CN110669704B - 一种高效复合溶磷菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属微生物技术领域，具体涉及一种高效复合溶磷菌剂及其制备方法和应用，其特征在于由溶磷菌1416X3、溶磷菌LJ68和溶磷菌1616X1混合发酵而成，所述溶磷菌1416X3的分类命名为假单胞菌（Pseudomonas sp.），菌种保藏号为CGMCC No.17557，所述溶磷菌LJ68的分类命名为肠杆菌（Enterobacter sp.），菌种保藏号为CGMCC No.17558，所述溶磷菌1616X1的分类命名为假单胞菌（Pseudomonas sp.），菌种保藏号为CGMCC No.17556。所述菌株均为自主分离自土壤并筛选而得。该复合溶磷菌剂，溶磷能力强，能够较好提高土壤磷的溶出效率，有益于提高农作物土壤肥力，改良土壤活性。

Description

一种高效复合溶磷菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高效复合溶磷菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
磷作为生物大分子物质的重要组成成分之一，在农作物生长过程中，是一种非常重要的营养物质。但土壤中95%左右的磷，以作物不可利用的无效磷状态存在，使土壤缺磷在世界范围内存在，磷供给不足已成为世界农业生产中最重要的限制因素之一，我国70%以上的耕地土壤缺乏有效磷。
施加外源磷肥能够一定程度缓解土壤缺磷的局面，提高作物产量，但化学磷肥进入土壤后，会部分形成难溶性磷酸盐而被固定，难以被作物充分利用，且易造成土壤板结、水体污染等环境问题。溶磷微生物能够将不溶性的磷转化为可溶性有效磷，能够用以开发土壤中被固定的磷素，有效提升土壤磷的转化和利用效率，调整土壤微生态，改善土壤质量，促进作物生长并有力保护生态环境，对可持续农业发展具有非常重要的意义。
另一方面，自然界微生物是以种群协作的形式天然存在，混菌的共育更能体现其生存天性，基于单株高效溶磷菌的复合溶磷菌剂的研制和使用，是未来微生物绿色菌肥发展的方向之一。
发明内容
本发明的目的正是基于上述现有技术状况，提供一种基于自主分离筛选的高效溶磷细菌复配而成的复合溶磷菌剂。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种高效复合溶磷菌剂，由假单胞菌（Pseudomonassp.）1416X3、肠杆菌（Enterobactersp.）LJ68、假单胞菌（Pseudomonassp.）1616X1混合发酵制成：
三株溶磷细菌菌株，假单胞菌（Pseudomonassp.）1416X3、肠杆菌（Enterobactersp.）LJ68和假单胞菌（Pseudomonas sp.）1616X1，均为自主分离筛选获得，并于2019年4月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号分别为CGMCC No. 17557、CGMCC No. 17558和CGMCCNo. 17556。
本发明所述菌株形态特征：溶磷菌1416X3菌落呈圆形、黄色，细胞杆状，革兰氏染色阴性；溶磷菌LJ68菌落呈圆形、白色，细胞杆状，革兰氏染色阴性；溶磷菌1616X1菌落呈圆形、奶酪色，细胞杆状，革兰氏染色阴性。
本发明溶磷菌剂为复合菌剂，其制备方法为：溶磷菌1416X3、溶磷菌LJ68、溶磷菌1616X1，分别以LB培养基培养至对数生长期，将培养好的菌悬液，按照1:1:2的体积比例复配，接种入无机磷发酵培养基，培养基初始pH 7.0-7.2，接种量为5-10%（v/v），培养温度28-32℃，时间24-36h，灌装即可。
本发明复合溶磷菌剂，能够提高土壤无机磷溶出效率，使可溶性有效磷含量提升55%。
本发明的有益效果：使用本发明生产的高效溶磷复合菌剂，相比于单株溶磷菌，溶磷能力更强，更符合自然环境中多菌共存的生长状况，能够促进菌株的相互协作和稳定性；具有生产使用成本低、使用方便的特点，能够有效提高土壤磷的溶出效率，对于改善土壤肥力、提高农作物产量、减少环境污染、发展可持续生态农业等具有重要的意义。
附图说明：
图1：复合溶磷菌剂对土壤溶磷效率的提高。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实例来进一步说明本发明，但不限于下列实例。
实施例1：溶磷菌剂的复配
将保藏的溶磷菌1416X3、LJ68和1616X1，分别接种于LB固体培养基活化后，新鲜菌体分别接种于LB液体培养基中，28℃、150 rpm 振荡培养24 h。按照不同的体积比例将培养好的溶磷菌1416X3、LJ68和1616X1菌液混合后，按照5%的总体积，接入无机磷液体培养基，温度28℃，150 rpm，振荡培养2 d，使菌体总含量达到108CFU/mL以上。并设置不接菌处理为对照，每个处理重复3次。发酵结束后，10000 rpm离心10 min，取上清液，用钼锑抗比色法测定培养液中有效磷的含量。结果表明（表1），溶磷菌1416X3、LJ68和1616X1按照1:1:2的体积比例复配后，溶磷菌剂的解磷能力最高，为1190mg/L。
其中，LB培养基组成为：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，水1 L，pH7.0-7.2，固体培养基加15 g琼脂。无机磷发酵培养基（NBRIP）成分为：葡萄糖10 g，KCl 0.2g，(NH4)2SO40.1 g，MgCl2·6H2O 5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，Ca3(PO4)25 g（单独灭菌，按比例加入灭过菌的培养基中），水1 L，pH 7.0-7.2。
表1 不同组合的溶磷菌剂的解磷能力
组合 可溶性磷含量（mg/L）
LJ68 650
1416X3 741
1616X1 726
LJ68: 1416X3=1:1 1113
LJ68: 1616X1=1:1 895
1416X3: 1616X1=1:1 914
LJ68: 1416X3: 1616X1=1:1:1 995
LJ68: 1416X3: 1616X1=2:1:1 1089
LJ68: 1416 X3: 1616X1=1:2:1 1104
LJ68: 1416 X3: 1616X1=1:1:2 1190
实施例2：溶磷菌剂的生产
将冰箱中保藏的溶磷菌1416X3、溶磷菌LJ68和溶磷菌1616X1菌种，分别接种于LB固体培养基活化后，新鲜菌体分别接种于LB液体培养基中，28℃、150 rpm 振荡培养24 h，各自培养好的1416X3、LJ68和1616X1菌液，按照1:1:2的体积比例混合后，使菌体总含量达到108CFU/mL以上。按照5%的体积比例，接种入无机磷发酵培养基，温度28℃，发酵时间24h。发酵结束后，培养液包装成菌剂。
实施例3：溶磷菌剂对土壤磷的溶出实验
按照最佳溶磷细菌组合的比例，即1416X3、LJ68和1616X1菌株的种子液以体积比为1:1:2复配，接种于100 mL土壤悬液，接菌总量为2 mL，于28℃、150 rpm/min振荡培养7d，以接入已灭菌种子液的体系作为空白对照，每个处理均设置重复，每24 h取菌液，10000rpm离心10 min，取上清液，用钼锑抗比色法测定有效磷的含量，结果表明（如图1所示），与没有溶磷菌作用的空白对照相比，溶磷菌剂对土壤磷的溶出作用明显，其上清液中磷浓度最大为0.9 mg/L。

Claims (4)

1.一种高效复合溶磷菌剂，其特征在于，由假单胞菌（Pseudomonas sp.）1416X3、肠杆菌（Enterobacter sp.）LJ68、假单胞菌（Pseudomonas sp.）1616X1混合发酵制成：
所述假单胞菌（Pseudomonas sp.）1416X3，于2019年4月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为 CGMCC No. 17557；
所述肠杆菌（Enterobacter sp.）LJ68，于2019年4月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为 CGMCC No. 17558；
所述假单胞菌（Pseudomonas sp.）1616X1，于2019年4月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为 CGMCC No. 17556；
所述复合溶磷菌剂中假单胞菌（Pseudomonas sp.）1416X3、肠杆菌（Enterobacter sp.）LJ68、假单胞菌（Pseudomonas sp.）1616X1的菌体量体积之比为1:1:2。
2.如权利要求1所述的一种高效复合溶磷菌剂，其特征在于，所述复合溶磷菌剂中复合菌的菌体总含量在108 CFU/mL以上。
3.一种如权利要求1所述的高效复合溶磷菌剂的制备方法，其特征在于，是通过以下方法制得：
（1）种子培养：将所述假单胞菌（Pseudomonas sp.）1416X3、肠杆菌（Enterobacter sp.）LJ68、假单胞菌（Pseudomonas sp.）1616X1的新鲜菌种，分别接入LB液体培养基中，摇瓶培养；培养条件为温度28-30℃、转速150-180 rpm，培养时间24-36 h；将培养好的假单胞菌（Pseudomonas sp.）1416X3、肠杆菌（Enterobacter sp.）LJ68、假单胞菌（Pseudomonas sp.）1616X1，按照1:1:2的体积比例混合，即为种子液；
（2）发酵培养：将上述种子液，按照5-10%的体积比例，接种入无机磷发酵培养基，初始pH 7.0-7.2，温度28-32℃，发酵时间24-36 h；
（3）发酵结束后，包装成菌剂。
4.一种如权利要求3所述的高效复合溶磷菌剂的应用，其特征在于，将该复合溶磷菌剂应用于农田中，能提高土壤磷的溶出效率。
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