CN114854664B - 一种贝莱斯芽孢杆菌yh-18高效产孢的工业化发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌YH‑18高效产孢的工业化发酵方法，属于生物发酵技术领域。本发明通过单因素分析和响应面优化分析得到实验室优化培养基，并在其基础上进行改良筛选得到贝莱斯芽孢杆菌YH‑18高效产孢的工业化发酵培养基：0.5％葡萄糖、2％玉米淀粉、1％玉米浆干粉、0.5％鱼粉蛋白胨、0.1％硫酸铵、0.1％硫酸镁、0.1％磷酸氢二钾、0.2％碳酸钙和0.02％硫酸锰，然后将其进行发酵工艺验证，发现使用本发明的工业化发酵培养基得到的发酵液抑制根癌农杆菌C58生长的能力增强，且通过产品货架期的探索，表明YH‑18液体制剂在4℃环境下至少能保存一年以上，芽孢率高，更耐存储。

Description

一种贝莱斯芽孢杆菌YH-18高效产孢的工业化发酵方法

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种贝莱斯芽孢杆菌YH-18高效产孢及提高贝莱斯芽孢杆菌YH-18发酵液抗菌能力的工业化发酵方法。

背景技术

贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)是由Ruiz等人于2005年提出的新种(Ruiz-garcía,2005)，其分类地位曾与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)归为一起；2008年Wang等(Wang et al,2008)人通过基因组同源性比对后认为贝莱斯芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌应为同种不同名；在2015年和2016年，Dunlap等(Dunlap et al,2015)人先后通过全基因组序列分析得出，解淀粉芽孢杆菌亚种植物专化型(B.amyloliquefaciens subsp.Plantarum)与甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)为同种，并最终确定了甲基营养型芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌植物转化型，贝莱斯芽孢杆菌属于同物异名。而B.velezensis在国内的译名为瓦雷兹芽孢杆菌或贝莱斯芽孢杆菌。

贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)是一类有良好应用价值的芽孢杆菌，其分泌的酶、抗生素或抗菌蛋白等活性物质能够广泛的抑制植物病原真菌和细菌的活性，减少植物病害；且具有解磷、解钾、固氮，产生植物生长因子等作用，从而促进植物养分吸收。因此，研究开发具有促生抗病作用的贝莱斯芽孢杆菌具有广阔应用前景。

贝莱斯芽孢杆菌YH-18(B.velezensis YH-18)是从樱花枝干中分离出来的一株具有固氮、耐盐、解磷、可提高植物抗性和促生增产的有益微生物，能有效地预防樱花、桃树、葡萄等植物的根癌病(江明明,2016；魏丹萍,2020)。

但是目前许多实验室筛选得到的具有优良促生抗病作用的菌株，对于其发酵工艺还仅仅停留在实验室水平，若想将实验室菌株大范围推广运用，必须建立起菌株的工业化发酵工艺，因此建立一种贝莱斯芽孢杆菌YH-18高效产孢及提高贝莱斯芽孢杆菌YH-18发酵液抗菌能力的工业化发酵方法具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种贝莱斯芽孢杆菌YH-18高效产孢的工业化发酵方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种贝莱斯芽孢杆菌YH-18高效产孢的工业化发酵方法，包括以下步骤：

1)采用以下重量百分比的原料配制贝莱斯芽孢杆菌YH-18高效产孢的工业化发酵培养基：0.5％葡萄糖、2％玉米淀粉、1％玉米浆干粉、0.5％鱼粉蛋白胨、0.1％硫酸铵、0.1％硫酸镁、0.1％磷酸氢二钾、0.2％碳酸钙和0.02％硫酸锰；

2)挑取LB平板上贝莱斯芽孢杆菌YH-18单菌落至含LB培养基摇瓶中，恒温震荡条件下进行活化培养，得到一级种子液；

3)将一级种子液以1％接菌量接入LB培养基摇瓶中，恒温震荡条件下进行培养，得到二级种子液；

4)将二级种子液接种至发酵罐，分别依照200L、5000L的一级、二级发酵罐规模进行逐级扩大发酵培养，待发酵液中芽孢率达到95％后停罐。

进一步的，步骤1)中，葡萄糖和硫酸锰单独灭菌后在接种贝莱斯芽孢杆菌YH-18时再加入。

进一步的，步骤2)中，恒温震荡条件为28℃，转速200rpm，培养18～24小时；LB培养基摇瓶中的装液量为20/50mL。

进一步的，步骤3)中，恒温震荡条件为28℃，转速200rpm，培养18～24小时；LB培养基摇瓶中的装液量为0.8/2L。

进一步的，步骤4)中，一级发酵罐以60％装液量、1.12％接菌量、0.05％的消泡剂、在初始pH7.3、培养温度33℃、转速200r/min条件下发酵培养6-8h；二级发酵罐以60％装液量、4％接菌量、0.05％的消泡剂、在初始pH7.3、培养温度33℃、转速100r/min条件下发酵培养。

进一步的，消泡剂为DOWSIL^TMAFE-1520或XIAMETER^TMAFE-1530食品消泡剂。

进一步的，步骤4)中，发酵液中芽孢的含量为3.9×10⁹CFU/mL。

进一步的，步骤4)中，发酵培养过程中，通过调整进气量维持发酵液中溶氧情况，后期溶氧不再上升后可适当减少进气量。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明将实验室优化后的培养基进行改良筛选得到一种贝莱斯芽孢杆菌YH-18高效产孢的工业化发酵培养基：0.5％葡萄糖、2％玉米淀粉、1％玉米浆干粉、0.5％鱼粉蛋白胨、0.1％硫酸铵、0.1％硫酸镁、0.1％磷酸氢二钾、0.2％碳酸钙和0.02％硫酸锰，并将其进行发酵工艺验证，发现使用本发明的贝莱斯芽孢杆菌YH-18高效产孢的工业化发酵培养基得到的发酵液抑制根癌农杆菌C58生长的能力增强，且通过产品货架期的探索，表明YH-18液体制剂在4℃环境下至少能保存一年以上，芽孢率高，更耐存储。

附图说明

图1为不同碳氮源及不同碳氮源浓度对YH-18活菌数、芽孢数和芽孢率的影响图；

图2为不同种类无机盐和不同浓度无机盐对YH-18活菌数、芽孢数和芽孢率的影响图；

图3为不同培养条件对活菌数、芽孢数和芽孢率的影响图；

图4为影响YH-18芽孢含量的相应等高线图和曲面图；

图5为使用实验室优化配方1在50L发酵罐上罐验证中发酵液溶氧和pH变化图；

图6为使用实验室优化配方1在50L发酵罐上罐验证中发酵液总糖和氨态氮含量变化图；

图7为使用实验室优化配方1在50L发酵罐上罐验证中YH-18活菌和芽孢生长变化图；

图8为四种自主设计的配方培养基在50L发酵罐发酵活菌数、芽孢数和芽孢率情况图；

图9为200L种子发酵罐发酵中发酵液pH变化和OD₆₀₀变化图；

图10为5吨发酵罐发酵中发酵液pH、溶氧和OD₆₀₀变化图；

图11为优化前后发酵滤液抑菌能力测定与货架期测定图；图中，A为优化前后发酵滤液抑制根癌农杆菌C58生长情况；B为优化前后发酵液货架期情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

以下实施例所使用的供试菌株具体如下：

贝莱斯芽孢杆菌YH-18菌株，由南京林业大学森林保护实验室前期从樱花枝干中分离筛选得到。

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58菌株，为山东农业大学生命科学学院周传恩教授惠赠。

实施例1B.velezensis YH-18产芽孢培养基成分筛选

(1)菌种活化：采用平板划线法将根癌农杆菌C58菌种、贝莱斯芽孢杆菌YH-18菌种原菌液接种在LB固体平板上，在28℃细菌培养箱中培养24h得到单菌落。

(2)种子液的制备：挑取划线长出的单菌落，转接于装液量为20/50mL的LB培养基中，在28℃，200r/min恒温摇床中培养18h，得到一级种子液。将活化后的一级种子液以1％的接种量接种于相同条件下培养18h后得到的菌液作为后续种子液。

(3)活菌数、芽孢数和芽孢率技术方法：

活菌计数采用稀释涂布平板法详见龚军辉,王晶.稀释涂布平板法计数活菌的方法简介[J].生物学教学,2018,43(2):70-71.

芽孢数统计时，先将待测菌液80℃水浴15min，使菌体失活，再使用稀释涂布平板法，确定发酵液中芽孢数量，详见郑双凤,谭武贵,丰来,等.枯草芽孢杆菌NTGB-178高产芽孢发酵工艺优化[J].南京农业大学学报,2017,40(6):1031-1040.

芽孢率(％)＝芽孢数/活菌数×100％。

(4)最适培养成分优化：分别选择几种供试碳源(葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉、牛肉膏、酵母提取物和糖蜜)、氮源(豆粕、豆饼、玉米浆干粉、生豆粉、蛋白胨、胰蛋白胨、鱼蛋白胨、大豆蛋白胨、NH₄Cl、NH₄SO₄和尿素)和无机盐(NaCl、NaHPO₄·12H₂O、K2HPO4·3H₂O、CaCO₃、MgSO₄·7H₂O、MnSO₄、ZnSO₄·7H₂O)，替换LB液体培养基中的相应组分。在50mL三角瓶装液量40％，接种量1％，转速200r/min，28℃的条件下，摇培72h后计数，测定每毫升活菌数和芽孢数并计算芽孢率，确定最佳碳源、氮源和无机盐种类。并筛选各组分在不同浓度时(碳源浓度0.5％-5％，氮源浓度0.5％-5％，无机盐浓度0.1％-2％)对YH-18产孢的影响，以此确定后续添加浓度。

(5)不同碳源及不同氮源对YH-18产芽孢的影响：

由图1A可知，在不同碳源中贝莱斯芽孢杆菌YH-18的芽孢数由高到低为葡萄糖＞糖蜜＞可溶性淀粉＞玉米粉＞酵母提取物＞蔗糖＞牛肉膏。葡萄糖为碳源时，活菌数和芽孢数最多，为2.7×10⁸CFU/mL和1.6×10⁸CFU/mL，芽孢率达61.6％。因此选择葡萄糖作为YH-18产芽孢的最适碳源。

由图1B可知，芽孢数和活菌数在不同葡萄糖浓度下数量不同，芽孢数和活菌数都是当葡萄糖浓度为1％时达到最高值，芽孢数和活菌数达1.19×10⁹CFU/mL和1.28×10⁹CFU/mL，芽孢率为98.7％。因此选择1％浓度的葡萄糖作为YH-18产芽孢发酵的后续碳源浓度。

由图1C可知，在不同氮源中贝莱斯芽孢杆菌YH-18的芽孢数由高到低依次为：玉米浆干粉＞生豆粉＞豆粕＞豆饼＞蛋白胨＞胰蛋白胨＞大豆蛋白胨＞鱼蛋白胨＞NH₄CL＞(NH₄)₂SO₄＞尿素。以玉米浆干粉作为氮源时，活菌数和芽孢数最多，分别为1.54×10⁹CFU/mL和1.34×10⁹CFU/mL，芽孢率为88.5％。因此，选择玉米浆干粉为YH-18产芽孢的最适发酵培养基氮源。

由图1D可知，虽然活菌数总体是随玉米浆干粉浓度增加呈现逐步升高趋势，但芽孢数则是在玉米浆干粉浓度为1％时达到最高值，为1.35×10⁹CFU/mL，此时芽孢率为77.3％。因此选择1％浓度玉米浆干粉作为YH-18产芽孢发酵培养的后续氮源浓度。

(6)不同无机盐对YH-18产芽孢的影响

由图2A可知，在7种不同的无机盐中，以碳酸钙、磷酸氢二钾或硫酸镁为无机盐时，YH18产芽孢数相对较多，分别是1.12×10⁹CFU/mL、1.02×10⁹CFU/mL和1.0×10⁹CFU/mL，芽孢率分别为51.3％、94.8％和89.8％。虽然硫酸锰的芽孢数也较多，但由于锰离子易造成土壤污染，故不选择硫酸锰作为后续无机盐。且考虑到不同无机盐种类可以提供不同的生长和产孢作用，因此选择磷酸氢二钾、碳酸钙、硫酸镁三者混合使用作为供试菌株发酵培养基的无机盐。

由图2B-D可知，当碳酸钙浓度为0.4％时，芽孢含量最多，活菌数和芽孢数为1.11×10⁹CFU/mL和1.11×10⁹CFU/mL，芽孢率为100％。当硫酸镁浓度为0.2％时，芽孢数最多，活菌数和芽孢数为2.10×10⁹CFU/mL和1.46×10⁹CFU/mL，芽孢率为69.1％。当磷酸氢二钾浓度为0.4％时，芽孢数最多，活菌数和芽孢数为1.60×10⁹CFU/mL和1.5×10⁹CFU/mL，芽孢率为93.4％。因此，选择0.4％碳酸钙、0.2％硫酸镁、0.4％磷酸氢二钾为后续无机盐添加浓度。

实施例2B.velezensis YH-18产芽孢培养条件筛选

使用实施例1优化后的培养基组分，以接菌量1％，初始pH 7.0、装液量40％、温度28℃、转速200r/min为初始培养条件。分别对发酵温度、初始pH值、接菌量、装液量、转速等5个因素依次进行单因素试验，考查YH-18发酵液中的芽孢含量和芽孢率的变化情况，以确定后续发酵条件的控制范围。

由图3A可知，活菌数和芽孢数在pH值6.4-7.9范围比较合适，其中当pH为7.3时，芽孢数达最高为1.52×10⁹CFU/mL，活菌数为1.83×10⁹CFU/mL，芽孢率为84.4％。较低和较高pH都不太适合大量菌体和芽孢产生。因此选择YH-18产芽孢培养的后续pH值为7.3。

由图3B可知，YH-18菌株在22℃-37℃温度范围均可生长繁殖，活菌数、产芽孢数和芽孢率在不同温度下明显有变化。当培养温度为33℃时，活菌数和芽孢数均达到最高值，分别为1.73×10⁹CFU/mL和1.62×10⁹CFU/mL，芽孢率为93.4％。因此，选择YH-18产芽孢发酵的后续培养温度为33℃。

由图3C可知，当接菌量为0.5％时，活菌数和芽孢数最高，分别为2.14×10⁹CFU/mL和1.65×10⁹CFU/mL，芽孢率为77.2％。当接菌量超过0.5％时，芽孢数降低。因此，选择YH-18产芽孢发酵的后续培养接菌量为0.5％。

由图3D可知，当转速为200r/min时，活菌数和芽孢数最高，分别为1.53×10⁹CFU/mL和1.16×10⁹CFU/mL，芽孢率为75.3％，活菌数和芽孢数均显著优于其他处理。因此选择YH-18产芽孢发酵后续培养转速为200r/min。

由图3E可知，当装液量为20％时，虽然芽孢率可达100％，但活菌数和芽孢数都较低。当装液量为40％时，活菌数和芽孢数最高，分别为1.80×10⁹CFU/mL和1.30×10⁹CFU/mL，芽孢率为72.3％。因此，选择YH-18产芽孢发酵的后续培养装液量为40％。

实施例3B.velezensis YH-18产芽孢培养的响应面优化

(1)PB试验

在单因素优化试验结果基础上，利用Design expert V10.0.1.软件制定PB试验方案，每个变量设置1个低水平和1个高水平，每组试验均设3次重复。以菌株YH-18发酵液芽孢含量为响应值，筛选出对芽孢数量影响显著的因素。

运用Design Expert10.0.1软件设计PB试验，结果与分析见表1-2。该模型R²为100％，R²adj为99.99％，P值＝0.0069＜0.01，表明该模型较为可靠。随着葡萄糖、玉米浆干粉、硫酸镁、装液量、转速等变量水平升高表现为负效应，碳酸钙、磷酸氢二钾、初始pH、温度、接菌量等变量水平升高时表现为正效应。将影响最为显著的三个因素，即玉米浆干粉、装液量和接菌量进行下一步最陡爬坡试验。

表1PB试验设计及结果

表2PB试验各因素方差分析

(2)最陡爬坡试验

根据PB试验结果筛选到影响产孢比较显著的因素，并确定爬坡方向和步长，快速逼近最佳区域，以此得到BBD设计试验的中心点。

由PB试验可知，玉米浆干粉和装液量具有负效应，在爬坡试验中应逐渐减小，接菌量具有正效应，应逐渐增大。由表3可知，YH-18发酵液芽孢含量最高值出现在试验4，选择试验3的条件作为响应面试验因素水平的中心点，即0.8％玉米浆干粉、1.1％接菌量、32％装液量。

表3最陡爬坡试验

试验号	N源(％)	接菌量(％)	装液量(％)	活菌数	芽孢数
						1	0.2	0.5	20	2.04	1.18
2	0.4	0.7	24	1.78	0.46
						3	0.6	0.9	28	2.08	1.47
4	0.8	1.1	32	2.97	2.22
						5	1	1.3	36	1.70	1.49
6	1.2	1.5	40	1.03	0.84

(3)BBD试验

依据PB试验和爬坡试验筛选出的变量及浓度设计BBD试验，使用design expert10.0.1软件对试验结果进行分析处理。

将最陡爬坡试验中的玉米浆干粉、接菌量和装液量分别标记为A、B、C，BBD试验设计结果与分析见表4-5。模型R²＝0.9068，R²adj＝0.7870，P<0.01，失拟项P>0.05，说明该模型显著，可用于分析与预测响应值。A、A²、B²、C²对YH-18发酵产芽孢有极显著影响(P<0.01)，C、AC有一定影响但不显著(P<0.10)。通过designexpert10.0.1软件分析试验结果，并拟合出响应值与试验因子的二次回归方程为：芽孢含量＝-83.3115+50.18525A+34.94363B+2.93537C-0.14375AC-0.445AB-0.034531BC-21.81969A²-15.09156B²-0.04012C²。

表4 BBD试验设计与结果

试验号	N源(％)	接菌量(％)	装液量(％)	芽孢数(109CFU/ml)
					1	0.8	1.3	28	1.99
2	0.8	1.1	32	3.33
					3	1	1.3	32	1.85
4	0.8	0.9	28	1.54
					5	1	0.9	32	1.84
6	0.8	1.1	32	3.27
					7	0.8	0.9	36	1.91
8	0.8	1.1	32	2.76
					9	1	1.1	36	1.12
10	0.8	1.1	32	3.21
					11	0.6	1.1	28	1.46
12	1	1.1	28	2.57
					13	0.6	1.1	36	1.44
14	0.8	1.3	36	2.25
					15	0.6	0.9	32	1.52
16	0.6	1.3	32	1.55
					17	0.8	1.1	32	3.25

表5 BBD方差分析结果

根据回归方程绘制等高线图和3D曲面图，结果见图4。等高线图呈椭圆状，3D曲面图开口朝下，表明响应值存在最大值。通过回归方程分析，得出回归模型存在的R极值的条件为：即0.825％玉米浆干粉、1.118％接菌量、31.529％装液量，此条件下芽孢理论含量为3.186×10⁹CFU/mL。在该条件下进行3次重复实验，芽孢数分别为3.26×10⁹CFU/mL、3.17×10⁹CFU/mL和3.32×10⁹CFU/mL，平均值为3.25×10⁹CFU/mL，与预测结果接近，证明模型较为有效。

综上所述，上述实施例将单因素分析和响应面试验相结合，筛选出有利于贝莱斯芽孢杆菌YH-18产孢的培养基最佳组分为：1％葡萄糖、0.825％玉米浆干粉、0.4％碳酸钙、0.4％磷酸氢二钾、0.2％浓度的硫酸镁；有利于贝莱斯芽孢杆菌YH-18产芽孢的最佳发酵条件为31.529％装液量、转速200r/min、pH 7.3、培养温度33℃、1.118％接菌量；使用优化培养基和培养条件培养出来的发酵液抑制根癌农杆菌C58生长的能力增强，发酵液货架期明显增长。

实施例4

(1)摇瓶种子液培养：将保存的贝莱斯芽孢杆菌YH-18甘油管在LB固体平板上划线，在28℃恒温细菌培养箱中培养24h后。挑取YH-18单菌落于20/50mL LB培养基中28℃、200r/min培养18-24h制成一级种子液，再将一级种子液以1％接种于400/1000mL实施例3筛选出的优化培养基(1％葡萄糖、0.825％玉米浆干粉、0.4％碳酸钙、0.4％磷酸氢二钾、0.2％浓度的硫酸镁)中28℃、200r/min培养18-24h制成50L发酵罐培养所需的种子液。

(2)50L发酵罐发酵：将50L发酵罐以60％装液量进料，培养基初始pH7.3，培养基灭菌冷却至33℃时，以1.12％无菌环境下接入种子液后开始发酵培养。以150r/min、0.05Mpa罐压、50L/min标记溶氧满点100％。全程培养温度33℃、搅拌转速150-200r/min，罐压0.04-0.06Mpa，进气量25-50L/min进行培养发酵。发酵过程中每4h取样镜检，结晶紫染色观察发酵液活菌和芽孢形成情况，至镜检90％左右芽孢形成停罐后放液。

(3)50L发酵罐发酵溶氧和发酵液pH测定：每隔半小时记录一次发酵控制面板上显示的发酵液pH和发酵液溶氧情况。

由图5可知，50L发酵罐的pH和溶氧在0-5h内呈逐渐降低趋势，且在不断提升转速和进气量的情况下，溶氧仍下降迅速，主要原因在于菌体生长前期利用速效碳源后代谢产酸导致。在5-6h内溶氧回升，pH趋于稳定，主要原因可能在于供氧不足，菌株生长停滞。在6h时再次提高供氧量，6-25h的时间内，出现了溶氧和pH先降低后升高的现象，主要原因在于菌株在供养充足的情况下再次利用速效碳源来生长繁殖，溶氧和pH降低。后速效碳源利用完全后，将之前代谢产生的有机酸利用掉后继续生长繁殖，在此过程中可能积累了碱性代谢物质，pH逐渐升高。在25-44h的时间内，pH和溶氧出现了再次降低后升高的现象，原因可能是在此期间又出现了一个生长高峰，C、N利用加快。

(4)50L发酵罐发酵液总糖和氨态氮的测定：每隔四小时取一次样，在发酵前期4-8小时内再多取一次6h的样品。将样品6000rmp离心10min后，采用3，5-二硝基水杨酸法测定发酵液总糖含量，用凯氏定氮法测定发酵液中氨态氮含量。

由图6可知，发酵液中的总糖含量随着发酵时间的延长逐渐降低。在0-12h内利用较快，在4-6h内总糖利用急剧升高，表明在此期间，YH-18利用速效碳源迅速生长繁殖。到12-44h期间，发酵液中的总糖含量基本消耗殆尽。发酵液中的总糖含量严重缺乏可能会导致菌株生长不足，后期无法大量生长繁殖。氨态氮含量在0-8h内呈现先升高后降低的趋势，在8h后逐渐趋于稳定。

(5)50L发酵罐发酵液活菌数和芽孢数的测定：计数方法同实施例1。在发酵期间每隔4h对发酵液进行采样，测定发酵液中的活菌数和芽孢数，结果如图7所示。活菌数在4h左右开始迅速增加，进入对数生长期，到24h活菌数达到最大值为2.19×10⁹CFU/mL。但在24h后菌体大量自溶或衰老死亡，活菌数逐渐减少，到36小时逐渐趋于稳定。44h发酵液活菌数为6×10⁸CFU/mL。芽孢数在发酵过程中形成缓慢，在16h后逐渐大量形成芽孢，到44h时活菌基本为芽孢，此时芽孢数达5.3×10⁸CFU/mL，芽孢率为88.33％。这与实验室优化得到的3.25×10⁹CFU/mL发酵液芽孢量相差甚远，主要原因可能是由于发酵罐与摇瓶培养差异较大，而由单因素和响应面试验设计优化出的发酵培养基1中只含有速效碳源，而在50L上罐工艺验证时，菌株有充足的供氧和空间可以迅速生长，碳源又消耗过快，无法提供菌株足够养分，导致菌株不能大量繁殖和产孢，最终发酵液芽孢含量较实验室培养降低10倍左右。

为解决上罐后菌株缺乏养分无法大量繁殖，且发酵过程中YH-18菌株产泡严重，发酵时间长等问题，在实施例1优化后的培养基配方的基础上自主设计了2号、3号、4号和5号4个培养基配方(表6)，然后在50L发酵罐上验证其发酵情况，结果如图8所示。

表6设计的4个发酵培养基配方

由图8可知，在增加碳源含量和补加适量缓释碳氮源后，4个自组设计配方的活菌数和芽孢数都有了极显著提升，在培养48h后芽孢率都较高。其中2号培养基表现最佳，活菌数和和芽孢数为4.42×10⁹CFU/mL和4.30×10⁹CFU/mL，芽孢率为97.29％。因此，后续将继续把2号培养基进行5吨发酵罐大试验证。

(6)发酵过程中消泡剂的选择

供试消泡剂为：

工业消泡剂ZJ-800：由有机硅、聚醚、疏水二氧化硅、抑泡剂符合调配而成，乳白色液体。

陶氏DOWFAXDF-103消泡剂：一种非离子表面活性剂，属于嵌段型聚醚类物质，透明液体。

DOWSIL^TMAFE-1520食品消泡剂：水性体系有机硅消泡剂，乳白色液体。

XIAMETER^TMAFE-1530食品级消泡剂：水性体系有机硅消泡剂，乳白色液体。

消泡剂的筛选为：在发酵培养基中以0.05％的量加入消泡剂，观察发酵过程中添加不同消泡剂后的初次起泡时间。将灭菌消毒后的1％浓度的消泡液接入自动消泡设备上，开启发酵罐自动消泡功能，发酵结束后测定发酵过程中补加的消泡剂的量。

由表7可知，使用4种不同的消泡剂效果不一，根据初次起泡时间和发酵过程中补加消泡剂的量可知，XIAMETER^TMAFE-1530和DOWSIL^TMAFE-1520两种食品级消泡剂消泡效果最佳，加入相同量后可以较长时间抑制发酵液起泡，且后续补加的量少。其次是陶氏DOWFAXDF-103消泡剂，起泡时间和补加量中等。效果最差的为工业消泡剂ZJ-800，不仅起泡时间较快，且在发酵过程中补加的量远超其他种类的消泡剂。消泡剂加入过多会影响细菌的正常生长，减少和减弱细菌的生长以及产抑菌物质等能力，且后续施用在土壤中也可能造成环境污染。XIAMETER^TMAFE-1530和DOWSIL^TMAFE-1520两种食品级消泡剂安全可靠、添加量少，更适合在YH-18工业化发酵中使用。

表7四种消泡剂的消泡能力情况

(7)5吨发酵罐种子液制备：

一级种子液：挑取LB平板上单菌落至20/50mlLB摇瓶，28℃，200rpm，18～24小时。

二级种子液：接一级种子液以1％接菌量接种至2个0.8/2LLB摇瓶，28℃，200rpm，18～24小时。

种子罐制备：种子罐培养基配方和5吨发酵罐配方一致，投料体积为120L，接种时加入单独灭菌的50％葡萄糖1200ml。将二级种子液接种至200L种子罐，33℃培养6～8小时。

如图9所示，种子罐发酵液pH在3-4.5h内迅速下降，在4.5-7.5h逐渐上升，表明菌株在3-4.5h内开始迅速繁殖。生长趋势与在50L发酵罐中的发酵情况相一致，菌株将在pH升高过程中大量繁殖。

每1.5h对种子罐发酵液进行取样，检测到发酵液OD₆₀₀液在0-4.5h内缓慢升高，到4.5h后OD₆₀₀迅速升高，菌株生长进入对数生长。到7.5h时发酵液OD₆₀₀达到20左右，开始转罐，进行五吨罐发酵。

(8)5吨发酵罐发酵：

以优化后的培养基2号配方(0.5％葡萄糖、2％玉米淀粉、1％玉米浆干粉、0.5％鱼粉蛋白胨、0.1％硫酸铵、0.1％硫酸镁、0.1％磷酸氢二钾、0.2％碳酸钙、0.02％硫酸锰)，投料体积为3吨，原料中的葡萄糖和硫酸锰单独灭菌后在接菌时投入，待种子罐培养6～8h后转接到5吨发酵罐中发酵培养。在4-8h内关注溶氧变化，不断提供菌株生长所需的充足氧气，待发酵液中芽孢率达到95％后停罐。

如图10所示，5吨发酵罐发酵过程中，发酵液pH和溶氧变化和在50L发酵罐中发酵的变化趋势基本一致，但两个生长点变化提前。但在改变配方、发酵罐接种量和扩大发酵后，每3h对5吨发酵罐内的发酵液取样，检测到发酵液OD₆₀₀液在0-3h内缓慢升高，到3h后OD₆₀₀迅速升高，菌株生长进入对数生长，进行一系列生理生化反应。镜检下检测到95％以上芽孢形成后停罐，稀释涂布出发酵液中芽孢含量达3.9×10⁹CFU/mL。

(9)使用优化配方的发酵液抑菌能力测定与货架期测定：

将未使用优化配方(LB培养基、初始培养条件)的发酵液和使用优化配方的发酵液5000转离心10分钟，取上清液过细菌滤膜。随后将根癌农杆菌C58种子液以0.2％接种于两种分别添加了0.5％发酵滤液的LB培养基中，使用全自动微生物生长曲线分析仪，观察48h内根癌农杆菌的生长情况。

在100L发酵罐中采用常规发酵，即使用NA培养基，60％装液量，2％种子液接种量，200r/min，pH 7.0-7.2，初始通气量50L/h，温度28℃条件下，发酵24小时后得到未优化配方发酵液。将使用未优化配方和优化后配方发酵得到的发酵液同时保存在4℃冰箱内，每隔四个月检测其发酵液内活菌数。

由图11可知，使用优化后的培养基和培养条件发酵产生的发酵液对根癌农杆菌C58生长的抑制作用明显比优化前发酵产生的发酵液更强，且优化后的发酵液在52小时后仍有较好的抑制效果。将优化后的发酵液和平时使用NA发酵24h的发酵液同时保藏在4度条件下，优化后的发酵液货架期明显更长，且在一年后仍有87.5％存活率。而未优化的发酵液在第四个月时活菌含量就急剧减少，仅为初始菌体浓度的0.06％。

本发明将实验室优化后的培养基1进行改良筛选得到的自组设计培养基2，在50L和5吨发酵罐上罐验证后，得到稳定的大罐工业化发酵工艺。即使用二级发酵，优化后培养基为：0.5％葡萄糖、2％玉米淀粉、1％玉米浆干粉、0.5％鱼粉蛋白胨、0.1％硫酸铵、0.1％硫酸镁、0.1％磷酸氢二钾、0.2％碳酸钙、0.02％硫酸锰(葡萄糖和硫酸锰单独灭菌后接种时加入)。一级发酵即种子罐发酵时，在200L种子罐以60％装液量、1.12％接种量、0.05％的消泡剂(DOWSIL^TMAFE-1520或XIAMETER^TMAFE-1530食品消泡剂)、初始pH7.3、培养温度33℃、转速200r/min条件培养6-8h，观察OD₆₀₀情况后转罐。二级发酵即5吨罐发酵，将种子罐中发酵液转入灭菌完成后有60％装液量的5吨发酵罐中，在含0.05％的消泡剂(DOWSIL^TMAFE-1520或XIAMETER^TMAFE-1530食品消泡剂)，初始pH7.3、转速100r/min，培养温度33℃条件下培养。发酵过程中在4-8h内调整进气量来维持发酵液中溶氧情况，后期溶氧不再上升后可适当减少进气量，发酵过程中接入灭菌消毒后的1％浓度的消泡剂，开启自动消泡。到培养40h左右，镜检观察发酵液芽孢率达95％以上后停罐放料。得到最终发酵液中芽孢含量为3.9×10⁹CFU/mL。

Claims (7)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌YH-18高效产孢的工业化发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：1)采用以下重量百分比的原料配制贝莱斯芽孢杆菌YH-18高效产孢的工业化发酵培养基：0.5％葡萄糖、2％玉米淀粉、1％玉米浆干粉、0.5％鱼粉蛋白胨、0.1％硫酸铵、0.1％硫酸镁、0.1％磷酸氢二钾、0.2％碳酸钙和0.02％硫酸锰；2)挑取LB平板上贝莱斯芽孢杆菌YH-18单菌落至含LB培养基摇瓶中，恒温震荡条件下进行活化培养，得到一级种子液；3)将一级种子液以1％接菌量接入LB培养基摇瓶中，恒温震荡条件下进行培养，得到二级种子液；4)将二级种子液接种至发酵罐，分别依照200L、5000L的一级、二级发酵罐规模进行逐级扩大发酵培养，待发酵液中芽孢率达到95％后停罐。

2.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌YH-18高效产孢的工业化发酵方法，其特征在于，步骤1)中，葡萄糖和硫酸锰单独灭菌后在接种贝莱斯芽孢杆菌YH-18时再加入。

3.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌YH-18高效产孢的工业化发酵方法，其特征在于，步骤2)中，恒温震荡条件为28℃，转速200rpm，培养18～24小时；LB培养基摇瓶中的装液量为20/50mL。

4.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌YH-18高效产孢的工业化发酵方法，其特征在于，步骤3)中，恒温震荡条件为28℃，转速200rpm，培养18～24小时；LB培养基摇瓶中的装液量为0.8/2L。

5.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌YH-18高效产孢的工业化发酵方法，其特征在于，步骤4)中，一级发酵罐以60％装液量、1.12％接菌量、0.05％的消泡剂、在初始pH7.3、培养温度33℃、转速200r/min条件下发酵培养6-8h；二级发酵罐以60％装液量、4％接菌量、0.05％的消泡剂、在初始pH7.3、培养温度33℃、转速100r/min条件下发酵培养。

6.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌YH-18高效产孢的工业化发酵方法，其特征在于，步骤4)中，发酵液中芽孢的含量为3.9×10⁹CFU/mL。

7.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌YH-18高效产孢的工业化发酵方法，其特征在于，步骤4)中，发酵培养过程中，通过调整进气量维持发酵液中溶氧情况。