetzten MikroorfcanisneB verwendbar. Die Konzentration de· Kohlenetoffeueganasmateriale im Medium liegt normalerweise ewleehen 0,1 und 10 Gew.-?*, angegeben als Glucoee-HquiYalente. Stickstoff kann durch Ammoniumsalze von anorgftnieohen oder organischen Säuren, beispielsweise

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"" b —

säure₍ achwefeisaure, Phosphorsäure, Jalpetarsaure, £aeigsdure und Kohlensäure, durch Harnstoff und durch Ammoniak in wäßriger Lösung oder iai Gaszustand geliefert werden. Andere organische stickstoffhaltige Substanzen, wie !kiiutluellflUeaigiieit, Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt und HZ-Amin werden als zusätzliche Stickstoffauellen·verwendet·

Das Medium sollte auch anorganische und organische Substanzen enthalten, die das Wachstum der Aliitroorganisman fördern· Zu den anorganischen Substanzen gehören die essentiellen anorganischen Ionen, die aus Mkaliuühydrogen-

P phosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Hatriumchlorid, Bisen(II)-eulfat_v fSanganeulfat, ^inksulfat, Kupfereulfat und Calciumcarbonat erhältlich sind· Zu den bekannten organischen wachetumsfordernden Substanzen gehören allgemein Aminosäuren, Biotin, Vitamine, organische Säuren, fettsäuren und proteinhaltige Substanzen· Sie können zu dem Medium in form von Substanzen zugesetzt werden, die das aktive Mittel unter den Bedingungen der Kultivierung bilden, beispielsweise als Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit, Magermilch, Chlorellaextrakt, Sojaproteinhydrolysat und verschiedene andere . Extrakte von pflanzlichen und tierischen Geweben, wie sie

* an sich bekannt eind.

Die Zugabe von Tyrosin zum Kulturmedium ist wichtig, um eine gute Ausbeute des Enzyme zu erhalten, insbesondere sollte es zu dem Medium in einer Menge von mehr ale 0,01^ und bevorzugt in einer Menge von 0,05 bis 0,5 ;'£, bezogen auf das Gewicht des Mediums, zugesetzt werden·

Aminosäuren, wie Methionin, Glycin, Alanin, Vitamine, wie Pyridoxin, Pyridoxal und Pyridoxalphoephat können ebenfalls tu den Medium zur Verbesserung der Enzymaktivität

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werden. Die Konzentration der zugesetzten Aminosäuren lie^t ;iornialerweiee zwischen 0,01 und 5 Gew.-^_t als fro i e A j-? ino π Xu reu ·

Pie Fernentierung wird unter aeroben Bedingungen, le±- apielßweise uls aerobe Schütteln der Kultur oder durch HUhren einer uuhnerskultur unter Einführung von Luft, bei einer Teuperatur von 25 bis 4QH: durchgeführt· Bevorzugt «ird d«sr pH-Wert des Kulturmediums auf einem Bereich von !;:,3 bie b_t5 mit üblichen Neutralieiermitteln wahrend der iinltivierung eirigeregelt, eo daß eine gute Herstellung des ijnzyae c-r-halten wird· Die Kultivierung wird ira allgemeinen wahre?"ia 10 bis 72 Stunden durcii/jeführt.

Die auf dieoe >veiae hergestellte KuIturflüseigkeit kann als £nKy:;auatfungSiaaterial, so wie sie ist, ohne Entfprmmg der H.jkterienzellen verwenr3et werden. Eellfreie Filtrate der !ulturbrühe, lebende aus äer Kulturbrühe erhaltene Sakterienzellen und Suspensionen von zerbrochenem BakterienBellenraaterial« die durch Verreiben, autolyse, Ultraschallbehandlung und dergl· hergestellt wurden, können obenfalls αϊ ο LnzymauscangsHsaterial im Rahmen der Erfindung verwendet werden. Ls ist auch möglich, ein rohee Enzym anzuwenden, v/elches beispielsweise durch Behandlungen, wie Zentrifugieren, Aussalzen und LösunöSsittelausfällung hergestellt wurde«

Andererseits ißt es auch möglich, DOPA durch Zusatz von (Jatechin und einer oder mehrerer der Aminosäuren aus der Ctruppe von Cystein, Cystin, Serin, Alanin und Salzen oder Derivaten hiervon zu dem Medium während der Kultivierung herzustellen·

Bas Catechin kann als Substrat gemäß der Erfindung nicht nur als reine Verbindung verwendet werden, sondern auch alβ rohe, die bestimmte Verunreinigungen enthält.

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Die als Subetrat angewandten Aminosäuren» wie Cystein, Cystin, Serin und Alanin können in Fonr der freien SMure oder als Ammonlun-, Natrium-, Kalium- oder Calciumsalae oder als Hydrochloride zugegeben werden. Sie können auch in Fora von Betern, beispielsweise dee üthylesters oder Hethylestere, oder in Form anderer Derivate zugeführt werden.

Zv. geeigneter! Ausgangsmaterialien für die Aminosäuren gehören nicht mir die reinen Verbindungen, sondern auch T-.ohsubE tanken, die eine oder mehrere dieser Aral no ε Huren enthalten und sie können in der L-Sorm, Γ-1'oris, BL-Ponn und als Gemische der I*- und L-Formen verwendet werden» V/eiterhin gehören zu geeigneten Ausfisinnsmaterialien für !-•!Serin ο tier L-Alanin rohe Kulturbrühen, die L-Serin oder L-Alanin enthalten, die duroh Ferraentierur.g erhalten wur-G en· l^;ie Konsentration der zu dem Reaktionäre misch als LJubetrat zuzusetzenden Aminosäuren ist üblicherweise nicht begrenat, beträgt jedoch vorssugaweioe 0,1 bis 10^· als freie Aminosäuren.

Die enzymatlsche Umsetzung wird vorsugeweise unter den Bedingungen eines pH-Wertes von 4 bis 11 und einer Temperatur von 1ü biü 50^¹ auagerührt. l>er pH-Wert der das Enzym enthaltenden Iteaktionslößung hat einen wichtigen Einfluß auf die zur Her»teilung von DOPA erforderliche Gesamtzeit und auf die echließliph erhaltene Ausbeute an DOPA, Der pH-l.'ert sollte wahrend der Umsetzung durch Zugabe von Calciumcarbonat, Ammoniak, Ätzalkalien oder l'hosphsitpuffern beibehalten werden.

Die Gewinnung des DOPA aus dem Keaktionageniieoh wird durch das in Journal of Biological Chemistry, Band 239t Seite 2910 (1964) beochriebene Verfahren leicht erreicht·

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Das. erfinctiuigo^einäß erhä. Ae Produkt läßt sich als DOPA durch den bei der PapierchromatographiQ erhaltenen Rf-v/ert und durch den auftretenden purpurroten Flecken Identifizieren, der auftritt, wenn eine 1$ige lösung von Xaliumferrieyanid auf das PapierchromatOisramm gesprüht wird. Die Bestimmung des in der Reaktionslösung ange-S3a?:imel ten DOPA erfolg fe nach dem Verfahren von Arnow und Mitarbeiter (Journal of Biological Chemistry, Band 118» üeite 531-537, 1937).

Beispiel 1

oo wurde ein wäßriges Kulturmedium hergestellt, welches 1';? Fleischextrakt, 1$ Polypepton, 0,5 $ natriumchlorid, Q,2# L-Tyrosin enthielt und auf pH 7_fO eingestellt war. Anteile von 40 ml der Lösung wurden in Schüttelkolben von 500 al gegeben.

Die wHßrigen Medieii wurden mit den Kulturen inokuliert, die durch Kultivierung von Escherichia intermedia ATuC 6750 auf Bouillon-Aijarsohli fczeh bei 26⁰C während 24 Stunden hergestellt worden waren, und die Kultivierung wurde in den wUwrif'en Jtedien, daren pH-Wert zn Beginn 7,0 betrug, bei 31^ir. wahrend 18 stunden unter Schütteln durchgeführt.

i>ie mikrobiellen Zellen in 1 Liter der Kulturbrühe wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, gewaschen und in 100 ml eines Verdunnungepuffers suspendiert, welcher 0,05 m-Kaliumphosphat (pH 6) enthielt. Die Zellauepeneion wurde einer Ultraechallbehandlung unterworfen (20 Itc während 30 Minuten) und zentrifugiert.

BIe überstehende Lösung wurde mit Ammoniurasulfat fraktioniert und ansehliessend eine Dialyse gegen den Verdünnun^Bpuffer durohgeführt. Hn Zehntel des Volumtns an

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einer öligen ProtamiriBulf&fclOBUixg mit einem ph-wert von 7» O wurde zu dem Uialysat züge se tat vaiiL der ge bilde te !niederschlag abaentriiugiert. Me überstehende Lösung wur«=· de auf eine D^Aii-Sephadex-Kolonne ( ό χ 53 om), die üit dem Verdunnungöpuffer äquilibriert war, aufgetragen» Nachdem die Kolonne mit einem 0,1 m-Kaliuiaphospliatpuffer, pH 7,0» der 0,005 s-Mereaptoäthanol enthielt, ^sv/aschen worden war» wurde das Enzym mil; einem 0,1 m-kal IuBi^IiQaDi Ii&tpul'fer, pH 7,0, der 0,005 ßi-Hercaptoüthanol uiui 0,1 fii-~.Ui enthielt, eluiert. liie aktiven iraktionen wurden ver-~ einigt und durch iiusats von Aiamtmiumöulfat {aaVcigung 70>') konzentriert· Der Miederschlag wurde gesaniffielt und gegen den Verdüiinungspufi'er dialysiert,

xfae Dialysat wuvüe auf eii\e iiydroxylapati fckolonne (5 x 10 cm), die mit dem Verdünnurigapuffex· äquilibriert war,, aux'getragen· Nachdem die Kuloime mit einem 0,02 ai-KaliunphosphatiJUi'fer, pH 6,0,mit ßinem Gehalt von 0,005 ra-Mercaptoäthanol gewaschen worden war, wurde das Enzym mit 0,1 ra-Kaliumphosphatpuffer, pH S₉O₁ mit einem Gehalt von 0,005 ia-hercaptoäthanoi eluiort, Die aktiven i'r&ictionen. wurden vereinigt und aiifc Anaoiiituisulfat (3ätti_oung 70,*) konzentriert, ter Niederschlag wurde geaauuelt und in der kleinstmoglichen Menge des Verduiinun^spuii'üra gelöst» xiie iiiuaymlösung wurde durch eine üepliadex-ö-150-Kolonne ( 2 χ 100 cm), die mit dem Verdünnun^spuffer äquilibrierfe war, gegeben. Die aktiven ire«..£bionen, die das hnaym mit einer spezifischen Aktivität größer ala 1,0 enthielten, wurden vereinigt und mit Ammoniunaulfat (tfUtti^img 70;%) konzeatriert. Iier fiiederechla^ wurde in einer minimalen Menge des Verdümiuiigapuffera ^elciat. Fein gepulvertes AiHBioniunieulfat Viurde voz'aiciitig zu der EnzymLöBung zugegeben, bis diese geringfügig trüb wurde und das Gemisch in

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ein ^isbad gestellt. Die Kristallisation begann etwa nach 6 Stunden und war innerhalb 1 V/oche praktisch vollständig·

Dadurch wurden 80 mg des kristallinen Enzyme erhalten·

3jaa auf die vorstehende Weise hergestellte Enzym wurde zu 200 ml eines 0,05 m-Kaliumphoaphatpuffere (pH 8,5) gegeben, der 2,5 g Cateohin und 1 g L-Serin enthielt, und die Umsetzung bei 31^ir' wahrend 3 Stunden ausgeführt. 870 cig Ii)¹JVk fanden sich in der Reaktionslösung·

5u der Reaktionslösung wurde irichloreesigsäure zur Lntl'ernung des Proteins zugesetzt und der pH-«fert der LöfsuiJi.; auf 0,5 mit wlüärigeia Ammoniak eingestellt. Pie das DOM enthaltende Lösung wurde auf eine Aluminiumoxydkolonne ( 4 χ 20 cm) aufgetragen. Diese Kolonne wurde zunächst mit uestilliertem v<asser und dann mit 0,3 n-Essigsäure eluiert« Die das DOPA enthaltende Fraktion, die aus dem Bluat getrennt wurde, wurde mit Äthylacetat behandelt. Der erhaltene birup wurde auf eine Kieselsäurekoloime aufgetragen und die Kolonne eluiert· Bas Eluat wurde eingedampft und dabei 560 ag kristallines DOIi₁. erhalten.

.venn an stelle von 1 g L-Serin beim vorstehenden Versuch 1 Q L-Oystein eingesetzt wurde, wurden 1250 mg J)OiA in der Reaktionelösung gefunden und 830 mg kristallines DOirA erhalten.

Beispiel 2

Aerobacter aerogenee AlCO 7256 wurde in der gleichen weise, wie in Beispiel 1, kultiviert. Die mikrobiellen Zellen in 1 Liter der KuItürflüssigkeit wurden abgenommen und in 100 ml eines Verdünnungspuffere suspendiert, der

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0,05 m-Kaliumphosphat (pH 6) enthielt, suspendiert. Die Zeilsuspension wurde einer Ultraschallbehandlung (20 Kc während 30 Minuten) unterworfen und zentrifugiert.

Die überstehende Lösung wurde als Enzymausgangsmaterial verwendet. Die Enzymlösung, die 80 mg Protein enthielt, wurde zu 200 ml eines 0,05 m-Kaliumphosphatpuffers (pH 8,5), der 4 g Qatechin, 2 g L-Cy stein und 4 mg Pyridoxal phosphat enthielt, zugesetzt und bei 31⁰O während 3 Stunden umgesetzt. 1,2 g DOPA wurden in der Reaktionslösung erhalten. 0,9 g kristallines DOPA wurden aus der Lösung in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1, erhalten.

Wenn 2 g S-MethyIcystein anstelle des L-Cystein im vorstehenden Ansatz eingesetzt wurden, wurden 0,8 g DOPA in der Eeaktionslösung festgestellt und 0,4 g kristallines DOPA erhalten.

Beispiel 3

Ein wäßriges Kulturmedium mit nachfolgender Zusammensetzung wurde hergestellt und auf pH 6,5 eingeregelt:

Zusammensetzung des Mediums«
L-Iyrosin 0,2 g/dl

K2HPO4	0,1	g/dl
MgSO4	0,05	g/dl
Citronensäure	0,2	g/dl
Glycerin	0,2	g/dl
Hefeextrakt	1,0	g/dl
Pyridoxin	10,0	mg/dl
Glycin	0,1	g/dl
Alanin	o,>	g/dl
Methionin	0,15	g/dl

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Anteile von 60 ml der U ,_ö* wurden in Schüttelkolben von 500 ml gegeben·

Die wäßrigen Medien wurden mit Kulturen inokuliert» die durch Kultivierung von Erwinia herbicola ATCU 21434 (dieser Stamm wurde als ISrwinia herbicola durch Dr. K, Komagata, Universität von Tokyo, aus Srwinia carotovora CGM 1005 reidentifiziert) auf Bouillon-Agarachnitten bei 28^U7 während 20 Stunden hergestellt worden war, und die Kultivierung in den wäßrigen Medien bei 31 ¹V während 20 Stunden unter Schütteln durchgeführt.

Die mikrowellen Zellen in 1 Liter der KuIturflüsaigkeit wurden durch Zentrifugieren abgetrennt und mit destilliertem Wasser gewaschen* Die auf diese Weise hergeatellten mikrobiellen Zellen wurden in der Reaktionslösung, deren Menge die Hälfte von derjenigen der KulturflUs3igkeit betrug, mit der nachfolgend aufgeführten Zusammensetzung suspendiert:

Zusammensetzung der Beaktionslösung (pH 8,8):

Ui-Serin 1,5 g/dl

Catechin 0,75 g/dl

0,2 g/dl

_A23 0,2 g/dl

El)U 0,1 g/dl

Die UmsetBung wurde bei 30⁰C während 20 Stunden durchgeführt· 0,92 g/dl DOPA fanden sich in der Reaktionslösung·

2 1 der Heaktionslöaung wurden auf pH 3,5 mit üalaaäurtf eingestellt und sur Entfernung der mikrobiellen Zellen zentrifugiert· Sie überstehend· Flüssigkeit wurde auf 250 al eingeengt und deren pH-Wert auf etwa 1,0 eingeregelt und die erhaltene Lösung auf eine Kolonne mit

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Aktivkohle (130 g getrockneter Aktivkohle) aufgetragene Haehdem die Kolonne mit 0*1 n-Salaeäure zur Entfernung des verbliebenen L-äerins gewaschen worden war, wurde das DOPA mit verdünntem wäßrigen Ammoniak eluiert, Aus dem lluat wurde rohes kristallinea BOfA durch Mnengen erhalten und die Urakrietallisation wurde drei mal wieder» holt» Die Ausbeute an DOPA betrug 13,6 g» t>s wurde bestätigt» daß das erhaltene DOPA vollständig in der L-Form vorlag, indem eine Untersuchung mit einem Polarimeter durchgeführt wurde·

Beispiel 4

Erwinia herbieola A2CC 21434 wurde in der gleichen Weise, wie in Beispiel 3, kultiviert. Bie laikrobiellen Zellen in 1 Liter der Kulturflüssigkeii wurden abzentrifugiert und mit destilliertem Wasser gewaschen» Me auf diese V/eise hergestellten mikrobiellen gellen, deren Trokk^nmaterial 50 rag betrug, wurden in 100 isl der Reaktionslösung mit der gleichen Zusammensetzung,wie in Beispiel 3, suspendiert, jedoch mit der Ausnahme, daS eine der in der nachfolgenden Tabelle I aufgeführte Aminosäure anstelle von Dli-Serin eingesetzt wurde; die Umsetzung wurde unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 3, duroh^eführt. Die Menge an gebildeten DOPA in der Reaktionslösung ist ebenfalls in Tabelle I aufgeführt·

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Tabelle 1

	Aminosäure als Substrat	gebildetes DOPA
ην.		(ä/100 ml)
	L~Gystein	0,52
■ι	IMJyetein	0,45
	L~i3erin	0,88
3	U-öerin	0,74
4	L-Cystin	0,32
5	!-Alanin	0,08
6	D-Alanin	0,04
7	^-.'-!ethyl-I.-cystein	0,32
8	ü-Iethyl-I'-eyetein	0,32
9	Beispiel 5

ärwinia herbicola ATOC 21434 wurde in der gleichen Weise, wie in Beispiel 3* kultiviert· Die mikrobiellen Zellen in 1 Liter der KuIturflüBsigkeit wurden abgenoranien· Die Zellen ( 23 g Trockengewicht) wurden in 100 ml eines 0,5 m-Kaliumphoapnatpuffers (pH 6,0) suspendiert und die Suspension mit Ultraschall (20 kc während 20 Hinuten) behandelt und dann sefttrlfugiert· Die überstehende Lösung wurde als Eneypeaterial verwendet·

i-'is auf diese Weise hergestellte Enzymausgangsmaterial rfurde zu 2 1 einer Ileafctionslösung zugesetzt, deren Zusammensetzung 2,0 g/dl D-Serin, 1,0 g /dl Cateohin, 0,2 g/dl Ka₂SO₅ und 0,1 g/dl BDfA betrug und ide mit wäßrigem Ammoniak auf pH O₉B eingestellt war· Nachdem die Uasetzung bei 5<y: wälirena 20 Stunden durchgeführt worden war, waren 0,84 g/dl DOPA in der Reaktionslöeung gebildet.

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10,6 g kristallines DOPA wurde in der gleichen Weise, wie in Beispiel 3# erhalten«

Beispiel 6

Jeweils 60 HiI der wäßrigen Medien A bis D₉ die die nachfolgend in Tabelle II aufgeführten Zusammensetzungen hatten₍ wurden mit Kulturen inokuliert, welche durch Kultivierung von Erwinia herbicole ATCC 21433 (dieser Stamm wurde als Erwinia herbicola durch Dr. K. komagata, ■ Universität von !Tokyo, aue Erwinia earotovora CCM 986 re~ identlfiaiert) auf Bouillon-Agarschnitten bei 28⁰C während 20 Stunden erhalten worden waren, und die Kultivierung bei 31¹O wahrend 20 Stunden unter Schütteln durchgeführt. Pie mikrobiellen Zellen in 10 ml der KuIturflüesigkei t wurden abzentrifugiert und die erhaltenen Zellen in 5 ml der RealctionslöBung mit einem pH-Wert von 8,8 und folgender Zusammensetzung suuj-endiert: 2,0 g/dl L-Cerin, 1,0 g/dl Oatechiii, 0,1 g/dl KDl¹A und 0,2 g/dl Na₂SO,.

Kachdem die Umsetzung bei 3O^ wahrend 20 Stunden ausgeführt wurde, wurde dae in jeder Reaktionslösung gebildet« LuPA bestimmt. IUe Lrgebniosc sincl in folgender Tabelle TI enthalten.

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Tabelle

	Ä.(g/dl) B(g/dl) C(g/dl) D(g/dl)	0 0 0	,2 ,1 ,05	0,2 0,1 0,05	0,2 0,1 0,05
	0,2 0,1 0,05	0	,01	0	0,01
Zusammen-· L-1?yrosin aetaung «j, 50 des Mediums 2 4 HgSO4	0	0	,2	0,2	0,2
Pyridoxin	0,2	0	,2	0,2	0,2
Glycerin	0,2	0		0,1	0,1
C i troneneäure	0	0	»1	0,1	0,1
SIi-Me thionin	0,1	0	,2	0,2	0,2
Glycin	0,2	1	■ 0	1,0	1,0
BL-Alanin	1,0	6	,5	6,5	6,5
.Hefe extrakt	6,5	Ü	.50	Ut42	ü$68
pH (einge- Bcellt mit KOH)	0,22
IjOia geüiluet (4/dl)	Beispiel 7

x.iii wäßriges .Kulturmedium wit folgender ^uaa setzung wurde hergestellt und der ρϊϊ-Werb auf 6,5 einge« regelet

Euaammensetssurig dee ,-.ediuiiiBi

Ilöiechaztrakt 0,3'i'

Polypepton

Hefeextrakt Matriumohlorid

L-Iyro»in

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L-öerin 0,05$

L-Cyβtein . 0
L-Alanin ü

Anteile von 40 ml der Lösung wurden in oehüttelkolben von 5ü0 ml gegeben·

Me wäürigen Medien wurden jeweils mil, Kulturen inokuliert, die durch Kultivierung von Bacherichia intermedia AiCC ö75O_f Achroiaobactei* candicana OUi¹ 8005, Profceus mirabilie AX¹OC! 15290 Xanthomonas campeetris Ai¹GC 7361 auf Bouillon-Agarachnitten bei 28^ci! während 24 stunden erhalten P worden waren, und die KuI tivi rung in den wäßrigen iladleii bei 31^ftw während 18 Stunden unter Schütteln durchgeführt.

Die mikrobiellen Zellen in jeweils 1 Jjiter der Kultur«- flüssigkeit wurden abeentriXugi&rt» Me dabei erhaltenen mikrobieileii gellen wurden in 100 ml eines Q,05 la-Kaliumphosphatpufferti (pH 6»0) auepeMiers und die Suspensionen einer ültraschallbehandluiits (20 Ko während 20 tfinuten ) unterworfen» DL·; ei?iial feanen Losun^ön, die die gebrochene üellaubefcöjaa won. jedeia Mikjcuor^i^nisiaue enthielt, wurden ala Änaymauögangeaiaterial in der nachfolgend beschriebenen weise verwendet·

Jedes ^BjgjßiauBg&iigsiB&terial (100 i%- Trockenmaterial) wurde EU jeweils 100 ml der Rsaktionslösung (pH 7,0), die ™ 2uO mg einer der in fatoelle III aufgeführten Aminosäuren, 400 mti, C a te chin uni 2§5 Mg P^idoxalphoephat enthielt, sugegeben und die Umaetsung bei 31^Cl· während 3 Stunden ausgeführt· Das in jeder Reaktioiislösung gebildete DOPA lag in folgender Menge von

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Tabelle III

Angewandte Mikroorganismen	Gebildetea	DOPA (oä/	dl)	L-Alanin
		Substrat		15
Eaehericiiia intermedia -\xOC 6750	L-Cy8tein	L-Cystin	L-Serin	12
Aolirorao bacter candicans Olli BuQ 5	180	65	140	B
Proteus mirabilis -fCC 15230	130	43	IOD	5
lanttao^Ba^^etriE	103	35	72
82	25	45

Beispiel 8

Kulturmedium mit folgender

.-/urdö liergeatellt u^v;il der pH~v,^!ert auf 7,0 eingeregelt.

des li

Glucose 2 ^f/>

0,2 * 0,1 t

Fe ^T^ 2 ppm

sin ⁺⁺ 2 ppm

Hefeextrakt Q^ &

ftais<iuellflü88lgkelt 0,05 f

L-'fyrosin 0,05 ^

L-Herin 0,05 #

L-Cy stein 0,05 1»

CaCO_x (getrennt eterili- 2,5 t ^y eiert)

009827/2011

BAD

- ifl -

Anteile von 20 nil aer jjosuiiu v/urden in Schiit telkolben. von 5υΟ ml gegeben*

Bio wäßrigen rledien wurden jeweils mit Kulturen inokuliert, welche durch Kultivieren von Ü Arten der in Tabelle IV aufgeführten i'iikroOrganismen jeweils auf Bouillon-Agarschlitzen bei 31^f'^ während 24 Stunden hergestellt worden ware α. liachäen: die Kultivierung jedes Mikroorganismus bei 31'-' während 24 stunden unter 'Jchutteln durchgeführt worden war, wurden 0»5ί» (Konzentration in der Flüssigkeit) an ,Ca te chin und 0,2/< (Konezntration in aer PlüBsit;keit) an L-Serin oder L-Cyatein zu der Kulturflüssigkei t ssu^egeben und die Urasetsung während 24 Stunden durchgeführt· Pie !■!enge dea ^eoildeten DOPA in der ReakOionslüsung wurde nach dem Verfahren von Arnov/ und Mitarbeiter bestimvt. wurden folgende Lrgebnisoe erhalten:

Tabelle IV

An^owari.; te ICikroorgani sisen

Gebildetes SOPA (mg/dl) Substrat

s-Oy β te in

Aerobacter e.erogen«ß AXCC 7256 8!5

Eecherichia intermedia ATCC 6750 108

Achromobacter oandicane OUT 8005 62

Proteus mirabilie ATCO 15290 · 78

Xanthomonas oumpestrie ATCC 7381 69

I'Beudomonae ovalis IAM 1622 42

Bacillus eereua IAK 1229 55

105 135 82 98 85 70 72

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BAD ORIGiNAL

Beispiel „--

Ein widriges Kulturmedium mit folgender Zusammensetzung wurde hergestellt und der pH-Wert auf 6,5 eingeregelt.

Zusammensetzung des Mediumsί	0,3	P
Fl e i schextrak t	0,3
Polypepton	2,0
Hefeextrakt	0,3
DL-Alanln	0,2
L-Otyroein	0,1
Glycin	0,2
Citronensäure	0,3
Caseinhydrolysat

Anteile von 60 ial dör Löaim^ wurden in a von 50ü ml gebracht.

I)Ie wöidrigen !iedien wurden jeweile mit Kulturen inokuliert, die durch Kultivierung der in Tabelle V aufgeführten kikroorganiaiasFi auf Bouillon-Agarschlitzen bei 28⁰C während 20 Utunden hergestellt worden waren, und die Kultivierung in den wäßrigen Medien bei 3^ während SO Stunden unter Schütteln durchgeführt·

Dl· mikrobiellen fellen in jeweils 1 Liter der KuIturflUsfilgkeit wurden abzentrifugiert. Die Enaymauagangeraateriallen wurden hergestellt, indem diese erhaltenen mikrobielien Zellen au 100 ml eines 0,05 m-Kaliumplioaphatpuffers (pH 8,5) zugesetzt wurden·

Jedes Ensjmausgangsisaterial (0,5 g Trockenmateri&l) wurde su 100 al der Reaktionslösungen (pH 8,6) zugesetzt, die aus 0,05 m-Kallumphosphatpuffsrlösungen mit einem Gehalt von 1 g D-a«rin₉ 1 g B-Cyat·in, 1 g D-Cystin, 1 g

009827/201 1

ßAD ORIG/NAL

B-Tyrosin oder 3 g B-Alanin ausanunen mit 0,0 g Catechin und 0,2 g Ha₂SO-S bestanden. Bann wurde die Umsetzung bei 31^CC während 20 Stunden ausgeführt, fis wurden* folgende
Mengen an DOPA in den Jeweiligen Realctionslö sungen gebildet ϊ

	Tabelle	V	5290	0,46	Substrat	τ/άϊ)	i)-ÄTä'nin
			15290	0,32	. I^-Öysiin		0,15
-			0,35	0,25	B-äerin	0,06
Angewandte iiiKroorgania		Gebildetes DOPA {;	0,10	0,20	0,52	0,05
		0,21	0,44	0,02
Esühericliia .Intermedia A2CG 6750	U-Üystein	0,05	J,32
äsoherichla freundii ATCC 8090			0,08
Esüherichia coll ATCC 1
Proteua mirabills AI-CC

00982 7/2011

BAD ORIGINAL

Claims (5)

1. Patentansprüche

   Verfahren zur Herstellung von 3t4-Dihydroxyphenyl-

   lr-alanin, dadurch gekennzeichnet, daß

   Ή) Gatechin und eine oder mehrere der folgenden Aminosäuren Cystein, Cystin, Serin, Alanin oder Salze oder Derivate hiervon in einer wäßrigen Flüssigkeit gelöst werden,

   (b) dae Catechin und die Aminosäuren in der Flüssigkeit bei einen pH-wert von 4· bis 11 in Berührung mit einem Äust;an/ri'jr«aterial für eine, wirksame Iienge eines Enzyme, das zur Bildung von 3_t4-Dihydrosyphenyl-L-alanin aus Cateohix! und den Aminosäuren fähig iet» gehalten wird und

   (c) das 3f4~Xdhydroxyphenyl-L-alanin aus der Reaktiouelösung gewonnen v/ird.
2. 2. Verjähren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, datt als Bm:ymauf»gan£smaterial eine Kulturflüesigkeit, die durch Kultivierung von Mikroorganismen in einen, tyrooin« haltigen Nährmedium hergestellt wurde, oder sellfreie Filtrate hiervon, oder wäßrige Suspensionen der mikroMeilen Zellen oder gemahlene Zellauspenoionen oder i'iltratt hiervon, verwendet werden·
3. 3· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Salze der Aminosäuren die /unmonium-, Natrium-, Kalium- oder Caloiumealze oder die Hydrochloride verwendet werden.
4. 4· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Derivate der Aminosäuren die Äthyl- oder Methyleeter oder S-Äthyl- oder S-Methyl-cystein verwendet werden·

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   ^ßAO ORIGINAL

   — C Τ· —
5. 5. Verfahren naoh Anspruch 1 Mb 4, dadurch gekennzeichnet, daß «ine wäßrige Flüssigkeit mit einer Konsentration der Aminosäuren von 0,1 bis 10$, angegeben als freie Aminosäure, und das Ca te chin in einer Menge von 0,1 bis 205* verwendet wird»

   6· Verfahren naoh Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen In einem Hährmedium kultiviert wurden, welches Tyrosin und eine oder mehrere der nachfolgenden Verbindungen Methionin, Glycin, Alanin, Pyridoxin, Pyridoxal oder Pyridoxalphosphat als Kittel zur Verbesserung der Eneymaktivität enthält·

   7» Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismen solche der genera Eaoherichia, Aerobacter, Erwinia, Achromobacter, Pseudomonas, Bacillus, Xanthoisonas oder Proteus verwendet wurden·

   8· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennseiohnet, daß ein Hähraedium mit einem Gehalt an Tyrosin in einer Konzentration von mehr als 0,0i£, bezogen auf das Gewicht d®@ Mediums, verwendet wurde·

   9« Verfahren naoh Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet» ' ■ Mikroorganismen Eecherichii·. intermedia ATCC 6750,

   freunfili AfCC 8090» Bscherichia coll AfCC 15290, a©rätg«::.#ö ASCC 7256« Erwinia herbicols. AICC

   » &ε~·ΛηίΜ. herbicola ATCC 21454» Achromobaot»r OUf 8005 f WmtmB mlT&blXtm AIOC 15 290»

   AfOO 7381, Fstudonenat avails IAH 1622

   Bacillus @®^€us IAM 1229 vorw«iidet wurden.

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