NL192117C

NL192117C - Werkwijze voor het bereiden van L-serine.

Info

Publication number: NL192117C
Application number: NL8500378A
Authority: NL
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals
Priority date: 1984-02-17
Filing date: 1985-02-12
Publication date: 1997-02-04
Also published as: DE3505353C2; NL192117B; GB2154237B; NL8500378A; AU3877685A; FR2563233A1; IT8547691A0; MX7343E; CA1247031A; CH663423A5; GB2154237A; DE3505353A1; KR870001336B1; KR850006228A; AU550367B2; US4782021A; GB8503092D0; IT1209936B; FR2563233B1

Description

1 192117

Werkwijze voor het bereiden van L-serine

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van L-serine door glycine in reactie te brengen met formaldehyde, onder toepassing van een cultuuroplossing van de microbecellen van 5 een micro-organisme behorende tot de soort Escherichia coli, welke micro-organismen het vermogen hebben serinehydroxymethyitransferases te produceren.

Deze werkwijze is bekend uit U.S. Patent 3.755.081. Volgens de bekende werkwijze wordt gebruik gemaakt van de soort Escherichia coli in het algemeen, en wordt de reactie uitgevoerd in afwezigheid van tetrahydrofoliozuur.

10 Door de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding wordt de opbrengst aan L-serine verbeterd, doordat een cultuuroplossing van Escherichia coli MT-10350 (FERM P-7437) en/of Escherichia coli MT-10351 (FERM P-7438), welke micro-organismen niet het praktische vermogen hebben L-serine alleen uit glycine te produceren, wordt gebruikt of enzymatisch materiaal verkregen via de behandeling van de bovenvermelde cultuuroplossing of microbecellen, waarbij de microbecellen vóór het uitvoeren van de reactie tussen glycine 15 en formaldehyde in contact wordt gebracht met glycine.

Door toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding wordt een hogere opbrengst aan L-serine verkregen. Bovendien blijft volgens de uitvinding op het einde van de reactie een opmerkelijk kleine hoeveelheid glycine achter, waardoor het probleem van het afzonderen en zuiveren van L-serine uit de reactie-oplossing in aanzienlijke mate wordt verholpen, waardoor de werkwijze volgens de uitvinding 20 bijzonder geschikt is om L-serine op industriële schaal te bereiden.

Serinehydroxymethyltransferase (EC 2.1.2.1), ook serinetranshydroxymethylase of serinealdolase of threoninealdolase genoemd, komt algemeen voor bij zoogdieren, vogels, hogere planten, micro-organismen en dergelijke. Het is reeds bekend dat dit enzym de reactie van de synthese van een beta-hydroxyamino-zuur uitgaande van glycine en een aldehyde katalyseert, waarbij bij pyrodoxalfosfaat wordt gebruikt als 25 co-enzym (verwezen wordt naar Advances in Enzymology 53, 83-112 (1982). Als werkwijze voor het op enzymatische wijze bereiden van L-serine onder toepassing van het serinehydroxymethyltransferase van een micro-organisme, is een werkwijze voor het bereiden van L-serine uitgaande van hetzij glycine alleen, hetzij de combinatie van glycine en een kleine hoeveelheid formaldehyde, bekend onder toepassing van een micro-organisme behorende tot het geslacht Proteus (Patent Publication no. 58-2677 (1983), Sarcina, 30 Flavobacterium, Psuedomonas of Microbacterium (Patent laid open nr. 53-81691 (1978)). Elk micro- organisme dat bij een dergelijke werkwijze wordt toegepast vertoont een sterke activiteit voor het produceren van L-serine uit glycine als zodanig. Zelfs wanneer fotmaldehyde wordt toegevoegd om de reactie-oplossing te bereiden, bedraagt de molaire verhouding van het geproduceerde L-serine ten opzichte van het aan de reactie toegevoegde formaldehyde slechts ongeveer 10 tot 1. Aangenomen wordt dat dit erop wijst 35 dat niet alleen serinehydroxymethyltransferase, maar ook een enzym dat de reactie van het klieven van glycine katalyseert, intens deelneemt aan de reactie, hetgeen resulteert in een uiterst lage opbrengst aan L-serine ten opzichte van glycine van 10% mol/mol of minder. Aangezien de opgeslagen concentratie van L-serine ten hoogste ongeveer 5 g/l bedraagt, kan moeilijk worden beweerd dat deze werkwijze praktisch toepasbaar is.

40 Na grondig onderzoek is een werkwijze gevonden voor de bereiding van L-serine met een hoge concentratie in de reactie-oplossing, en met een hoge opbrengst ten opzichte van glycine, onder toepassing van het door een micro-organisme geproduceerde serinehydroxymethyltransferase, in aanwezigheid van glycine, door doelmatig gebruik te maken van formaldehyde. Daarbij is gebleken dat L-serine effectief kan worden geproduceerd en opgestapeld door de reactie te controleren onder toepassing van de werkwijze 45 volgens de onderhavige uitvinding.

De uitvinding wordt nader toegelicht aan de hand van de volgende beschrijving, waarbij is verwezen naar de bijgevoegde tekening, waarin het verband is aangegeven tussen de glycineconcentratie die wordt gebruikt voor de glycinebehandeling, welke wordt uitgevoerd in Voorbeeld II, en de hoeveelheid geproduceerd serine.

50

Volgens de uitvinding verdient het voor het bereiden en opslaan van L-serine met een opmerkelijk hoge opbrengst en in een opmerkelijk hoge concentratie, de voorkeur dat de reactie wordt uitgevoerd bij een formaldehydeconcentratie van ten hoogste 20 mM. Dit kan worden uitgevoerd door continu of met tussenpozen formaldehyde toe te voegen.

55 De enzymatische reactie wordt bij de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding dus gecontroleerd door de voomoemde Escherichia coli-stammen vooraf te behandelen met glycine en tijdens de reactie een maximale concentratie van 20 mM aldehyde te handhaven.

192117 2

De volgens de onderhavige uitvinding toegepaste bacteriestammen zijn Escherichia coli MT-10350 (FERM P-7437) en Escherichia coli MT-10351 (FERM P-7438). De uitdmkking ’’zonder het praktische vermogen”, zoals in deze beschrijving is aangegeven, betekent dat het materiaal niet het vermogen heeft en ook slechts een zwakke activiteit heeft, waardoor de toepassing volgens de uitvinding niet wordt voorkomen, 5 omdat geen specifieke problemen worden veroorzaakt ter verkrijging van de werking volgens de uitvinding in een dergelijk geval.

De aanduiding ”een behandeld enzymatisch materiaal” geeft het materiaal aan dat verkregen is door het behandelen van het micro-organisme zelf of de kweekoplossing hiervan op een zodanige wijze, dat de activiteit van serinehydroxymethyltransferase, afgeleid uit het micro-organisme, niet nadelig wordt beïnvloed, 10 omdat dit enzym de hoofdrol speelt bij het uitvoeren van de werkwijze volgens de uitvinding.

Bij het kweken van een micro-organisme bij het toepassen van de werkwijze volgens de uitvinding, zijn er geen specifieke beperkingen ten aanzien van de kweekomstandigheden, met inbegrip van het medium en zowel een synthetisch medium als een natuurlijk medium kunnen worden toegepast in zoverre ze een koolstofbron, een stikstofbron, anorganische zouten, organische voedingsstoffen en dergelijke bevatten, die 15 kunnen worden gebruikt door de toegepaste bacteriële stam. Het verdient de voorkeur dat het kweken wordt uitgevoerd onder aerobe omstandigheden bij een pH van 5 tot 9 en bij een temperatuur van ongeveer 25 tot 40°C.

De aldus verkregen kweekoplossing zelf kan worden toegepast als enzymatische bron. Naast levende microbecellen, verzameld uit de kweekoplossing door centrifugeren, filtratie of dergelijke, en materiaal 20 verkregen door drogen of behandelen van deze cellen (zoals bijvoorbeeld het materiaal dat is verkregen door deze cellen te behandelen via malen, ultrasone golven, autolyse of dergelijke, het eluens van deze cellen en een enzymatische fractie, verkregen uit het bovenvermelde extract) kan ook worden toegepast.

De microbecellen van het micro-organisme dienen in contact te worden gebracht met glycine (glycinebe-handeling) voordat glycine in reactie wordt gebracht met een aldehyde onder toepassing van de eerder 25 vermelde microbecellen. Wanneer de kweekoplossing zelf wordt toegepast als een enzymatische bron, wordt de glycinebehandeling uitgevoerd door toevoeging van glycine aan de kweekoplossing nadat de kweek is beëindigd. Wanneer microbecellen vezameld door centrifugatie, filtratie of dergelijke, worden toegepast als een enzymatische bron, worden de verzamelde microbecellen gesuspendeerd in een hiertoe geschikte glycineoplossing. De glycinebehandeling kan worden uitgevoerd in stilstaande toestand of onder 30 roeren, waarbij het gewenst is deze uit te voeren binnen een pH-gebied van 6 tot 9 en binnen een temperatuurstraject van 20 tot 70°C. Hoewel een voldoende werking kan worden verwacht met een 4 gew.% glycineconcentratie, ligt de gebruikelijke glycineconcentratie in dit geval bij ongeveer 7 tot 23%. De tijd voor de glycinebehandeling, hoewel deze kan variëren in functie van de concentratie van de microbecellen, de glycineconcentratie, de temperatuur en dergelijke, is gewoonlijk 30 minuten tot 24 uren.

35 Microbecellen, onderwoipen aan de glycinebehandeling, kunnen worden toegepast als een enzymatische bron voor de reactie.

Het is gewenst dat de reactie tussen glycine en formaldehyde volgens de uitvinding kan worden uitgevoerd onder het bestaan van de aldus verkregen, met glycine behandelde microbecellen bij een pH van 6 tot 9 en bij een temperatuur van 20 tot 60°C onder de omstandigheden van schudden of roeren.

40 Een ruim traject is toegestaan voor de concentratie aan glycine, dat wordt toegepast als reactiesubstraat. Omdat de gebruikelijke concentratie aan glycine is gelegen tussen 1 en 40%, kan glycine, toegepast als reactiesubstraat, worden toegevoegd in een totale hoeveelheid bij het begin van de reactie of achtereenvolgens in verschillende hoeveelheden bij het voortgaan van de reactie.

Anderzijds moet formaldehyde in een zodanige concentratie worden toegepast, dat de enzymatische 45 activiteit niet wordt geremd. Het kan achtereenvolgens worden toegevoegd in verschillende hoeveelheden met het voortgaan van de reactie.

L-serine kan worden bereid in een hoge opbrengst, door de formaldehydeconcentratie te handhaven op 20 mmol of lager door het uitvoeren van de reactie volgens de uitvinding.

Omdat serinehydroxymethyltransferase vitamine Be als een co-enzym nodig heeft, wordt de reactie in 50 bepaalde gevallen versneld door de toevoeging van pyridoxaalfosfaat aan het reactiesysteem.

De reactie wordt in bepaalde gevallen versneld door de toevoeging van tetrahydrofoliumzuur dat wordt toegevoegd als co-enzym aan het reactiesysteem.

Deze reactie wordt versneld door de toevoeging van een reductiemiddel of door deze uit te voeren onder het in bepaalde gevallen toevoeren van stikstof. In dergelijke gevallen worden ascorbinezuur, dithiotreïtol, 55 2-mercaptoëthanol, dithioërythritol, reducerend glutathion, cysteine en natriumsulfiet eventueel als reductiemiddel toegepast.

Bij het afscheiden van L-serine, bereid in de reactie-oplossing, kan de bekende werkwijze zoals het 3 192117 indampen of adsorptie- en desorptiebehandeling, uitgevoerd met een ionenwisselaarshars of actieve koolstof, worden toegepast.

De kwalitatieve analyse van het bereide L-serine kan worden uitgevoerd via de ninhydrinekleurontwikke-ling op een papierchromatogram. De kwantitatieve analyse kan worden uitgevoerd via vloeistof-5 chromatografie of door het uitsnijden van een vlek ontwikkeld door de ninhydrinekleurontwikkeling op het papierchromatogram voordat het eluens van de vlek wordt onderworpen aan de colorimetrische bepaling.

De kwantitatieve analyse van L-serine kan worden uitgevoerd door een biologische bepaling, uitgevoerd onder toepassing van Leuconostoc mesenteroides.

10 De uitvinding zal nader worden toegelicht aan de hand van de volgende voorbeelden en ter vergelijking dienende voorbeelden.

Vergelijkend voorbeeld 1

Nadat Escherichia coli MT-10350 (FERM P-7437) tot groeien was gebracht op een kweekvloeistof bij 37°C 15 gedurende 40 uren, werd iedere portie van vijf porties medium van 100 ml met een pH-waarde van 7,2, die het voedingsmedium bevatten zoals aangegeven in tabel A, met behulp van een platinalus geënt met de groeibacteriën voordat de kweek onder schudden werd uitgevoerd gedurende 40 uren bij 37°C ter verkrijging van de kweekoplossing. Vervolgens werd 10 I medium van de bovenvermelde samenstelling in een flesvormige fermentor van 201 geënt met de bovenvermelde kweekoplossing, een kweek onder roeren 20 en beluchten uitgevoerd bij een temperatuur van 37°C, een pH-waarde van 7,2, gedurende 30 uren. De aldus verkregen kweekoplossing werd gecentrifugeerd om de microbeceilen te verzamelen, die daarna werden gewassen met een fysiologische zoutoplossing, zodat ongeveer 50 g natte microbeceilen werden verkregen. De aldus verkregen natte microbeceilen werden ingevroren bij -15°C gedurende 2 dagen en direct voordat ze werden gebruikt, ontdooid als enzymatisch bronmateriaal voor de reactie. Nadat 40 g van 25 de ingevroren microbeceilen waren toegevoegd aan 500 ml reactie-oplossing die de in tabel B vermelde componenten bevatten, weid formaline continu toegevoerd mete en peristaltische pomp op een zodanige wijze, dat een concentratie van 7-12 mol werd gehandhaafd, door de concentratie aan formaldehyde, aanwezig in de reactie-oplossing via gaschromatografie te bepalen. De reactie werd uitgevoerd bij 50°C en een pH-waarde van 7,0 onder zacht roeren van de reactie-oplossing en onder toevoeren van stikstofgas 30 aan de reactie-oplossing met een snelheid van 1 ml/minuut. De toevoer van formaldehyde aan de reactie-oplossing werd voortgezet gedurende 37 uren en de totale hoeveelheid foimaline (37 gew.%-ige formaldehyde-opiossing), toegevoerd aan de reactie-oplossing, was 24 ml. Toen de reactie was beëindigd was 29 g L-serine aanwezig in de reactie-oplossing, de concentratie aan L-serine, was 55 g/l. De molaire opbrengst aan L-serine, bereid ten opzichte van het toegevoegde glycine, ter bereiding van de reactie-35 oplossing, was 83% en ten opzichte van formaldehyde 86%.

TABEL A

glucose 1% 40 citroenzuur 0,2%

NaNH4HP04.4H20 0,3% K2HP04 0,5%

MgS04.7H20 0,05% gistextract 0,05% 45 -

TABEL B

glycine 5% tetrahydrofoliumzuur 0,1% 50 pyridoxalfosfaat 0,01 %

Vergelijkend voorbeeld 2

De reactie werd uitgevoerd onder toepassing van Escherichia coli MT-10351 (FERM P-7438), verschillend 55 van het micro-organisme toegepast in voorbeeld I, maar wel werd dezelfde werkwijze toegepast als vermeld in voorbeeld I. De toevoer van formaline in het reactiemengsel werd voortgezet gedurende 57 uren en de totale hoeveelheid toegevoerd formaldehyde aan de reactie-oplossing was 25 ml. In de reactie-oplossing 192117 4 werd 28 g L-serine verzameld, de concentratie L-serine was 53 g/l. De molaire opbrengst aan bereid L-serine ten opzichte van toegevoegd glycine ter bereiding van de reactie-oplossing was 80% en ten opzichte van de aan de reactie-oplossing toegevoegde formaldehyde ook 80%.

Het vermogen van het micro-organisme dat wordt toegepast volgens de uitvinding om L-serine te 5 bereiden uit glycine onder het al of niet aanwezig zijn van formaldehyde, werd vergefeken. De resultaten waren als aangegeven in de hierna volgende experimenten.

Vergelijkend voorbeeld 3

Een vloeibaar medium in een hoeveelheid van 100 ml, met een pH-waarde van 7,0, dat 10 g/l vleesextract, 10 10 g/l pepton en 15 g/l NaCI bevatte, werd geënt met zowel Escherichia coli MT-10350 als MT-10351 en de kweek werd geschud gedurende 24 uien bij 30°C. Nadat de cultuur was beëindigd werden de microbecellen gecentrifugeerd en twee keer gewassen met een fysiologische zoutoplossing, zodat ongeveer 0,4 g natte microbecellen werden verkregen. Van de aldus verkregen natte microbecellen werd 0,2 gesuspendeerd in 10 ml fosfaat-bufferoplossing van 50 mmol met een pH-waarde van 7,0, die 5.000 pmol glycine, 150 pmol 15 formaldehyde, 10 pmol tetrahydrofoliumzuur en 0,1 pmol pyridoxalfosfaat bevatte en het mengsel werd aan de reactie onderwoipen bij 37°C gedurende 2 uren onder schudden. Zoals aangegeven in tabel C werd een toename van L-serine vastgesteld.

Een ander experiment werd uitgevoerd volgens dezelfde bewerking, behalve dat geen formaldehyde werd toegevoegd en daarbij werden de resultaten verkregen zoals aangegeven in tabel C.

20

TABEL C

- micro-organisme (Escherichia coli) hoeveelheid L-serine (pmol/10 ml) 25 met HCHO-toevoeging zonder HCHO-toevoeging MT-10350 140 12 MT-10351 78 10 30

Daarbij is het duidelijk dat het micro-organisme dat wordt toegepast volgens de uitvinding een activiteit heeft voor het produceren van L-serine uit glycine en formaldehyde en geen praktische activiteit heeft voor het produceren van L-serine uit alleen glycine.

35 Voorbeeld I

Nadat parties van 100 ml van het medium met de samenstelling zoals weergegeven in tabel B, waren uitgegoten in schudkolven met een inhoud van 500 ml en gesteriliseerd, werd elke portie met behulp van een platinalus geënt met Escherichia coli MT-10350-cellen, die tevoren op een schuin kweekmiddel gedurende 20 uren bij 37°C tot groeien waren gebracht. De kweek onder schudden werd uitgevoerd 40 gedurende 15 uren bij 37°C. Uit de aldus verkregen kweekoplossing werden microbecellen verzameld door centrifugeren voordat deze werden gewassen met een fysiologische zoutoplossing voordat de centrifugering opnieuw werd uitgevoerd, waarbij natte microbecellen werden verkregen. Van de natte microbecellen werd 1 g gesuspendeerd in 5 ml 18% glycine-oplossing met een pH-waarde van 7,5 en zacht geschud bij 50°C gedurende 3 uren (glycinebehandeling). Nadat de glycine-oplossing die de microbecellen bevatte was 45 verdund met water om het totale volume in te stellen op 10 ml voordat de pH-waarde werd ingesteld op 7,0, werden 1 mg pyridoxalfosfaat, 10 mg tetrahydrofoliumzuur en 20 mg formaline (37% formaldehyde-oplossing) toegevoegd en de reactie gestart. De reactie werd uitgevoerd bij 50°C bij een pH-waarde van 7,0 onder zacht roeren van de reactie-oplossing en daarbij werd stikstofgas toegevoerd aan het reactiemengsel in een hoeveelheid van ongeveer 1 ml/minuut. Na het begin van de reactie werd een hoeveelheid formaline 50 van 10 mg toegevoegd aan de reactie-oplossing gedurende elke 30 minuten. De reactie werd gedurende 20 uren voortgezet en de totale hoeveelheid toegevoegde formaline aan de reactie-oplossing was 420 mg. In de reactie-oplossing was 500 mg L-serine verkregen.

1 g natte microbecellen, verkregen in voorbeeld I, werd, zonder te zijn onderworpen aan de glycinebehandeling, gesuspendeerd in 10 ml 9% glycine-oplossing (pH = 7,0) en de suspensie werd onderworpen 55 aan de reactie door precies dezelfde bewerking als hierboven is aangegeven. Hierdoor werd slechts 98 mg L-serine in de reactie-oplossing verkregen.

Claims

5 192117 Voorbeeld II Natte microbecellen van Escherichia coli MT-10350 werden verkregen door dezelfde werkwijze als toegepast in voorbeeld I. Nadat 1 g microbecellen waren gesuspendeerd in 5 ml van elke glycine-oplossing (ingesteld op een pH-waarde van 7,5) met concentraties zoals weergegeven in tabel E, werd de suspensie 5 gedurende 3 uren zacht geschud bij 50°C. Vervolgens werd water en glycine aan de glycine-oplossing die de microbecellen bevatte toegevoegd om de glycine-concentratie in te stellen op 9% en de totale hoeveelheid op 10 ml. Daarna werd dit onderworpen aan de reactie volgens dezelfde methode als vermeld in voorbeeld I. Tijdens de reactie werd een totale hoeveelheid van 420 mg formaline toegevoegd aan elke reactie-oplossing. De hoeveelheden L-serine, bereid in de reactie-oplossingen, waren als aangegeven in 10 tabel E. TABEL E glycineconcentratie voor de glycinebehandeling (%) hoeveelheid bereid L-serine (mg) 15 - 0 90 3 261 6 375 12 498 20 18 497 Voorbeeld III Dezelfde bewerking als toegepast in voorbeeld I werd uitgevoerd onder toepassing van Escherichia coli 25 MT-10351. Hiertoe werd in de reactie-oplossing, bereid onder toepassing van met glycine behandelde microbecellen 370 mg L-serine verkregen. In de reactie-oplossing, bereid onder toepassing van de microbecellen, die geen glycinebehandeling hadden ondergaan, bedroeg de hoeveelheid L-serine slechts 39 mg. 30 Experiment De bepaling van de serinehydroxymethyltransferase-activiteit. Natte microbecellen, verkregen volgens de werkwijze beschreven in voorbeeld I of voorbeeld III werden gesuspendeerd in een 50 mM kaliumfosfaatbufferoplossing (met 0,5 mmol pyridoxaalfosfaat) met een pH-waarde van 7,0, en de suspensie werd onderworpen aan een ultrasone behandeling bij 4°C gedurende 35 5 minuten. Nadat de aldus verkregen, behandelde oplossing werd gecentrifugeerd (10.000 g, gedurende 5 minuten), werd de serinehydroxymethyltransferase-activiteit, aanwezig in de bovenstaande vloeistof, gemeten volgens de methode van R. T. Taylor et al. (Analytical Biochemistry, 13, 80-84 (1965)). De resultaten van de metingen van de specifieke activiteit waren zoals aangegeven in tabel F. 40 TABEL F bacteriële stam specifieke activiteit (pmol-HCHO/m inuut/mg eiwit) Escherichia coli MT-10350 FERM P-7437 340 45 Escherichia coli MT-10351 FERM P-7438 230 50

1. Werkwijze voor het bereiden van L-serine door glycine in reactie te brengen met formaldehyde, onder toepassing van een cultuuroplossing van de microbecellen van een micro-organisme behorende tot de soort Escherichia coli, welke micro-organismen het vermogen hebben serinehydroxymethyltransferase te produceren, met het kenmerk, dat een cultuuroplossing van Escherichia coli MT-10350 (FERM P-7437) 55 en/of Escherichia coli MT-10351 (FERM P-7438), welke micro-organismen niet het practische vermogen hebben L-serine alleen uit glycine te produceren, wordt gebruikt, of enzymatisch materiaal verkregen via de behandeling van de bovenvermelde cultuuroplossing of microbecellen, waarbij de microbecellen vóór het 192117 6 uitvoeren van de reactie tussen glycine en formaldehyde in contact worden gebracht met glycine.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de reactie wordt uitgevoerd bij een formaldehyde-concentratie van ten hoogste 20 mM. Hierbij 1 blad tekening