SU644827A1 - Способ получени фосфолипазы - Google Patents

Description

1

Изобретение Относитс  к технике производства ферментов, в частности получени  фосфолипазы, и может быть использовано в микробиологической промышленности.

Известен способ получени  фосфолипазы путем культивировани  микроорганизмов рода Bacillus на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением фермента из культуральной жидкости 1.

Этот известный способ  вл етс  наиболее близким кпредложенному изобретению по технической сущности и достигаемому результату.

Выход фермента и его качество по известному способу недостаточно высоки, подготовка питательной среды дл  культивировани  требует различных режимов стерилизации вход щих в нее компонентов. Кроме того, основные компоненты питательной среды дл  кзльтивировани  микроорганизмов рода Bacillus  вл ютс  дефицитными и дорогосто щими, а их хранение св зано с затруднени ми, так как требует низких темнератур, что отражаетс  на стоимости целевого продукта.

Цель изобретени  - повышение выхода целевого продукта и улучшение его качества .

Поставленна  цель достигаетс  тем, чтб в предлагаемом способе получени  фосфолипазы из микроорганизмов рода Bacillus использзют штамм Bacillus subtilis G-22.

Способ осуществл ют следующим образом .

Микроорганизмы штамма Bacillus subtilis G-22 культивируют на питательной среде , содержащей источники углерода, азота

и необходимые минеральные соли при следующем соотношении компонентов, г/л: ферментативный крахмал 170, кукурузный экстракт 11,4, пивн1 Ге дрожжи 2,3, лактоза 2,9, (NHi)2НРО48,4, NaCl 0,29, MgSO40,14,

K2S04 2,9, CaCls 1,1, ZnCla 0,14.

Стерилизацию компонентов питательной среды провод т при одном режиме стерилизации 20 мин при 1,2 атм и 123°С. В процессе культивировани  осуществл ю г аэрйцию при количестве подаваемого воздуха 0,17 мин, рН поддерживают в интервале 6,0-8,0 25%-ным раствором аммиачной воды или концентрированной фосфорной кислотой.

Затем фермент выдел ют из кульГуральной жидкости.

Пример 1. Лабораторные опыты дл  получени  фосфолипазы из бактерии рода Bacillus вида subtilis штамма G-22 провод т при последовательности операций: поддержка посевного материала в пробирках, культивирование Bacillus subtilis шт. G-22 в колбах.

Культуру Bacillus subtilis штамм G-22 поддерживают и консервируют на ломтиках картофел  в безкислородных средах: в про-бирках Ру, пробуждают в стерильных услови х . Из -пробирки вынимают резиновую пробку, ватную, смоченную пирогаллолом и гидроокисью кали  и сухую ватную пробку , которую замен ют стерильной ватной пробкой. Затем культуру инкубируют при 37°С 24 часа.

После образовани  обильной пленки на картофеле культуру пересевают на свежий картофель в пробирках. Ру инкубируют при 24 часа.

Оживленную культуру освобождают от вегетативных форм, дл  чего подготавливают солевой раствор состава (на 1 л):

NaCl. 8,5 г

0,026 %-ный раствор CaCla10 мл

0,05%-ный раствор MgCla10 мл

Солевой раствор разливают в пробирки емкостью 18X180 мм по 5 мл и стерилизуют 20 мин при 1,2 атм и 123°С. Затем охлаждают до комнатной температуры и петлей перенос т часть пленки с картофел  в стерильный солевой раствор (соблюдаетс  стерильность).

Суспензию культуры в солевом растворе выдерживают в кип щей вод ной бане 5 мин и после этого быстро охлаждают. После температурного шока, суспензию высевают на свежие ломтики картофел . Выращивают 24 часа при 37°С. Пробирки хран т в холодильнике при +5°С или при комнатной температуре не более недели.

Подготовленную культуру используют в качестве инокул та при культивировании Bacillus subtilis штамма G-22 в колбах. Опыты провод т глубинным способом в аэробных услови х в Эрленмейеровских колбах объемом 100-700 мл, в которые помещают 20-120 мл питательной среды. Культивируют на питательной среде состава , г/л: ферментированный крахмал 170, кукурузный экстракт 11,4, пивные дрожжи 2,3, лактоза 2,9, (NH4)2HPO4 8,4, NaCl 0,29, MgSO4 0,14, K2SO4 2,9, CaCU 1,1, ZnCla 0,14.

Крахмал предварительно ферментируют (осахаривают) следующим образом: к 100 г крахмала приливают 200 мл воды и 20 мл раствора бактериальной амилазы с активностью 3 ед (АС)/мл (по колориметрическому методу). Суспензию тщательно размешивают, клейстеризуют в вод ной бане при 75°С. Оклейстеризованный крахмал разжижают под вли нием бактериальной амилазы. Процесс ведут до образовани  эритродекстринов (красное окрашивание с йодом). Разжиженный крахмал охлаждают до комнатной температуры, смешивают с раствором остальных компонентов и довод т рН до 7,3 25%-ным водным раствором аммиака.

Готовую среду разливают в колбы и стерилизуют 20 мин при 1,2 атм и 123°С. После охлаждени  до комнатной температуры осуществл ют посев выше указанным инокул том (соблюдаетс  стерильность). Культивируют как в стационарных услови х,

так и при перемешивании на круговой качалке при 180 об/мин и 37°С. максимальное накопление фосфолипазы во всех случа х культивировани  в колбах наблюдаетс  от 15 до 35 часов. Продолжительное

культивирование (до 48-50 часов) приводит к сильному уменьшению или полной потере накопленной фосфолипазной активности . Биосинтез фосфолипазы происходит как в стационарных, так и в услови х перемешивани , с некоторым преимуществом во втором случае. Полученна  активность равна 50,0 тромбопдастиновых ед/мл (по методу , описанному Otnaess А. В. и соавторов в журналах «Acta path microbiol. scand.

том В 80, стр. 373, 1972 г. и «Еиг. J. Biochem том 27, стр. 238, 1972 г.). Полученна  наивысша  фосфолипазиа  активность при культивировании в колбах равна 86,7 тромбопластиновых ед/мл.

Из проведенных опытов установлено, что продуцирование фосфолипазы бактери ми Bacillus subtilis штамм G-22 происходит в широком температурном интервале - от до 50°С, с некоторым преимуществом

в интервале 37°С - 50°С (активность в среднем составл ет 54,4 тромбопластиновых ед/мл) и в широком интервале рН - 5,0-9,0, с оптимумом при рН 7,5 (активность в среднем при рИ 7,5 составл ет 86,4

тромбопластиновых ед/мл). При ферментации в колбах бактерии предлагаемого вида хорошо адаптируютс  к услови м культивировани , что св зано со стабильностью (ио активности) получени  фермента фосфолипазы . Из проведенных 86 ферментации в колбах среднее значение фосфолипазной активности составл ет 60,0 тромбопластиновых ед/мл. Пример 2. Полупроизводственные

опыты дл  получени  фосфолипазы из бактерии рода Bacillus вида subtilis штамма G-22 провод т при последовательности операций: поддержка посевного материала в пробирках, выращивание посевного материала в колбах, культивирование Bacillus subtilis штаМма G-66 в 20-л ферментерах. Поддержку культуры Bacillus subtilis штамма G-22 в пробирках в качестве инокул та провод т в соответствии с примером 1.-Культуру Bacillus subtilis штамма G-22 дл  засева ферментеров выращивают в зрленмейеровских колбах на среде, содержащей , г/л: ферментированный крахмал 170,0,

кукурузный экстракт 11,4, пивные дрожжи

2,3, лактоза 2,9, двузамещенный фосфат аммони  8,4, натрий хлористый 0,29, магний сернокислый 0,14, калий сернокислый 2,9, кальций хлористый 1,1, цинк хлористый 0,14.

Осахаривание крахмала провод т согласно примеру 1. Среду стерилизуют 20 минут при 1,2 атм, а затем охлаждают до комнатной температуры, рН среды довод т до 7,2-7,5 25%-ным водным раствором аммиака или концентрированной фосфорной кислотой .

Колбы с питательной средой при соблюдении стерильности засевают с помощью петли кусочком пленки из рабочей пробирки с культурой. Засе нные колбь культивируют в услови х перемешивани  на круговой качалке при 180 об/мин и 37°С в течение 24 часов. Подготовленна  культура Bacillus subtilis штамма G-22 служит в качестве инокул та дл  засева ферментера.

Культивирование провод т в 20-л ферментере при коэффициенте заполнени  0,5. Дл  выращивани  культуры Bacillus subtilis штамма G-22 готов т питательную среду того же состава, как и в Эрленмейеровских колбах. Среду стерилизуют 20 минут при 1,2 атм и 123°С, рН среды после стерилизации довод т концентрированной фосфорной кислотой до 7,0-7,5.

Перед засевом питательную среду в ферментере продувают воздухом. После насыщени  среды кислородом и установлени  температуры 37°С производ т посев из расчета 200 мл микробной взвеси на 10 л среды . Культивирование провод т при 37°С и посто нной аэрации, при количестве подаваемого воздуха, равном 0,17 мин, рН во врем  ферментации поддерживают в интервале 6,0-8,0 путем добавлени  25%-ного водного раствора аммиака или концентрированной фосфорной кислоты.

Максимальное накопление фосфолипаз наблюдаетс  к 15-35 часам роста и составл ет в среднем 97,0 тромбопластиновых ед./мл или 57,0 мг-экв/мл. мцн (по методу,

описанному Zwaal R. F. А. и соавторов в журнале «Biochim. et biophys. acta, том 233, с. 474, 1971).

Предлагаемый способ получени  фосфолипазы по сравнению с известным техническим решением той же задачи позвол ет повысить выход фермента примерно в п ть раз, за счет чего снижаетс  себестоимость продукции, с одновременным улучшением качества целевого продукта.

Способ обеспечивает производство стабильной фосфолипазы (по активности).

Claims (1)

1. Журнал «Микробиологи , т. 39, с. 465, 1970.