RU1792615C - Способ культивировани продуцента бета-экзотоксина - Google Patents

Abstract

Использование: биотехнологи , производство инсектицидных препаратов. Сущность изобретени : продуцентбета- экзотоксина штамм бактерий Вас. thurlnglensls 98-1 с культивируют на среде, содержащей источники углерода и азота до стадии физиологической активности роста продуцента, в частности в течение 16 ч, затем ввод т хлористый барий в количестве 0,6-0,7 мг/л или хлористый кальций в количестве 1,0-1,1 мг на 1 л культуральной среды и продолжают культивирование до выхода культуры в стационарную фазу роста. 1 табл.

Description

Изобретение относитс  к области биотехнологии , в частности к способам производства биологических инсектицидных препаратов и может быть использовано дл  производства СЭР или защиты животных.

Р д штаммов энтомопатогенного мик- , роорганизма Bacillus тЬиг1пд1еп$15(далее ВТ) в процессе их культивировани  выдел ют в культуральную жидкость водорастворимый экзотоксин. Выход экзотоксина зависит от состава питательных сред и может быть увеличен соответствующим его подбором.

Дл  осаждени  экзотоксина из культуральной жидкости ВТ после полного созре- вани  спор предложен способ концентрирована экзотоксина. Дл  этого в фильтрат (либо в фугат) культуральной жидкости (КЖ) внос т соли бари  либо кальци , св зывающие экзотоксин.

Целью насто щего изобретени   вл етс  увеличение выхода бета-экзотоксина

сравнительно экономными средствами и уменьшение времени ферментации.

Наиболее близким к предлагаемому способу культивировани  продуцента бета- экзотоксина  вл етс  способ получени  би- токсибациллина, заключающийс  в культивировании штамма-продуцента экзотоксина на среде, содержащей источник углерода , азота в присутствии соли, образующей нерастворимый комплекс с бета-экзотоксином . В качестве последней примен ют уксуснокислый кальций. Максимально достигнутый выход экзотоксина при реализации данного способа 1232-1480 мг/л при расходе уксуснокислого кальци  до 65 г/л (6,5 вес.%).

Поставленна  нами цель - увеличение выхода бета-экзотоксина при снижении расхода солей, св зывающих бета-экзотоксин в водонерастворимый комплекс, а также уменьшение продолжительности цикла ферментации достигаетс  осаждением экзоток

ю го

сина, выдел емого в процессе культивировани  ВТ путем внесени  0,6-0,7 мг BaCte на 1 л КЖ или 1,0-1,1 мг CaClz на 1 л КЖ в культуральную жидкость ВТ на стадии максимальной физиологической активности. Причем, если необходим препарат, содержащий только экзотоксин, процесс ферментации прекращаетс  с выходом культуры в стационарное состо ние роста.

Указанные добавки образуют стойкие комплексы металл-экзотоксин и тем самым вывод т последний из реакции. При этом с одной стороны, снижаетс  ингибирующее действие экзотоксина на рост микроорганизмов ВТ, с другой - св занный экзотоксин не может расходоватьс  дл  вторичного метаболизма бактерий.

Соли бари  или кальци  следует вносить на 10-16 ч культивировани , что соответствует зоне максимальной скорости роста микроорганизмов, поскольку в это врем  максимальна и скорость накоплени  экзотоксина в КЖ.

Наиболее предпочтительно использование солей бари , поскольку степень св зывани  этого металла с экзотоксином наибольша .

Процесс накоплени  экзотоксина заканчиваетс  на стадии выхода культуры в стационарное состо ние кривой роста, поэтому при получении только экзотоксинсо- держащего препарата дальнейшее культивирование не требуетс .

При получении смешанного экзотоксин и экзотоксинсодержащего препарата культивирование провод т исход  из степени и скорости накоплени  эндотоксина.

Ниже приведены примеры конкретного исполнени .

П ри м е р 1-14. Культивирование штамма ВТ 98-1с проводили в ферментаторе АН- КУМ-2 на среде состава: белково-витаминный концентрат (БВК)3.6% кукурузна  мука 2,8 % соева  мука 0,5 % мел 0,3 % начальное значение рН среды составл ло 7,2 объем среды 1,0л скорость перемешивани  400 об/мин расход воздуха на аэрацию 1 л/сек температура 30°С Во всех вариантах условий эксперимента культивирование начинали с вывода аппарата АНКУМ-2 на режим. В качестве инокул та использовали смыв стерильным физраствором объемом 30 мл с кос ка культуры ВТ-98-1с, прогретый в термобане при температуре 80°С в течение 5 мин. Культивирование вели с контролем температуры, рН среды, р Оа времени культивировани .

Физиологическое состо ние клеток контролировали микроскопированием отобранных проб. Добавки водного раствора хлористого бари  или водного раствора хлористого бари  или водного раствора хлористого кальци , а также продолжительность эксперимента проводили согласно схемы условий эксперимента 1-14.

По завершении каждой ферментации проводили анализ КЖ на содержание экзо

токсина в осадке, в растворе и суммарное

содержание экзотоксина. Содержание экзотоксина определ ли с помощью тонкослойной хроматогрзфии и спектрофотометрии по методике (3). Погрешность измерений со- 0 держани  экзотоксина составила ±0,05 г/л. Эксперименты проводили по следующей схеме:

1. Культивирование ВТ 98 при услови х, описанных выше,-врем  культивировани  5 20 ч добавки не вносились (контроль).

2. Культивирование ВТ 98-1 с как в (1), но внесено 1,8 мл 30 %-ного водного раствора хлористого бари  (0,5 мг) на 1 л КЖ через 16 ч культивировани .

0 з. То же, что и (1), но внесено 2,0 мл 30 %-ного водного раствора хлористого бари  (0,6 мг) на 1 л КЖ через 16 ч культивировани .

4. То же, что и (1), но внесено 2,3 мл 30 5 %-ного водного раствора хлористого бари  (0,7 мг) на 1 л КЖ через 16 ч культивировани .

5. То же, что и (1), но внесено 1.5 мл 60 %-ного водного раствора хлористого каль- 0 цц  (0,9 мг) на 1 л КЖ через 16ч культивировани ,

6. То же, что и (1), но внесено 1,7 мл 60 %-ного водного раствора хлористого кальци  (1,0 мг) на 1 л КЖ через 16 ч культивиро- 5 взни .

7. То же, что и (1), но внесено 1,9 мл 60 %-ного водного раствора хлористого кальци  (1,1 мг) на 1 л КЖ через 16ч культивировани .

08. Культивирование ВТ 98-1с, что и (1), но врем  культивировани  48 ч (контроль).

9. 9, 10, 11, 12, 13, 14-то же, что и 2, 3, 4, 5, 6, 7 соответственно, но врем  культивировани  48 ч.

5 Результаты экспериментов представлены в таблице.

Из таблицы следует, что содержание экзотоксина в КЖ после 20 ч культивировани  превышает содержание экзотоксина в КЖ после 48 ч культивировани  на 45 %.

Внесение в КЖ на 16 ч (при 20-часовом культивировании) раствора хлористого бари  увеличивает содержание экзотоксина на 65%, а раствора хлористого кальци  - на 36 %. Внесение хлоридов бари  или каль- ци  на 16 ч (при 48-часовом культивировании ) также способствует увеличению выхода экзотоксина в сравнении с контролем соответственно от 72 % (BaCte) до 46 % (CaCte) однако, в количественном отноше- нии выход экзотоксина в этом случае ниже, чем содержание экзотоксина, зарегистрированное при 20-часовом культивировании с внесением тех же добавок хлоридов бари  или кальци .

Таким образом, дл  достижени  максимальной концентрации экзотоксина в препарате необходимо ввести указанные добавки на 16 ч от начала культивировани  и закончить процесс ферментации на 20 ч.

При 48-часовой ферментации число жизнеспособных спор не зависит от введени  солей металлов, содержание экзотоксина при наличии последних увеличиваетс  примерно в 1,5-2 раза.

Предлагаемый нами способ культивировани  продуцента бета-экзотоксина был проверен и на среде другого состава, в частности , предложенного авторами за вки.

Основные компоненты среды: источни- ки углерода, азота, лизин сохран лись согласно предложенной рецептуре, а соли, образующие с бета-экзотоксином нерастворимый комплекс, вносили не вначале ферментации , как предлагают авторы изобретени , а на стадии роста, соответствующей максимальной физиологической активности (10-16 ч), причем вместо уксуснокислого кальци  использовались соли либо кальци , либо бари  в концентраци-  х, предлагаемых нами в данной за вке (Примеры 15 и 16).

П р м м е р 15. Штамм ВТ98-1с выращивали на среде, объемом 1 л, содержащей белково-витаминный концентрат (БВК) - 3 %, гидролизат кормовых дрожжей с содержанием растворимого белка 50 мг/л, гидролизат рапсового шрота с содержанием растворимого белка 8 мг/л, лизин кристаллический (0,002 вес.%) при 30°С, аэрации 1 л/мин, скорости перемешивани  400 об/мин. На 10-16 ч культивировани , что соответствовало максимальной физиологической активности продуцента, внесли 2 мл 30 %-ного водного раствора хлористого бари . На 20 ч процесс культивировани  остановили .

Содержание растворенного экзотоксина в КЖ составило: в осадке - 0,92 г/л, в растворе - 0,73 г/л, суммарно - 1,65 г/л.

П р и м е р 16. Штамм ВТ 98-1с культивировали на среде того же состава, что и в примере 15. По истечении 16 ч с начала культивировани  внесли 1,7 мл 60 %-ного водного раствора хлористого кальци . На 20 ч культивировани  содержание экзотоксина составило: в осадке - 0,9 г/л, в растворе - 0,6 г/л, суммарное количество - 1,5 г/л.

Использование предлагаемого способа получени  экзотоксина в процессе культивировани  ВТ обеспечивает следующие преимущества: если исчерпаны все возможности увеличени  выхода экзотоксина оптимизацией состава сред на данном штамме, выход может быть увеличен еще до 70% введением раствора BaCla (или CaCte) ориентировочно на 16 ч роста и прекращением процесса культивировани  на 20 ч.

Таким образом, использование предлагаемого способа получени  экзотоксина обеспечивает следующие преимущества: увеличение выхода экзотоксина на 70%, уменьшение времени ферментации на 45%, а также существенное уменьшение расхода солей, св зывающий бета - экзотоксин в водонерастворимый комплекс.

Экономический эффект от внедрени  предлагаемого изобретени  будет обеспечиватьс  увеличением выхода экзотоксина и снижением технологических затрат при ферментации, и в масштабах СССР составит не менее 700 тыс. руб. в год при уровне рентабельности 33%.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ культивировани  продуцента бета-экзотоксина на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в присутствии соли, образующей нерастворимый комплекс с бета-экзотоксином, отличающийс  тем, что, с целью повышени  выхода целевого продукта при снижении расхода соли и времени культивировани , в

   качестве соли используют хлористый барий в количестве 0,6-0,7 мг/л или хлористый кальций в количестве 1,0-1,1 мг на 1 л куль- туральной жидкости, причём соль ввод т в процессе культивировани  на стадии максимальной физиологической активности роста продуцента, а процесс культивировани  ведут до выхода культуры в стационарную фазу .

   СОДЕРЖАНИЕ ЭКЗОТОКСИНА В КЖ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВНЕСЕНИЯ СОЛЕИ МЕТАЛЛОВ