RU1549227C

RU1549227C - Способ получения комплекса литических ферментов

Info

Publication number: RU1549227C
Authority: RU
Inventors: Г.В. Абрамочкин; М.А. Бобык; В.А. Ежов; И.С. Кулаев; В.А. Ламбина; Л.А. Литвиненко; И.Е. Лузина; С.Б. Петрикевич; З.С. Плотникова; Н.И. Санцевич; А.И. Северин; Г.К. Скрябин; Т.С. Черменская
Original assignee: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН
Priority date: 1984-10-04
Filing date: 1984-10-04
Publication date: 1995-12-20

Abstract

Изобретение относится к микробиологической и медицинской отраслям промышленности, а именно к получению ферментного комплекса, лизирующего грамположительные микроорганизмы, в частности патогенные множественно устойчивые к антибиотикам стафилококки, гемолитические стрептококки группы А, радиоустойчивые микрококки и лонингококки. Цель изобретения заключается в увеличении содержания комплекса литическиих ферментов в культуральной жидкости и сокращении длительности процесса. Способ получения комплекса литических ферментов заключается в том, что отселекционированный штамм продуцент Xanthomonas sampestris ВКПМ В - 4102 1 9 пассажа культивируют на питательной среде, содержащей глюкозу, бактопептон, белково витаминный коцентрат, фосфорнокислые соли калия и натрия, сернокислый магний, хлористый натрий, сернокислое железо и воду при следующем содержании компонентов, г/л: глюкоза 2,00 12,00; бактопептон 2,00 6,00; белково витаминный концентрат 2,50 6,00; Na₂HPO₄× 12H₂O 0,50-4,00; KH₂PO₄ 0,10-1,00; MgSO₄·7H₂O 0,20-3,00; NaCl 0,35 1,00; FeSO₄·7H₂O 0,01-0,25; вода до 1 л, при этом культивирование осуществляют при 29 31°С, pH 6,2 7,5 и парциальном давлении кислорода 30 85% от насыщения. Процесс прекращают после достижения стабильной литической активности культуральной жидкости.

Description

Изобретение относится к микробиологической и медицинской отраслям промышленности и представляет собой способ получения ферментного комплекса, лизирующего грамположительные микроорганизмы, в частности патогенные множественно устойчивые к антибиотикам стафилококки, гемолитические стрептококки группы А, радиусоустойчивые микрококки и менингококки.

Комплекс литических ферментов может найти применение при лечении ряда заболеваний, вызываемых патогенными грамположительными микроорганизмами, при лечении ран, ожогов и других повреждений кожи.

Целью изобретения является увеличение содержания комплекса литических ферментов в культуральной жидкости и сокращение длительности процесса.

Способ получения комплекса литических ферментов заключается в том, что отселекционированный штамм продуцент Xanthomonas campestris ВКПМ В-4102 1-9 пассажа культивируют на питательной среде, содержащей глюкозу, бактопептон, белково-витаминный концентрат (БВК), фосфорнокислые соли калия и натрия, сернокислый магний, хлористый натрий, сернокислое железо и воду при следующем содержании компонентов, г/л: глюкоза 2,00-12,00; бактопептон 2,00-6,00; БВК 2,5-6,00; Na₂HPO₄ x 12H₂O 0,5-4,00; КН₂РО₄ 0,10-1,00; MgSO₄ ˙7 H₂O 0,2-3,00; NaCl 0,35 1,00; FeSO₄ ˙7H₂O 0,01-0,25; вода до 1 л, при этом культивирование осуществляют при 29-31^оС, рН 6,2-7,5 и парциальном давлении кислорода 30-85% от насыщения. Процесс прекращают по достижении стабильной литической активности культуральной жидкости. Биомассу отделяют центрифугированием, комплекс литических ферментов, содержащихся в растворе, выделяют, используя дробное осаждение ацетоном с последующим фракционным осаждением сульфатом аммония, осадок растворяют, раствор диализуют, лиофильно сушат.

Периодический отбор активных форм штамма-продуцента и использование продуцента только 1-9 пассажа позволяют получать стабильный уровень содержания литического комплекса в культуральной жидкости в ферментационных процессах. Среда, используемая в предлагаемом способе, содержит основные питательные вещества, факторы роста и минеральные компоненты, необходимые для роста культуры и образования продукта. Использование в качестве источника углерода глюкозы, БВК и повышенных концентраций сернокислого магния интенсифицирует синтез ферментов комплекса, ответственных за лизис клеточных стенок.

Установленные соотношения компонентов среды и режимы культивирования (см. табл. 1, 2 и 3) позволяют повысить содержание комплекса литических ферментов в среде в 1,2-2,2 раза и сократить длительность процесса получения продукта в 2,5-3,0 раза за счет уменьшения времени выделения продукта.

Литическая активность культуральной жидкости при различных температурах культивирования:
Темпера-
тура, ^оС 20 25 28 30 31 32 34
Активность,
ед./мл 0 10 24 31 33 22 10
Причем культуру Xanth. campestris ВКПМ В-4102 выращивают на установке АНКУМ-2 в непрерывных условиях при температуре 20-34^оС и скорости протока 0,1-1 ч. Литическую активность определяют после установления подвижно-равновесного состояния системы.

Биосинтез литического комплекса в интервалах рН 5,0-8,5:
рН 5,0 5,5 6,0 7,0 7,5 8,0 8,5
Актив-
ность,
ед./мл 0 7 23 46 38 27 17
При этом культуру Xanth. campestris ВКПМ В-4102 выращивают на установке АНКУМ-2 в периодических условиях при 30±1^оС.

Биосинтез литических ферментов при различных величинах парциального давления кислорода в культуральной жидкости:
Парциальное
давление
кислорода
в культу-
ральной
жидкости,
от насыщения 85 60 40 30 22 12
Литическая
активность
культураль-
ной жидкости,
ед./мл 42 37 44 40 22 18
При этом культуру Xanth. campestris В-4102 выращивают при 30±1^оС, рН 7,0-7,6.

Литическую активность в процессе культивирования и в ходе выделения ферментного комплекса определяют следующим образом. К 2 мл суспензии лиофилизированных клеток Micrococcus lysodeikticus в 0,01 М трис-буфере, рН 8,4-8,5 с концентрацией 0,5-0,6 ед. оптической плотности (ФЭК-56М, σ_кюв. 3 мм, с/ф N 6), прогретой в течение 10 мин при 37^оС, добавляют 0,1 мл пробы, смесь инкубируют 5 мин при 37^оС. Активность рассчитывают по формуле
E (ед./мл)

где D_o оптическая плотность контроля;
D оптическая плотность пробы после
инкубации;
t время инкубации, мин;
Р разведение пробы;
0,01 оптическая плотность, соответ-
ствующая 1 ед. активности;
0,1 объем пробы, мл.

Активность комплекса может быть определена также с использованием в качестве субстрата живых клеток Staphylococcus aureus.

П р и м е р 1. В посевной аппарат вносят 20 л питательной среды, состава, г/л: Глюкоза 10,00 Бактопептон 5,00 БВК 3,00 Na₂HPO₄ ˙12H₂O 1,50 KH₂PO₄ 0,35 MgSO₄ ˙7H₂O 0,35 NaCl 0,35 FeSO₄ ˙7H₂O 0,05
Доводят рН до 7,0 с помощью 10%-ного раствора NaOH и стерилизуют среду паром.

В стерильную среду вносят 3% инокулюма Xanth. campestris ВКПМ В-4102 из колб и выращивают посевной материал в течение 19 ч при 31^оС, 300 об/мин мешалки, подача воздуха 0,5 об. в 1 мин на 1 об. среды. Не допускают снижения рН среды ниже значения 6,2.

В 250-литровый ферментер вносят 130 л питательной среды указанного выше состава, доводят рН до 7,0 и стерилизуют в течение 60 мин при давлении 1,0 кгс/см². Раствор фосфатов стерилизуют отдельно при том же режиме. Глюкозу стерилизуют отдельно при 0,5 кгс/см² 30 мин.

Из посевного аппарата в ферментер передают 20 л посевного материала и ведут культивирование при 31^оС, подаче воздуха 0,5 об. в 1 мин на 1 об. среды, чтобы парциальное давление кислорода в среде не опускалось ниже 30% от насыщения. Уровень парциального давления кислорода регулируют, в основном, изменением режимов перемешивания во избежание усиленного пенообразования, возникающего при регуляции р О₂ за счет расхода воздуха. В случае необходимости можно изменять и расход воздуха. Не допускают снижения рН среды ниже 6,2 и увеличения выше 7,5, подавая в среду соответственно 10%-ный раствор NaOH или 10% -ный раствор HСl. К 23 часу кульвитирования активность литического комплекса составляет 44 ед./мл.

Для выделения литического комплекса ферментов культуральную жидкость (145 л) охлаждают до 6^оС, отделяют из биомассы культуры на сепараторе ОСБ (Плавский з-д "Смычка") при 11000 об/мин. Из фильтрата производят фракционное осаждение белков охлажденным до 5^оС ацетоном. Сначала загружают ацетон из расчета 1 об. на 1 об. фильтрата, выдерживают при отключенной мешалке 1 ч и осадок отделяют на сепараторе. К осветленному фугату добавляют ацетон из расчета 1,5 об. на 1 об. исходного фильтрата культуральной жидкости и выдерживают в течение 1 ч. Осадок отделяют на сепараторе. К осветленному раствору добавляют сульфат аммония до 80% насыщения, выдерживают 5 ч и отделяют осадок сепарированием. Осадок (450 г) растворяют в 3,2 л дистиллированной воды при 5^оС до электропроводности диализуемого раствора 6,0.

Отдиализованный раствор ферментов замораживают и лиофильно сушат. Получают 71,16 г готового препарата литического комплекса ферментов с активностью 18,3 ед. /мг препарата. Выход готового препарата от содержания литического комплекса в культуральной жидкости составляет 20,6%
П р и м е р 2. В колбу емкостью 750 мл вносят 100 мл питательной среды состава, г/л: Глюкоза 11,80 Бактопептон 5,80 БВК 6,00 Na₂HPO₄ ˙12H₂O 1,80 KH₂PO₄ 0,50 MgSO₄˙ 7H₂O 1,00 NaCl 0,50 FeSO₄ ˙7H₂O 1,00
Доводят рН среды до 7,0 10%-ным раствором NaOH. Колбу со средой стерилизуют. В стерильную колбу со средой вносят 5% инокулята Xanth. campestris ВКПМ В-4102 и культивируют в течение 20 ч при 30±1^оС на качалке (200 об/мин). Бактериальные клетки отделяют центрифугированием. К 19 часам культивирования активность литического комплекса составляет 35 ед./мл.

П р и м е р 3. Культивируют Xanth. campestris ВКПМ В-4102, как указано в примере 2, на среде следующего состава, г/л: Глюкоза 5,00 Бактопептон 5,00 БВК 2,50 Na₂HPO₄ ˙12H₂O 4,00 KH₂PO₄ 0,50 MgSO₄˙ 7H₂O 1,25 NaCl 1,00 FeSO₄˙ 7H₂O 0,20
К 34 часам культивирования литическая активность культуральной жидкости составляет 63 ед./мл.

П р и м е р 4. Культивируют Xanth. campestris ВКПМ В-4102, как указано в примере 2 на среде состава, г/л: Глюкоза 2,0 Бактопептон 2,0 БВК 5,0 Na₂HPO₄˙ 12H₂O 2,0 KH₂PO₄ 1,0 MgSO₄˙ 7H₂O 3,0 NaCl 2,0 FeSO₄˙ 7H₂O 0,06
К 34 часам культивирования литическая активность культуральной жидкости 53 ед./мл.

П р и м е р 5. Культивируют Xanth. campestris ВКПМ В-4102, как указано в примере 2 на среде состава, г/л: Глюкоза 2,0 Бактопептон 2,0 БВК 2,5 Na₂HPO₄˙ 12H₂O 0,5 KH₂PO₄ 1,0 MgSO₄˙ 7H₂O 0,2 NaCl 1,0 FeSO₄˙ 7H₂O 0,01
К 34 часам культивирования литическая активность культуральной жидкости составляет 38 ед./мл.

П р и м е р 6. Культивируют культуру Xanth. campestris ВКПМ В-4102, выращивают на установке АНКУМ-2 в периодических условиях на среде, указанной в примере 1, при 30^оС и рН 7,0
К 23 часам культивирования литическая активность культуральной жидкости составляет 46 ед./мл.

П р и м е р 7. Культуру Xanth. campestris ВКПМ В-4102 выращивают, как описано в примере 6, при рН 7,5. К 23 часам культивирования литическая активность составляет 38 ед./мл.

П р и м е р 8. Культуру Xanth. campestris ВКПМ В-4102 выращивают в ферментере емкостью 10 л в периодических условиях при 31^оС, рН 7,3 и парциальном давлении кислорода 85% от насыщения. К 24 часам культивирования литическая активность составляет 42 ед./мл.

П р и м е р 9. Культуру Xanth. campestris ВКПМ В-4102 выращивают, как описано в примере 8, при парциальном давлении 30% от насыщения. К 25 часам культивирования литическая активность составляет 40 ед./мл.

П р и м е р 10. Способ получения стерильного литического препарата. Получают литический препарат, как описано в примере 1. Препарат расфасовывают в стеклянные флаконы, герметично закрывают. Стерилизацию проводят γ-облучением (СО⁶⁰) по методу Тацуси Кавахата и др. (акцептованная заявка Японии N 49-39837 "Метод производства стерильных препаратов ферментов"), используя дозу от 0,4 до 1,5 Мрад. Стерильность готового препарата 100% (стерильность определяют микробиологически высевом на тиогликолевую среду, сусло, среду Сабуро). Литическая активность препарата после стерилизации сохраняется.

Препарат сохраняет стерильность и активность в течение 3 лет при хранении при 10^оС.

Использование предлагаемого способа получения литических ферментов позволяет увеличить содержание комплекса литических ферментов в культуральной жидкости с 28 (в прототипе) до 35-63 ед./мл, т.е. в 1,2-2,2 раза, и сократить длительность процесса получения продукта в 2,5-3 раза за счет уменьшения времени выделения литического комплекса в 25-30 раз на стадии концентрирования.

Предлагаемый способ выделения продукта снимает необходимость применения импортных оборудования и материалов при получения комплекса литических ферментов в промышленных условиях.

Кроме того, использование сырья, выпускаемого отечественной промышленностью, дает возможность снизить стоимость сырья на стадии ферментации.

Claims

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ путем культивирования штамма продуцента Hanthomonas campestris ВКПМ В-4102 на питательной среде, выделения целевого продукта из культуральной жидкости и его сушки, отличающийся тем, что, с целью увеличения содержания комплекса литических ферментов в культуральной жидкости и сокращения длительности процесса, для культивирования используют отселекционированный штамм продуцент 1 9 пассажа и питательную среду, содержащую глюкозу, бактопептон, белково-витаминный комплекс, фосфорнокислые соли калия и натрия, сернокислый магний, хлористый натрий, сернокислое железо и воду при следующем соотношении компонентов, г/л:
Глюкоза 2,00 12,00
Бактопептон 2,00 6,00
Белково-витаминный комплекс 2,50 6,00
Na₂HPO₄ · 12 H₂O 0,50 4,00
KH₂PO₄ 0,10 1,00
MgSO₄ · 7 H₂O 0,20 3,00
NaCl 0,35 1,00
FeSO₄ · 7 H₂O 0,01 0,25
Вода До 1 л
при этом культивирование осуществляют при 29 31^oС, рН 6,2 7,5 и парциальном давлении кислорода 30 85% от насыщения.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при выделении целевого продукта перед фракционным осаждением сульфатом аммония проводят дробное осаждение ацетоном.