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Beschreibung
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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von
L-Serin, und im einzelnen auf ein Verfahren zur Herstellung von L-Serin aus Glycin
und Formaldehyd in Gegenwart eines Mikroorganismus mit dem Vermögen zur Bildung
von Serin-Hydroxymethyltransferase.
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L-Serin ist als Aminosäure sowie Wirkstoff, Kosmetikum, Futterzusatz
und Zwischenstufen für Wirkstoffe von Bedeutung.
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Serin-Hydroxymethyltransferase (E.C.2. 1.2.1.), auch entweder als
Serin-Transhydroxymethylase oder Serin-Aldolase bezeichnet, kommt verbreitet in
Tieren, Vögeln, höheren Pflanzen, Mikroorganismen usw. vor. Es ist bereits bekannt,
die Reaktion der Synthese einer ß-Hydroxyaminosäure aus Glycin und einem Aldehyd
unter Verwendung von Pyridoxalphosphat als Coenzym zu katalysieren (s. z.B. Advances
in Enzymology 53, 83-112 (1982)).
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Herkömmlicherweise war als Methode zur Herstellung von L-Serin nach
einer enzymatischen Methode unter Nutzung der Serin-Hydroxymethyltransferase eines
Mikroorganismus ein Verfahren zur Herstellung von L-Serin aus entweder Glycin alleine
oder der Kombination von Glycin und einer geringen Menge Formaldehyd unter Verwendung
eines Mikroorganismus
der Gattung Proteus (Patentveröffentlichung
Nr. 58-2677 (1983)), Sarcina, Flavobacterium, Pseudomonas oder Microbacterium (offengelegtes
Patent Nr. 53-81691 (1978)) bekannt.
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Jeder bei einer solchen Methode eingesetzter Mikroorganismus besitzt
eine starke Aktivität der Erzeugung von L-Serin aus Glycin selbst. Selbst wenn Formaldehyd
zur Herstellung der Reaktionslösung zugesetzt wird, ist das Molverhältnis von erzeugtem
L-Serin zu der Reaktion zugesetztem Formaldehyd nur etwa 10:1. Dies wird als Hinweis
darauf verstanden, daß nicht nur Serin-Hydroxymethyltransferase, sondern auch ein
die Reaktion intensiver Spaltung von Glycin katalysierendes Enzym an der Reaktion
teil hat, was zu einer extremniedrigen Ausbeute an L-Serin relativ zu Glycin von
10 Mol-/Mol-% oder weniger führt. Da die Konzentration des angesammelten L-Serins
höchstens etwa 5 g/l ist, kann man hier kaum sagen, daß diese Methode praktisch
ist.
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Die vorliegende Erfindung ergab sich nach intensiven Bemühungen um
ein Verfahren zur Herstellung von L-Serin in hoher Konzentration in Reaktionslösung
in hoher Ausbeute relativ zu Glycin unter Verwendung von durch einen Mikroorganismus
produzierter Serin/Hydroxymethyltransferase in Gegenwart von Glycin durch wirksamen
Einsatz von Formaldehyd. Als Ergebenis wurde nun gefunden, daß L-Serin wirksam produziert
und angereichert werden kann durch gesteuerte Reaktion unter Verwendung der Kulturlösung
oder der Mikrobenzellen eines zur Gattung Escherichia gehörenden Mikroorganismus
mit der Fähigkeit zur Bildung von Serin-Hydroxymethyltransferase und
geringer
oder keiner Fähigkeit zur Bildung von L-Serin aus Glycin alleine, oder eines Materials,
erhalten durch Behandeln der obigen Lösung oder Mikrobenzellen.
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Die Figur ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen
der Konzentration von Glycin, verwendet für die in Beispiel 4 durchgeführte Glycinbehandlung,
und der Menge an produziertem Serin angibt.
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Erfindungsgemäß kann L-Serin in bemerkenswert hoher Ausbeute und
in einer besonders hohen Konzentration produziert und angesammelt werden, indem
Formaldehyd kontinuierlich oder intermittierend so zugesetzt wird, daß seine Konzentration
bei 20 mM oder darunter bleibt. Weiter kann erfindungsgemäß L-Serin wirksam produziert
und angesammelt werden, indem man die Mikrobenzellen des Mikroorganismus mit Glycin
in Kontakt gelangen läßt, bevor man Glycin mit Formaldehyd reagieren läßt, unter
Verwendung der obigen Mikrobenzellen.
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Eine solche erfindungsgemäße Reaktionssteuerung kann alleine oder
in Kombination von zwei oder mehr durchgeführt werden, um eine bemerkenswerte Menge
an L-Serin zu produzieren und anzusammeln.
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Insbesondere bleibt beim erfindungsgemäßen Verfahren am Ende der
Reaktion eine bemerkenswert geringe Menge an Glycin, und dies lindert die Mühe des
Isolierens und Reinigens von L-Serin aus der Reaktionslösung bemerkenswert, was
anzeigt, wie hervorragend das erfindungsgemäße Verfahren als industrielles
enzymatisches
Verfahren zur Herstellung von L-Serin ist.
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Ein erfindungsgemäß verwendeter Mikroorganismus gehört zu dem Bakterienstamm,
der zur Gattung Escherichia gehört, mit der Fähigkeit, Serin-Hydroxymethyltransferase
zu produzieren, und praktisch ohne die Fähigkeit, L-Serin aus Glycin alleine zu
produzieren. Jeder Bakterienstamm mit diesen Eigenschaften kann erfindungsgemäß
verwendet werden, unabhängig davon, ob er aus der natürlichen Welt isoliert oder
durch Maßnahmen, wie Mutation oder Genrekombination,produziert worden ist. Als Beispiele
können Escherichia coli MT-10350 (FERM P-7437) und Escherichia coli MT-10351 (FERM
P-7438) angeführt werden.
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Der hier verwendete Begriff praktisch ohne Fähigkeit" schließt den
Fall völligen Fehlens von Aktivität sowie den Fall einer so schwachen Aktivität
ein, daß die praktische Durchführung der Erfindung nicht gehindert wird, da die
Erzielung des erfindungsgemäßen Effekts in einem solchen Falle nicht speziell gehindert
wird.
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Der Ausdruck ein behandeltes enzymatisches Material" bezeichnet jedes
Material, das durch Behandeln des Mikroorganismus selbst oder seiner Kulturlösung
so erhalten wird, daß die Aktivität der vom Mikroorganismus stammenden Serin Hydroxymethyltransferase
nicht beeinträchtigt wird, da dieses Enzym die Hauptrolle bei der praktischen Durchführung
der
Erfindung spielt.
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Beim Kultivieren eines Mikroorganismus im Rahmen der praktischen
Durchführung der Erfindung bestehen keine speziellen Beschränkungen der Kulturbedingungen
einschließlich des Mediums, und sowohl ein synthetisches als auch ein natürliches
Medium können verwendet werden, so lange sie eine Quelle für Kohlenstoff, für Stickstoff,
anorganische Salze, organischen Nährstoff und dergleichen, die von dem verwendeten
Bakterienstamm genutzt werden können, enthalten. Vorzugsweise wird die Kultur unter
aerober Bedingung bei einem pH von 5 bis 9 und bei einer Temperatur von 25 bis 400C
durchgeführt.
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Die so erhaltene Kulturlösung selbst kann als enzymatische Quelle
verwendet werden. Daneben können auch lebensfähige Mikrobenzellen, aus der Kulturlösung
gewonnen durch Zentrifugieren, Filtrieren oder dergleichen, und durch Trocknen oder
Behandeln dieser Zellen erhaltenes Material (z.B. Material, erhalten durch Behandeln
dieser Zellen durch Vermahlen, Ultraschallwellen, Autolyse oder dergleichen, Eluat
dieser Zellen und aus dem obigen Extrakt erhaltene enzymatische Fraktion) verwendet
werden.
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Vorzugsweise werden die Mikrobenzellen des Mikroorganismus mit Glycin
(Glycinbehandlung) in Kontakt gebracht, bevor man Glycin mit einem Aldehyd unter
Verwendung der obigen Mikrobenzellen reagieren läßt. Wenn die Kulturlösung selbst
als
enzymatische Quelle verwendet wird, wird empfohlen, die Glycinbehandlung durch Glycin-Zusatz
zur Kulturlösung nach beendeter Kultur durchzuführen. Wenn durch Zentrifugieren,
Filtrieren oder dergleichen gesammelte Mikrobenzellen als Enzymquelle verwendet
werden, wird empfohlen, die gesammelten Mikrobenzellen in einer geeigneten Glycinlösung
zu suspendieren. Die Glycinbehandlung, wenngleich sie entweder unter Ruhebedingungen
oder unter Rühren erfolgen kann, wird erwünschtermaßen im pH-Bereich von 6 bis 9
und im Temperaturbereich von 20 bis 700C durchgeführt. Wenngleich eine ausreichende
Wirkung mit 4 Gew.-% Glycin-Konzentration erwartet werden kann, ist die übliche
in diesem Falle verwendete Konzentration etwa 7 bis 23 %. Die Dauer der Glycin-Behandlung
ist, wenngleich sie mit der Konzentration der Mikrobenzellen, der Glycin-Konzentration,
der Temperatur usw. zu variieren scheint, gewöhnlich 30 min bis 24 h. Der Glycin-Behandlung
unterworfene Mikrobenzellen können als Enzymquelle für die Reaktion verwendet werden.
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Es ist wünschenswert, daß die Reaktion zwischen Glycin und Formaldehyd
gemäß der Erfindung in Gegenwart der so erhaltenen, Glycin-behandelten Mikrobenzellen
bei einem pH von 6 bis 9 und bei einer Temperatur von 20 bis 600C unter Schütteln
oder Rühren durchgeführt wird.
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Für die Konzentration des als Reaktionssubstrat verwendeten Glycins
ist ein großer Bereich möglich. Da die übliche Glycin-Konzentration im Bereich von
1 bis 40 % ist, kann als
Reaktionssubstrat verwendetes Glycin in
seiner Gesamtmenge zu Beginn der Reaktion oder nach und nach in verschiedenen Portionen
mit Fortschreiten der Reaktion zugesetzt werden.
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Andererseits sollte Formaldehyd in einer solchen Konzentration verwendet
werden, daß die enzymatische Aktivität nicht gehemmt wird. Es kann nach und nach
in mehreren Portionen mit Fortschreiten der Reaktion zugesetzt werden.
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L-Serin kann in hoher Ausbeute produziert und angesammelt werden,
indem die Formaldehyd-Konzentration bei 20 mM oder darunter bei Durchführung der
Reaktion gemäß der Erfindung gehalten wird.
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Da Serin-Hydroxymethyltransferase Vitamin B6 als Coenzym erfordert,
wird die Reaktion durch Zugabe von Pyridoxalphosphat zum Reaktionssystem in manchen
Fällen beschleunigt.
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In manchen Fällen wird die Reaktion durch Zugabe von Tetrahydrofolsäure,
als Coenzym verwendet, zum Reaktionssystem beschleunigt.
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Diese Reaktion wird durch Zugabe eines Reduktionsmittels oder durch
die Durchführung unter Stickstoff-Zuführung in manchen Fällen beschleunigt. In solchen
Fällen seien als Reduktionsmittel Ascorbinsäure, Dithiothreit, 2-Mercaptoethanol,
Dithioerythrit, reduzierendes Glutathion, Cystein und Natriumsulfit aufgeführt.
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Zum Isolieren des in der Reaktionslösung produzierten L-Serins kann
eine herkömmliche Methode, wie Konzentrieren oder Adsorptions- und Desorptionsbehandlung
mit einem Anionenaustauscherharz oder Aktivkohle, angewandt werden.
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Die qualitative Identifizierung des produzierten L-Serins kann durch
Ninhydrin-Farbentwicklung auf einem Papierchromatogramm erfolgen. Die quantitative
Analyse kann entweder durch Flüssigchromatographie oder durch Ausschneiden eines
Ninhydrin-Farbentwicklungsflecks auf dem Papierchromatogramm erfolgen, bevor das
Eluat des Flecks der kolorimetrischen Bestimmung unterworfen wird. Die quantitative
Analyse von L-Serin kann durch einen mit Leuconostoc mesenteroides durchgeführten
Biotest erfolgen.
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Nachfolgend wird die Erfindung durch Beispiele und Vergleichsbeispiele
weiter beschrieben.
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Beispiel 1 Nachdem Escherichia coli MT-10350 (FERM P-7437) auf einer
Bouillon-Schrägkultur bei 370C 40 h gezüchtet worden war, wurden je fünf 100 mlrPortionen
eines Mediums (pH 7,2), das das in Tabelle I angegebene Nährmedium enthielt, mit
einer Piatinschlaufe des gezüchteten Bakteriums beimpft, bevor Schüttelkultur bei
37 0C für 40 h erfolgte, um die Kulturlösung zu erhalten. Sodann wurden 10 1 des
Mediums der obigen Zusammensetzung in einem 20 l-Fermentator mit der obigen Kulturlösung
beimpft,
belüftet und bewegt, pIi 7,2, 370C, Lio 11.
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Die so erhaltene Kulturlösung wurde zentrifugiert, um Mikrobenzellen
zu sammeln, die dann mit physiologischer Salzlösung gewaschen werden, wodurch etwa
50 g feuchte Mikrobenzellen erhalten werden. Die so erhaltenen feuchten Mikrobenzellen
wurden bei -150C zwei Tage gefroren und unmittelbar vor ihrer Verwendung als Enzymquelle
für die Reaktion aufgetaut. Nachdem 40 g der gefrorenen Mikrobenzellen zu 500 ml
Reaktionslösung, die in Tabelle II angegebenen Bestandteile enthaltend, gegeben
worden waren, wurde Formalin kontinuierlich mit einer peristaltischen Pumpe so zugeführt,
daß sein Konzentrationsbereich von 7 bis 12 mM gehalten wurde, indem die Konzentration
an in der Reaktionslösung enthaltenem Formaldehyd durch Gaschromatographie analysiert
wurde. Die Reaktion wurde bei 500C bei pH 7,0 durchgeführt, wobei die Reaktionslösung
leicht gerührt und ihr Stickstoffgas mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min eingeleitet
wurde. Das Einleiten des Formalins in die Reaktionslösung wurde 37 h fortgesetzt,
und die Gesamtmenge an der Reaktionslösung zugeführtem Formalin (37 Gew./Gew.-%
Formaldehyd-Lösung) war 24 ml. Nach beendeter Reaktion waren 29 g L-Serin in der
Reaktionslösung angesammelt. Die Konzentration des angesammelten L-Serins war 55
g/l.
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Die Molausbeute an produziertem L-Serin relativ zu dem zur Herstellung
der Reaktionslösung zugesetzten Glycin war 83 % und relativ zu Formaldehyd 86 %.
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Tabelle 1 Glucose 1 % MgSO4 7H2O 0,0'j Zitronensäure 0,2% Hefeextrakt
0,05 t NaNH4HP04 4H20 0,3% K2HP°4 0,5% Tabelle II Glycin Tetrahydrofolsäure 0,1
% Pyridoxalphosphat 0,01 % Beispiel 2 Die Reaktion wurde unter Verwendung von Escherichia
coli MT-10351 (FERM P-7438), einem von dem in Beispiel 1 verwendeten Mikroorganismus
verschiedenen Mikroorganismus, nach der gleichen Methode wie in Beispiel 1 durchgeführt.
Formalin wurde in die Reaktionslösung 57 h eingeleitet, und die Gesamtmenge an in
die Reaktionslösung eingeleitetem Formalin war 25 ml. In der Reaktionslösung waren
28 g L-Serin angesammelt.
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Die Konzentration des angesammelten L-Serins war 53 g/l. Die Molausbeute
an produziertem L-Serin relativ zu dem zur lierstel.lullg der Reaktionslösung zugesetzten
Glycin war 80 % und relativ zu dem der Reaktionslösung zugesetzten Formaldehyd 80
%.
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Das Vermögen des erfindungsgemäß zur Prodaktion von L-Serin aus Glycin
in Gegenwart und in Aiwesenheil von Formaldehyd verwendeten Mikrooryanismus wurde
verglichen. Die Ergebnisse waren, wie in den folgenden Versuchsbeispielen angegeben.
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Vergleichsbeispiel 1 100 ml eines flüssigen Mediums (pH 7,0), 10
g/l Fleisc'-,-extrakt, 10 g/l Pepton und 15 g/l NaCl enthaltend, wurden jeweils
mit Escherichia coli MT-10350 und MT-10351 beimpft und 24 h bei 30°C schüttelkultiviert.
Nach beendeter Kultur wurden die Mikrobenzellen zentrifugiert und zweimal mit physiologischer
Salzlösung gewaschen, wodurch etwa 0,4 g feuchte Mikrobenzellen erhalten wurden.
0,2 g der so erhaltenen feuchten Mikrobenzellen wurden in 10 ml einer 50 mM Phosphatpufferlösung
(pH 7,0), 5000 uMol Glycin, 150 pMol Formaldehyd, 10 uMol Tetrahydrofolsäure und
0,1 pMol Pyridoxalphosphat enthaltend, suspendiert und das Gemisch unter Schütteln
2 h bei 37 0C der Reaktion unterworfen.
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Wie in Tabelle III gezeigt, wurde die Ansammlung von L-Serin beobachtet.
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Ein weiterer Versuch wurde nach der gleichen Arbeitsweise durchgeführt,
ausgenommen, daß Formaldehyd nicht zugesetzt wurde, und die folgenden Ergebnisse
wurden erhalten.
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Tabelle III Mikroorganismus Menge angesammelten I.-Serins (Escherichia
coli) (pMol/10 ml) mit HCHO-Zugale ohne HCHO-Zugabe MT-10350 140 12 MT-10351 78
10 So ist offensichtlich, daß der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus L-Serin
aus Glycin und Formaldehyd produzierende Aktivität besitzt und praktisch keine L-Serin
aus Glycin alleine produzierende Aktivität besitzt.
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Beispiel 3 Nachdem 100 ml-Portionen des Mediums mit der in Tabelle
IV gezeigten Zusammensetzung in 500 ml-Schüttelkolben gegossen und sterilisiert
worden waren, wurde diese sterilisierte Portion mit einer Platinschlaufe Eschericichia
coli MT-10350, zuvor auf einer 130uillor1-Scllrägkultur 20 Ii bei 37 0C gezüchtet,
beimpft. Die Schüttelkultur erfolgte 15 h bei 370C. Aus der so erhaltenen Kulturlösung
wurden Mikrobenzellen durch Zentrifugieren gewonnen, bevor sie mit physiologischer
Salzlösung gewaschen und bevor sie wiederum zentrifugiert wurden, um feuchte Mikrobenzellen
zu erhalten. 1 g der feuchten Mikrobenzellen wurden in 15ml 18%iger Glycinlösung
vom pll 7,5 suspendiert
und @ h bei 50°C leicht geschüttell (Glyeinbehandlund)
Nachdem die die Mikrobenzellen enthaltende Glyeinlösüng mit Wasser zur Einsteillung
des Gesamtvolumens auf 10 ml vor dein Einstellen des pH auf 7,0 verdünnt worden
war, wurden 1 my Pyridoxalphospha t, 10 mg Tetrahydrofolsäure und 20 mg Formalin
(37%ige Formaldehydlösung) zugesetzt und die Reaktion gestartet. Sie wurde bei 500C
bei pH 7 durchgeführt, wobei sie leicht gerührt wurde und Stickstoffgas mit einer
Geschwindigkeit von etwa 1 ml/min eingeleitet wurde. Nach dem Starten der Reaktion
wurde eine 10 mg-Portion Formalin alle 30 min der Reaktionsiösung zugesetzt. Die
Reaktion wurde 20 h fortgeführt,und die Gesamtmenge an der Reaktionslösung zugesetztem
Formal in war 420 mg. In der Reaktionslösung hatten sich 500 mg L-Serin angesammelt.
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Vergleichsbeispiel 2 Andererseits wurde 1 g der feuchten, in Beispiel
3 erhaltenen Mikrobenzellen ohne Glycinbehandlung in 10 ml 9%iger Glycinlösung (pH
7,0) suspendiert und die Suspension nach genau der gleichen Arbeitsweise wie oben
umgesetzt. Als Ergebnis hatten sich nur 98 mg L-Serin in der Reaktionslösung angesammelt.
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Tabelle IV Glucose 1 % MgS04-7H20 0,05 % Zitronensäure 0,2 % Hefeextrakt
0,05 % NaNH4HP4-4H2O 0,3 % 2HPO4 0,5 %
Beispiel 4 und Vergleiclisbeispiel
3 Feuchte Mikrobenzellen von Escherichia coli MT-10350 wurden nach der gleichen
Methode, wie in Beispiel 3 angewandt, erhalten. Nachdem 1 g der feuchten Mikrobenzellen
in je 5 ml Glycinlösungen (auf pH 7,5 eingestellt) mit in Tabelle V gezeigten Konzentrationen
suspendiert worden waren, wurde die Suspension 3 h bei 500C leicht geschüttelt.
Sodann wurden Wasser und Glycin der die Mikrobenzellen enthaltenden Glycinlösung
zugesetzt, um die Glycinkonzentration auf 9 % und die Gesamtmenge auf 10 ml einzustellen.
Danach wurde nach der gleichen Methode wie in Beispiel 1 umgesetzt. Während der
Reaktion wurde eine Gesamtmenge von 420 mg Formalin dieser Reaktionslösung zugesetzt.
Die Mengen an in den Reaktionslösungen produziertem L-Serin waren wie in Tabelle
V angegeben.
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Tabelle V Glycin-Konzentration Menge an produziertem für Glycin-Behandlung
(%) L-Serin (mg) 0 90 3 261 6 375 12 498 18 497
Beispiel 5 und
Vergleichffbft>ieJ 4 Mit Escherichia coli MT-10351 wurde wie in Beispiel 3 gearbeitet.
Als Ergebnis hatten sich in der unter Verwendung von Glycin-belwandelten Mikrobenzellen
hergestellten Reaktionslösung 370 mg L-Serin angesammelt. In der mit Mikrobenzellen,
die keine Glycinbedandlung erfahren hatten, hergestellten Reaktionslösung war die
Menge angesammelten L-Serins nur 39 mg.
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Versuchsbeispiel 1 Bestimmung der Serin-Hydroxymethyltransferase-Aktivität
Feuchte Mikrobenzellen, erhalten nach der in Beispiel 3 oder Beispiel 5 beschriebenen
Methode, wurden in 50 mM Kaliumphosphat-Pufferlösung (0,5 mM Pyridoxalphosphat enthaltend)
vom pH 7,0 suspendiert, und die Suspension wurde 5 min bei 4°C einer Ultraschallbehandlung
unterworfen. Nachdem die so erhaltene behandelte Lösung zentrifugiert worden war
(10 000g, 5 min), wurde die im überstand vorhandene Serin-Hydroxymethyltransferase-Aktivität
nach der Methode von R. T. Taylor et al. (Analytical Biochemistry 13, 80-84 (1965))
gemessen.
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Die Messungen der ermittelten spezifischen Aktivität sind in Tabelle
VI angegeben.
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Tabelle Vi Bakterienstamm spezifische Aktivität (pMoi HCif0/min/mg
Prot^:in) Escherichia coli MT-10350 340 (FERM P-7437) Escherichia coli MT-10351
230 (FERM P-7438)