CN102943051B - 一种生物有机肥发酵菌种s4的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种烟草秸秆生物有机肥发酵菌种解淀粉芽孢杆菌S4( Bacillus amyloliquefaciens S4 ， 保藏为CCTCC No：M2010249)，它们是从烟草秸秆中在高温重烟碱条件下分离筛选出的，能够在烟碱存在的条件下生存，经培养和扩繁后，加入到废弃的烟草秸秆混合物中，在自然条件下进行固态发酵，将烟草秸秆废弃物转化为烟草秸秆生物有机肥。该烟草秸秆生物有机肥可以代替其他肥料进行烟草生产，可以增加烟叶产量、增加烟叶产值和改善烟叶评吸质量，同时也消除了烟草秸秆废弃物对环境的污染。

Description

一种生物有机肥发酵菌种S4的制备方法

本申请是名称为“一种生物有机肥发酵菌种的制备方法”、申请号为201010538124.7、申请日为20101027专利申请的分案申请。 

技术领域

本发明涉及的是农业生物有机肥生产技术，特别是一种固态发酵制备烟草秸秆生物有机肥的菌种制备方法。 

背景技术

烟草是一种重要的经济作物，在国民经济中具有十分重要的作用。在我国烟草种植生产过程中，长期以来以化学肥料为主，造成土壤有机质数量锐减，团聚体数量和质量下降，通气性退化，影响烟叶生产的产量和质量。另外，当烟叶采收后，在烟田中丢弃大量的废弃烟草秸秆，最长时间可达五个月，增加次年烟田病虫害，污染烟田生态环境。按照行业规定，应该集中烟草秸秆焚烧处理，但这样会增加CO₂排放量，造成大气环境污染。是一种不得而为之的办法。 

现有技术中有借用一般农作物秸秆固体发酵技术把烟草秸杆发酵变成生物有机肥方法，但因烟草秸秆含有大量烟碱、又带有大量有害病菌和病毒，这种方法没有优选选微生物菌种，效果不好。常用的发酵细菌不适合在具有大量烟碱物质的条件下生存，不能够进行有效发酵转化，所以现有方法难于解决上述问题。如果能寻找一种耐强烟碱高温微生物，具有在大量烟碱物质的条件下生存的发酵细菌，进行固态发酵，将废弃烟草秸秆转化成一种安全的生物有机肥，部分替代化学复合肥，回填到烟田。把烟草生产中的病虫害、土壤退化、环境保护、资源利用和烟叶质量问题一并考虑，并加以利用。这样，大大地有利于改善环境。 

发明内容

本发明的目的是提出一种能够在高温重烟碱条件下生存的固态发酵菌种的制备方法。将该耐温耐烟碱的固态发酵菌种经培养和扩繁后，加入到废弃的烟草秸秆混合物中，在自然条件下进行固态发酵，将烟草秸秆废弃物转化为烟草秸秆生物有机肥。 

具体步骤为： 

1、菌株分离筛选：从不同地区烟田的烟草秸秆中，分别取样加入到含有烟碱的葡萄糖、蛋白胨，酵母膏，无机盐的液体培养基中，在50～60℃高温下，培养48小时。将培养液稀释，涂布于含烟碱的蛋白胨，酵母膏的琼脂培养皿中，在25～35℃下，培养24～36小时。挑取单菌落，分别并同时接种到蛋白胨、酵母膏、无机盐的同一编号的液体或固体培养基中，在30℃下，培养24～30小时。提取离心上清培养液，加入链霉素、青霉素和羧甲基纤维素，在50℃下，保温18小时，测定还原糖含量，分离筛选出S₄菌株。 

2、菌株分类鉴定及保藏 

根据伯捷氏手册(第七版)和16SrRNA基因顺序测定对S₄进行菌株的分类鉴定。 

S₄菌：根据S₄菌的菌落形态，细胞形态，生理生化试验和16SrRNA基因序列测定结果，S₄菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens S₄）。 

该菌株于2010年9月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，名称为解淀粉芽孢杆菌S₄(Bacillus amyloliquefaciens S₄），保藏号：CCTCC NO.M2010249），地址：中国.武汉.武汉大学。 

该菌株的菌学特性。菌落粗糙，不透明，扩张，微带黄色，细胞直径＜1μm，杆状，着色均匀，无夹膜，运动，革氏染色呈阳性；形成芽孢，芽孢椭圆形，中生不膨大，无伴孢晶体，接触酶和氧化酶呈阳性，VP试验呈阳性，甲基红试验呈阳性，厌氧生长，可利用葡萄糖，木糖，甘露糖，L—阿拉伯糖，并产酸，水解淀粉，分解酪素；不能利用乳糖，柠檬酸盐，硝酸盐还原试验均为阳性；50℃下生长，7%NaCI下生长，PH5.7生长，VPPH＜6阳性，VPPH＞7阴性。 

该菌能在烟碱存在的条件下生长。 

3、种子培养。以S₄菌作为菌种，在种子三角瓶或发酵罐中加入培养基MD， 其成分和比例如表1。 

表1菌株液体培养基 

种子培养条件：培养基灭菌后接入斜面母种，在28～30℃下，振荡培养16～22小时； 

4、扩繁培养，在发酵罐中加入培养基MD，灭菌后按照发酵罐培养基的3～8%体积比接入上述培养物混合后作种子，扩繁培养条件：罐压为0.4～0.6Mpa，罐温为28～30℃，空气流量为0.3～0.6(v/v/min)，搅拌器转速为200rpm，扩繁培养18～24小时,当培养液的OD值为OD600nm下降0.02时终止发酵； 

5、产品培养，在大型发酵罐中加入培养基MD，灭菌后按照发酵罐培养基的3～8%体积比接入扩繁培养的培养物作液体种子，产品培养条件：罐压为0.4～0.6Mpa，罐温为28～30℃，空气流量为0.3～0.6(v/v/min)，搅拌器转速为140～200rpm，产品培养18～24小时；当培养液的OD值为OD600nm下降0.02时终止发酵； 

6、将上述发酵培养物经膜滤浓缩1～8倍，检测得液态菌剂；或将上述发酵培养物经膜滤浓缩1～8倍后，加入分散剂，进一步干燥得固态菌剂产品。 

通过农业和烟草大田试验表明，利用本发明S₄菌为生物发酵菌种，在烟草秸秆上进行发酵生产的烟草秸秆生物有机肥，通过部分替代化学复合肥使用，可以增加烤烟和白肋烟的产量和产值，改善烟叶的内在质量。 

本发明的菌种可以单独使用，也可以与分案申请的D₁菌联合使用，联合使用的比例为：D₁菌：S₄菌=1～4:1 

本发明具有如下优点 

A、本发明选育的菌种S₄菌，能够适合于烟草秸秆固态发酵，将其加入搅拌到烟草秸秆中，能够对其进行生物发酵，转变为生物有机肥。 

B、本发明找到了S₄菌的制备方法，并优化了它的生产条件，为烟草秸秆生物有机肥菌剂和烟草生物有机肥的工业化生产奠定了基础。 

C、由S₄菌为基础，利用烟草秸秆，可以生产出适合烟草生产的生物有机肥，其作用能够增加烟叶产量、增加烟叶产值、改善烟叶评吸质量，以及具有潜在的改善烟草生产病虫害现象、改良土壤结构和减少环境污染作用。 

D、本发明为废弃烟草秸秆综合利用给出了一条技术路线。 

具体实施方式

实施例1： 

菌种培养：取上述S₄菌管1支和分案申请的D₁菌管1支，接入盛有培养基的250ml种子瓶中，所述培养基其组成为：葡萄糖1%，蛋白胨0.8%，酵母膏0.5%，氯化钠0.4%，其余为水。将PH调至7.8。 

在28±1℃和振荡条件下，把250ml种子瓶培养20小时，将S₄菌液按照6%体积比种量，再接入1000ml发酵瓶中；在28±1℃和振荡条件下，把1000ml发酵瓶培养24小时，测定OD600nm值，得到发酵菌剂。 

实施例2： 

菌种培养：取上述S₄菌管1支和分案申请的D₁菌管3支，分别接入盛有培养基的250ml种子瓶中，所述培养基其组成为：葡萄糖0.8%，蛋白胨0.6%，酵母膏0.3%，氯化钠0.2%，KH₂PO₄0.1%，其余为水。将PH调至6.7。 

在30±1℃和振荡条件下，把250ml种子瓶培养18小时，然后在1000ml发酵瓶中分别按照2%体积比种量接入D₁菌液以及2.5%体积比种量接入S₄菌液；在33±1℃和振荡条件下，把1000ml发酵瓶培养18小时，测定OD600nm值，得到发酵菌剂。 

实施例3： 

菌种培养：取上述S₄菌管1支和分案申请的D₁菌管4支，分别接入盛有培养基的500ml种子瓶中，所述培养基其组成为：葡萄糖0.85%，蛋白胨0.7%，酵母膏0.4%，氯化钠0.3%，KH₂PO₄0.2%，其余为水。将PH调至7.5。 

在35±1℃和振荡条件下，把500ml种子瓶培养16小时，将D₁菌液和S₄菌液混 合后，按照5%体积比种量，再接入100L自动发酵罐进行扩大培养，控制发酵罐压力0.5mpa，罐温28℃，通气量0.4(v/v/min)，搅拌速度200rpm，培养时间18小时，得到发酵菌液。 

将上述发酵培养物经膜滤浓缩4倍，检测得液态菌剂。 

实施例4： 

菌种培养：取上述S₄菌管2支和分案申请的D₁菌管3支，分别接入盛有培养基的500ml种子瓶中，所述培养基其组成为：葡萄糖0.7%，蛋白胨0.8%，酵母膏0.4%，氯化钠       0.4%，KH₂PO₄0.1%，其余为水。将PH调至7.2。在32±1℃和振荡条件下，把500ml种子瓶培养18小时。 

菌种扩繁培养：在发酵罐中加入培养基MD，灭菌后按照发酵罐培养基的8%体积比接入上述培养物混合后作种子，扩繁培养条件：罐压为0.5Mpa，罐温为28℃，空气流量为0.4(v/v/min)，搅拌器转速为200rpm，扩繁培养18小时,当培养液的OD值为OD600nm下降0.02nm时终止发酵； 

产品培养，在大型发酵罐中加入培养基，灭菌后按照发酵罐培养基的6%体积比接入扩繁培养的培养物作液体种子，产品培养条件：罐压为0.4Mpa，罐温为30℃，空气流量为0.6(v/v/min)，搅拌器转速为170rpm，产品培养20小时；当培养液的OD值为OD600nm下降0.02nm时终止发酵； 

将上述发酵培养物经膜滤浓缩8倍后，加入分散剂，进一步干燥得固态菌剂产品。 

Claims (1)

1. 一种生物有机肥发酵菌种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens )S₄，其保藏编号为：CCTCC No.M 2010249。