CN108546658A - 一株溶磷菌及其与dehp降解菌复配菌剂和应用 - Google Patents

一株溶磷菌及其与dehp降解菌复配菌剂和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一株溶磷菌及其与DEHP降解菌复配菌剂和应用。所述菌株为Pseudomonas sp.YLYP29，于2017年06月28日保藏于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2017391。本发明还提供一种复配菌剂，由溶磷菌YLYP29和DEHP降解菌XB组成，该复配菌剂协同性较好，培养方法简便易行，适应能力强，兼具溶磷和DEHP降解功能，具有良好的应用潜力，既可解决土壤磷素缺乏的问题，又可去除土壤中DEHP污染物，对于改善土壤营养状态，提升土壤生态肥力，修复DEHP污染土壤，进而保障农产品质量和产量，对于实现农田土壤边生产边修复具有重要作用。

Description

一株溶磷菌及其与DEHP降解菌复配菌剂和应用
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一株溶磷菌及其与DEHP降解菌复配菌剂和应用。
背景技术
磷素是土壤中重要的肥料之一，促进植物生长发育。在不同的磷化合物形式中，只有可溶性磷素才能被植物吸收利用，但土壤中有95％的磷素以难溶状态存在。我国约有2/3的耕地处于磷素缺乏状态，为保证农产品增产增收，在农业生产中施用大量化学肥料，但当季作物对磷肥的利用率低于25％，很大一部分被土壤中的Ca2+、Fe3+、Al3+等阳离子固定，形成难溶性磷酸盐，并诱发土壤微量元素缺乏、养分失衡、土壤板结等问题。还有部分可溶性磷素被雨水冲刷进入水体中造成环境污染。溶磷菌在土壤中磷素的生物地化循环中起着重要作用，将难溶磷转化为植物可以直接吸收利用的有效磷。因此，通过溶磷菌调动土壤磷库资源，提高土壤磷素利用率，减少化学磷肥的施用量，被认为是经济、高效、环保的利用土壤难溶磷的生物措施，对于促进农业生产可持续发展具有十分重要的意义。
另一方面，由于工业“三废”大量排放以及化肥、农药、农膜等农资产品的不合理使用，导致农田土壤邻苯二甲酸酯(PAEs)、多环芳烃(PAHs)等有机污染物污染。大量调查表明，我国农业土壤普遍检出PAEs，土壤中PAEs含量达到mg/kg数量级。污染土壤中的PAEs被农作物吸收累积，严重影响农产品质量安全。土壤中PAEs不仅对土壤生态系统存在潜在危害，而且通过食物链传递进入人体，可在人体内积累。PAEs等有机污染物属于环境内分泌干扰物，具有生殖发育毒性、肝脏毒性和“三致”作用(致癌、致畸、致突变)，居民日常食用含PAEs等有机污染物的农产品导致长期低剂量暴露，严重危及人体健康。利用特异性功能微生物降解土壤中PAEs有机污染物进行有效去除，可达到净化土壤的目的，具有针对性强、高效快捷、成本低廉等优势。
因此，面对我国农田土壤普遍磷素缺乏以及PAEs污染现状，研究开发具有溶磷和PAEs降解功能的复合菌剂就显得尤为重要。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种溶磷菌。
本发明的另一目的在于提供一种复配菌剂。
本发明的再一目的在于提供上述溶磷菌、复配菌剂的应用。
本发明提供的溶磷菌及其复配菌剂既可以解决土壤普遍磷素缺乏的问题，又可以修复土壤DEHP污染，促进农业可持续发展。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一株溶磷菌，命名为Pseudomonas sp.YLYP29，是从污水处理厂的活性污泥中分离纯化得到的。
所述的溶磷菌为Pseudomonas sp.YLYP29，其保藏信息：保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2017年06月28日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2017391。
所述的Pseudomonas sp.YLYP29菌体培养特征和菌落特征：该菌为革兰氏阴性菌，扫描电子显微镜下呈短杆状，菌体平均长度0.8～1.0μm，平均宽度0.2～0.3μm(图1)；在LB平板上30℃培养48h，菌落呈黄白色，湿润，呈粘液状，表面光滑不透明，边缘整齐(图2)；所述菌株YLYP29的生理生化鉴定试验结果如表1所示，该菌的最适生长条件为：温度25～35℃，pH为6.0～8.0。
本发明还提供上述Pseudomonas sp.YLYP29在溶解难溶磷酸盐中的应用。
所述的难溶磷酸盐为磷酸钙、磷酸铝或磷酸铁。
优选的，所述的难溶磷酸盐为磷酸钙。
所述的Pseudomonas sp.YLYP29在NBRIP培养基中，溶解难溶性磷酸盐至可溶性磷含量达106.3±4.6mg/L～514.1±7.2mg/L。
本发明还提供一种复配菌剂，包括Pseudomonas sp.YLYP29和Rhodococcuspyridinivorans XB。
本课题组前期研究分离筛选的Rhodococcus pyridinivorans XB能够有效降低土壤中邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)污染，并降低玉米对DEHP的吸收累积。该菌种的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期：2016年09月28日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCC NO：60054。
所述的Pseudomonas sp.YLYP29和Rhodococcus pyridinivorans XB制成浓度为108～1010cfu/mL的菌悬液；
所述的Pseudomonas sp.YLYP29和Rhodococcus pyridinivorans XB按照体积比2～3：3～5进行混合；优选按照体积比2：3进行混合。
所述的复配菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将Pseudomonas sp.YLYP29和Rhodococcus pyridinivorans XB分别接种于LB液体培养基中，于28～30℃条件下活化12～18h；
(2)挑取活化好的2种单菌分别接种于LB液体培养基中，分别培养至细菌数为108～1010CFU/mL；
(3)将2种单菌按照2～3：3～5的体积比均匀混合，即得多功能复配菌剂。
所述的复配菌剂在溶磷和/或降解DEHP中的应用。
所述的复配菌剂在NBRIP培养基中，可溶性磷含量达543.3～581.4mg/L。
所述的复配菌剂在含DEHP的MSM培养基中，对DEHP的降解能力显著提高，Pseudomonas sp.YLYP29培养液中DEHP不发生降解，Rhodococcus pyridinivorans XB对DEHP的降解率为80.5％～91.9％，复配菌剂对DEHP降解率为93.6％～100％。因此，复配菌剂对DEHP的降解能力显著提高，同样实现了1+1>2菌剂复配的效果。
所述的复配菌剂在改良土壤质量中的应用。
优选的，将复配菌剂接加入土壤中，并搅拌均匀，可以使土壤中有效磷含量增加，并同时降解土壤中的DEHP。
将600g土壤加入500mL的烧杯中，并用锡箔纸遮光处理，向土壤中分别添加菌株YLYP29、XB和复配菌剂60mL，均充分混匀。将土壤含水量调整至田间持水量30％，30℃恒温避光培养15d，以不接种任何菌剂土壤为对照，每个处理设置三个重复。测定不同处理土壤中有效磷含量。结果显示，对照土壤中有效磷含量39.8mg/kg，接种单菌Pseudomonassp.YLYP29土壤中有效磷含量53.7～62.1mg/kg，接种单菌Rhodococcus pyridinivoransXB土壤中有效磷含量41.7～45.2mg/kg，接种复配菌剂土壤中有效磷含量为69.4～86.2mg/kg。
设置DEHP浓度为20mg/kg。将600g土壤加入500mL的烧杯中，加入DEHP，搅拌均匀，并用锡箔纸遮光处理，老化一周后，向土壤中分别添加菌株YLYP29、XB、复配菌剂60mL，搅拌均匀。将土壤含水量调整至田间持水量的30％，30℃恒温培养10d，以不添加任何菌剂的土壤为空白对照，上述每个处理设置3个重复。测定土壤DEHP的残留量，结果显示，空白对照中土壤中DEHP降解率27.1％，接种单菌Pseudomonas sp.YLYP29土壤中DEHP降解率30.2～32.9％，接种单菌Rhodococcus pyridinivorans XB土壤中DEHP降解率53.9～65.3％，添加复配菌剂的土壤中DEHP降解率为78.3～100％。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明公开的复配菌剂由溶磷菌Pseudomonas sp.YLYP29和DEHP降解菌Rhodococcus pyridinivorans XB组成，该复配菌剂协同性较好，培养方法简便易行，适应能力强，兼具溶磷和DEHP降解功能，具有良好的应用潜力，既可以解决土壤磷素缺乏的问题，又可以去除土壤中DEHP污染物，对于改善土壤营养状态，提升土壤生态肥力，修复DEHP污染土壤，进而保障农产品质量和产量，对于实现农田土壤边生产边修复具有重要作用。
附图说明
图1是假单胞菌Pseudomonas sp.YLYP29细胞形态。
图2是假单胞菌Pseudomonas sp.YLYP29菌落形态。
图3是假单胞菌Pseudomonas sp.YLYP29系统发育进化树。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所用的菌株Rhodococcus pyridinivorans XB的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期：2016年09月28日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCC NO：60054。
无机盐培养基(MSM，g·L-1)：K2HPO4 5.8，KH2PO4 4.5，(NH4)2SO4 2.0，MgCl2 0.16，CaCl2 0.02，Na2MoO4·2H2O 0.0024，FeCl3 0.0018，MnCl2·2H2O0.0015，pH 7.5。在MSM培养基中添加DEHP初始浓度为400mg L-1，作为唯一碳源。
实施例1
溶磷菌的分离筛选：
(1)样品采集：采集污水处理厂的活性污泥于50mL无菌离心管中，置于洁净冰盒。称取1g活性污泥溶解到装有40mL无菌水的50mL离心管中，于振荡器中振荡成均匀(130rpm)，用0.9％无菌生理盐水将样品梯度稀释制成10-1～10-5溶液。
(2)培养基：
蒙金娜(PVK)液体培养基：Ca3(PO4)2 5.0g，蔗糖10.0g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl0.1g，MgSO4·7H2O 0.1g，KCl 0.2g，MnSO4 0.03g，酵母浸膏0.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.2。PVK固体培养基则添加琼脂15g。
磷酸盐生长(NBRIP)培养基：葡萄糖10.0g，Ca3(PO4)2 5.0g，MgCl2·6H2O5.0g，MgSO4·7H2O 0.25g，KCl 0.2g，(NH4)2SO4 0.1g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。
LB液体培养基：酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。固体LB培养基则添加1.5％琼脂。所有培养基于121℃灭菌20min。
(3)溶磷菌筛选：分别吸取不同稀释倍数的稀释液0.1mL，均匀涂布于PVK固体培养基上，置于30℃倒置培养5天，挑选长势良好、解磷圈显著的菌落，用划线法再次转接至PVK固体培养基上，重复2～3次，最终纯化获得一株溶磷能力较强的溶磷菌，其编号为YLYP29。将其转接至LB培养基试管斜面4℃冰箱保藏，用于后续实验。
实施例2
溶磷菌株YLYP29鉴定：
形态特征和生理生化的检测依据和方法为细菌鉴定程序MS(i)/C005-C01。形态鉴定：该菌为革兰氏阴性细菌。扫描电子显微镜下呈短杆状，菌体平均长度0.8～1.0μm，平均宽度0.2～0.3μm(图1)；在LB固体培养基上30℃培养48h，菌落呈黄白色，湿润，呈粘液状，表面光滑不透明，边缘整齐(图2)；所述菌株YLYP29的生理生化鉴定试验结果如表1所示，该菌的最适生长条件为：温度25～35℃，pH为6.0～8.0。
生理生化特征鉴定：生理生化实验结果见表1。
表1假单胞菌(Pseudomonas sp.)YLYP29的生理生化特征
+：阳性；-：阴性
分子生物学鉴定：采用细菌总DNA提取试剂盒提取该菌总DNA，采用细菌16S rDNA通用引物F27和R1492对该菌基因组进行PCR扩增和测序(George et al.,2013)，序列如SEQID NO：1所示。将测序结果与GenBank中已报道的16S rDNA序列进行同源性比对，并进行系统发育进化树分析，该菌株与Pseudomonas sp.3-16(KX378954.1)同源性最高，同源率达99％，构建的系统发育进化树见图3。因此，根据所述菌株的形态特征、生理生化特征以及系统进化分析，将菌株YLYP29鉴定为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。菌种命名为Pseudomonassp.YLYP29。
所述的Pseudomonas sp.YLYP29的保藏信息：保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2017年06月28日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2017391。
实施例3
菌株Pseudomonas sp.YLYP29溶磷能力测定：
(1)菌悬液制备：用接种环挑取少量保藏于试管斜面的YLYP29菌种于50mL LB液体培养基中，于30℃和130rpm条件下，培养10h，取40mL培养液于50mL离心管中，于4℃和5000rpm条件下离心3min，收集菌体，用0.9％无菌生理盐水洗涤菌体3次，并用生理盐水制备菌密度为108cfu/mL的菌悬液。
(2)难溶性磷酸盐预处理：称取20.0g分析纯磷酸铝、磷酸铁或磷酸钙于大烧杯中，用2L超纯水超声溶解，每隔30min弃去上层浑浊液，保留烧杯底部不溶解的磷酸铝、磷酸铁或磷酸钙，重复超声洗涤2～3次至上层溶液澄清，并收集沉淀在烧杯底部的磷酸铝、磷酸铁或磷酸钙，置于60℃烘箱烘干，碾磨后，装入棕色试剂瓶中，置于干燥器中备用。
(3)NBRIP培养基配制：
以难溶磷酸铝、磷酸铁或磷酸钙为唯一磷源配制培养基，用NaOH溶液调节pH值至7.0，于121℃灭菌20min。NBRIP培养基配方参照实施例1步骤(2)所示。
(4)接种和培养：将上述制备好的菌悬液(108cfu/mL)按照培养体系的4％(V：V)的接种量，接种到NBRIP培养基。于30℃和130rpm条件下培养7d。
(5)可溶性磷酸盐的测定：培养7d后，取培养液2mL于的离心管，于4℃和5000rpm条件下离心10min。取0.2mL上清液稀释至10mL，用钼锑抗分光光度法测定可溶性磷酸盐含量(HJ 704-2014土壤有效磷的测定碳酸氢钠浸提-钼锑抗分光光度法)。以121℃灭菌20min的菌悬液作为对照。NBRIP培养基中，溶解磷酸铝，获得可溶性磷含量达到106.3±4.6mg/L，溶解磷酸铁，获得可溶性磷含量达到230.8±2.5mg/L；溶解难溶性磷酸钙，获得可溶性磷含量达514.1±7.2mg/L。为了排除高温高压灭菌对培养液中可溶性磷酸盐含量的影响，我们测定了灭菌前后培养液中的可容性磷酸盐的含量，结果表明高温高压灭菌对可溶性磷酸盐含量没有影响。
实施例4
复配菌剂溶磷能力分析：
(1)将Pseudomonas sp.YLYP29和Rhodococcus pyridinivorans XB分别接种于LB液体培养基中，于30℃恒温活化12h；
(2)挑取活化好的2种单菌分别接种于LB液体培养基中，分别培养至细菌数为109cfu/mL；
(3)将2种单菌按照2：3的体积比均匀混合，即得多功能复配菌剂。
(4)将等菌体数量的复配菌剂、Pseudomonas sp.YLYP29和Rhodococcuspyridinivorans XB分别接种到NBRIP培养基(唯一磷源采用磷酸钙)中，于30℃和130rpm条件下的无菌摇床中培养7天，每个处理设置3个重复。
(5)可溶性磷酸盐的测定：培养7天后，取培养液2mL于离心管，在4℃，5000rpm条件下离心10min，取0.2mL上清液稀释至10mL，用钼锑抗分光光度法测定可溶性磷酸盐的含量。结果显示，Pseudomonas sp.YLYP29培养液中可溶性含量为528.4mg/L，Rhodococcuspyridinivorans XB培养液中可溶性磷含量19.6mg/L，而复配菌剂培养液中可溶性磷含量558.5mg/L。说明复配菌剂溶磷能力显著提高，达到了1+1>2菌剂复配的效果。
实施例5
复配菌剂溶磷能力分析：
(1)将Pseudomonas sp.YLYP29和Rhodococcus pyridinivorans XB分别接种于LB液体培养基中，于30℃恒温活化18h；
(2)挑取活化好的2种单菌分别接种于LB液体培养基中，分别培养至细菌数为1010cfu/mL；
(3)将2种单菌按照3：5的体积比均匀混合，即得多功能复配菌剂。
(4)将等菌体数量的复配菌剂、Pseudomonas sp.YLYP29和Rhodococcuspyridinivorans XB分别接种到NBRIP培养基(唯一磷源采用磷酸钙)中，于30℃和130rpm条件下的无菌摇床中培养7天，每个处理设置3个重复。
(5)可溶性磷酸盐的测定：培养7天后，取培养液2mL于离心管，于4℃和5000rpm条件下离心10min，取0.2mL上清液稀释至10mL，用钼锑抗分光光度法测定可溶性磷酸盐含量。结果显示，Pseudomonas sp.YLYP29培养液中可溶性磷含量为534.5mg/L，Rhodococcuspyridinivorans XB培养液中可溶性磷含量20.2mg/L，而复配菌剂培养液中可溶性磷含量581.4mg/L。说明复配菌剂溶磷能力显著提高，达到了1+1>2菌剂复配的效果。
实施例6
复配菌剂溶磷能力分析：
(1)将Pseudomonas sp.YLYP29和Rhodococcus pyridinivorans XB分别接种于LB液体培养基中，于28℃恒温活化12h；
(2)挑取活化好的2种单菌分别接种于LB液体培养基中，分别培养至细菌数为108cfu/mL；
(3)将2种单菌按照3：3的体积比均匀混合，即得多功能复配菌剂。
(4)将等菌体数量的复配菌剂、Pseudomonas sp.YLYP29和Rhodococcuspyridinivorans XB分别接种到NBRIP培养基(唯一磷源采用磷酸钙)中，于30℃和130rpm条件下的无菌摇床中培养7天，每个处理设置3个重复。
(5)可溶性磷酸盐的测定：培养7天后，取培养液于2mL离心管，4℃，5000rpm离心10min，取0.2mL上清液稀释至10mL，用钼锑抗分光光度法测定可溶性磷酸盐的含量。结果显示，Pseudomonas sp.YLYP29培养液中可溶性磷含量为514.1mg/L，Rhodococcuspyridinivorans XB培养液中可溶性磷含量15.7mg/L，而复配菌剂培养液中可溶性磷含量543.3mg/L。说明复配菌剂溶磷能力显著提高，达到了1+1>2菌剂复配的效果。
实施例7
复配菌剂降解DEHP的能力分析：
(1)将Pseudomonas sp.YLYP29和Rhodococcus pyridinivorans XB分别接种于LB液体培养基中，在28℃活化12h；
(2)挑取活化好的2种单菌分别接种于LB液体培养基中，分别培养至细菌数为108cfu/mL；
(3)将2种单菌按照2：3的体积比均匀混合，即得多功能复配菌剂。
(4)将等菌体数量的Pseudomonas sp.YLYP29和Rhodococcus pyridinivorans XB以及复配菌剂分别接入以DEHP(浓度400mg/L)为唯一碳源的MSM培养基内，于30℃，130rpm的无菌摇床中培养3天，同时以未接菌培养基为空白对照，每个处理设置3个重复。
(5)Pseudomonas sp.YLYP29培养基中DEHP不发生降解，Rhodococcuspyridinivorans XB对DEHP的降解率为80.5％，而复配菌剂对DEHP降解率为93.6％。因此，复配菌剂对DEHP的降解能力显著提高，同样实现了1+1>2菌剂复配的效果。
实施例8
复配菌剂降解DEHP的能力分析：
(1)将Pseudomonas sp.YLYP29和Rhodococcus pyridinivorans XB分别接种于LB液体培养基中，30℃活化18h；
(2)挑取活化好的2种单菌分别接种于LB液体培养基中，分别培养至细菌数为1010cfu/mL；
(3)将2种单菌按照2：5的体积比均匀混合，即得多功能复配菌剂。
(4)将等菌体数量的Pseudomonas sp.YLYP29和Rhodococcus pyridinivorans XB以及复配菌剂分别接入以DEHP(浓度400mg/L)为唯一碳源的MSM培养基内，于30℃，130rpm培养3天，同时以未接菌培养基为空白对照，每个处理设置3个重复。
(5)Pseudomonas sp.YLYP29培养基中DEHP不发生降解，Rhodococcuspyridinivorans XB对DEHP的降解率为91.9％，而复配菌剂将DEHP完全降解。因此，复配菌剂对DEHP的降解能力显著提高，同样实现了1+1>2菌剂复配的效果。
实施例9
复配菌剂应用于磷素缺乏土壤改良：
(1)供试土壤：农田水稻土，pH 5.62，有机质17.40g/kg，总氮0.79g/kg，总磷0.66g/kg，风干粉碎后过60目。
(2)将Pseudomonas sp.YLYP29和Rhodococcus pyridinivorans XB分别接种于LB液体培养基中，28℃活化12h；
(3)挑取活化好的2种单菌分别接种于LB液体培养基中，分别培养至细菌数为108cfu/mL；
(4)将2种单菌按照2：3的体积比均匀混合，即得多功能复配菌剂。
(5)土壤中有效磷含量测定：
将600g土壤加入500mL的烧杯中，并用锡箔纸遮光处理，向土壤中分别添加菌株YLYP29、XB、复配菌剂60mL，均充分混匀。将土壤含水量调整至田间持水量的30％，30℃恒温培养10d，以不接种任何菌剂的土壤为对照，每个处理设置三个重复。测定不同处理土壤中有效磷含量，结果显示，对照中有效磷含量39.8mg/kg，接种单菌Pseudomonas sp.YLYP29土壤中有效磷含量53.7mg/kg，接种单菌Rhodococcus pyridinivorans XB土壤中有效磷含量41.7mg/kg，接种复配菌剂土壤中有效磷含量为69.4mg/kg。
实施例10
复配菌剂应用于磷素缺乏土壤改良：
(1)供试土壤：农田水稻土，pH 5.62，有机质17.40g/kg，总氮0.79g/kg，总磷0.66g/kg，风干粉碎后过60目。
(2)将Pseudomonas sp.YLYP29和Rhodococcus pyridinivorans XB分别接种于LB液体培养基中，30℃活化18h；
(3)挑取活化好的2种单菌分别接种于LB液体培养基中，分别培养至细菌数为109cfu/mL；
(4)将2种单菌按照3：3的体积比均匀混合，即得多功能复配菌剂。
(5)土壤中有效磷含量测定：
将600g土壤加入500mL的烧杯中，并用锡箔纸遮光处理，向土壤中分别添加菌株YLYP29、XB、复配菌剂60mL，均充分混匀。将土壤含水量调整至田间持水量的30％，30℃恒温培养10d，以不接种任何菌剂的土壤为对照，每个处理设置三个重复。测定不同处理土壤中有效磷含量，结果显示，对照中有效磷含量39.8mg/kg，接种单菌Pseudomonas sp.YLYP29土壤中有效磷含量60.6mg/kg，接种单菌Rhodococcus pyridinivorans XB土壤中有效磷含量44.3mg/kg，接种复配菌剂土壤中有效磷含量为80.6mg/kg。
实施例11
复配菌剂应用于磷素缺乏土壤改良：
(1)供试土壤：农田水稻土，pH 5.62，有机质17.40g/kg，总氮0.79g/kg，总磷0.66g/kg，风干粉碎后过60目。
(2)将Pseudomonas sp.YLYP29和Rhodococcus pyridinivorans XB分别接种于LB液体培养基中，30℃活化18h；
(3)挑取活化好的2种单菌分别接种于LB液体培养基中，分别培养至细菌数为1010cfu/mL；
(4)将2种单菌按照3：2的体积比均匀混合，即得多功能复配菌剂。
(5)土壤中有效磷含量测定：
将600g土壤加入500mL的烧杯中，并用锡箔纸遮光处理，向土壤中分别添加菌株YLYP29、XB、复配菌剂60mL，均充分混匀。将土壤含水量调整至田间持水量的30％，30℃恒温培养10d，以不接种任何菌剂为对照，每个处理设置三个重复。测定不同处理土壤中有效磷含量，结果显示，对照中有效磷含量39.8mg/kg，接种单菌Pseudomonas sp.YLYP29土壤中有效磷含量62.1mg/kg，接种单菌Rhodococcus pyridinivorans XB土壤中有效磷含量45.2mg/kg，接种复配菌剂土壤中有效磷含量为86.2mg/kg。
实施例12
复配菌剂对DEHP污染土壤修复应用：
(1)供试土壤：农田水稻土，pH 5.62，有机质17.40g/kg，总氮0.79g/kg，总磷0.66g/kg，风干粉碎后过60目。
(2)将Pseudomonas sp.YLYP29和Rhodococcus pyridinivorans XB分别接种于LB液体培养基中，于28℃恒温活化12h；
(3)挑取活化好的2种单菌分别接种于LB液体培养基中，分别培养至细菌数为108cfu/mL；
(4)将2种单菌按照2：3的体积比均匀混合，即得多功能复配菌剂。
(5)复配菌剂DEHP污染土壤修复
设置DEHP浓度为20mg/kg。将600g土壤加入500mL的烧杯中，加入DEHP，搅拌均匀，并用锡箔纸遮光处理，老化一周后，向土壤中分别添加菌株YLYP29、XB、复配菌剂60mL，搅拌均匀。将土壤含水量调整至田间持水量30％，30℃恒温培养10d，以不添加任何菌剂的土壤为空白对照，上述每个处理设置3个重复。测定土壤中DEHP的残留量，结果显示，空白对照中土壤中DEHP降解率27.1％，接种单菌Pseudomonas sp.YLYP29土壤中DEHP降解率30.2％，接种单菌Rhodococcus pyridinivorans XB土壤中DEHP降解率53.9％，添加复配菌剂的土壤中DEHP降解率为78.3％。
实施例13
复配菌剂对DEHP污染土壤修复应用：
(1)供试土壤：农田水稻土，pH 5.62，有机质17.40g/kg，总氮0.79g/kg，总磷0.66g/kg，风干粉碎后过60目。
(2)将Pseudomonas sp.YLYP29和Rhodococcus pyridinivorans XB分别接种于LB液体培养基中，30℃活化18h；
(3)挑取活化好的2种单菌分别接种于LB液体培养基中，分别培养至细菌数为1010cfu/mL；
(4)将2种单菌按照2：5的体积比均匀混合，即得多功能复配菌剂。
(5)复配菌剂DEHP污染土壤修复
设置DEHP浓度为20mg/kg。将600g土壤加入500mL的烧杯中，加入DEHP，搅拌均匀，并用锡箔纸遮光处理，老化一周后，向土壤中分别添加菌株YLYP29、XB、复配菌剂60mL，搅拌均匀。将土壤含水量调整至田间持水量的30％，30℃恒温培养10d，以不添加任何菌剂的土壤为空白对照，上述每个处理设置3个重复。测定土壤中DEHP的残留量，结果显示，空白对照中土壤中DEHP降解率27.1％，接种单菌Pseudomonas sp.YLYP29土壤中DEHP降解率32.9％，接种单菌Rhodococcus pyridinivorans XB土壤中DEHP降解率65.3％，添加复配菌剂的土壤中DEHP降解率为100％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一株溶磷菌及其与DEHP降解菌复配菌剂和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1436
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Pseudomonas sp. YLYP29的16S rDNA序列
<400> 1
tggctggcgc agctaccatg cagtcgagcg gatgagagga gcttgctcct ggattcagcg 60
gcggacgggt gagtaatgcc taggaatctg cctggtagtg ggggacaacg tttcgaaagg 120
aacgctaata ccgcatacgt cctacgggag aaagcagggg accttcgggc cttgcgctat 180
cagatgagcc taggtcggat tagctagttg gtgaggtaat ggctcaccaa ggcgacgatc 240
cgtaactggt ctgagaggat gatcagtcac actggaactg agacacggtc cagactccta 300
cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa tgggcgaaag cctgatccag ccatgccgcg 360
tgtgtgaaga aggtcttcgg attgtaaagc actttaagtt gggaggaagg gttgtagatt 420
aatactctgc aattttgacg ttaccgacag aataagcacc ggctaactct gtgccagcag 480
ccgcggtaat acagagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa gcgcgcgtag 540
gtggtttgtt aagttggatg tgaaatcccc gggctcaacc tgggaactgc atccaaaact 600
ggcaagctag agtatggtag agggtggtgg aatttcctgt gtagcggtga aatgcgtaga 660
tataggaagg aacaccagtg gcgaaggcga ccacctggac tgatactgac actgaggtgc 720
gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgtca 780
actagccgtt gggagccttg agctcttagt ggcgcagcta acgcattaag ttgaccgcct 840
ggggagtacg gccgcaaggt taaaactcaa atgaattgac gggggcccgc acaagcggtg 900
gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggccttga catccaatga 960
actttccaga gatggattgg tgccttcggg aacattgaga caggtgctgc atggctgtcg 1020
tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgtaacg agcgcaaccc ttgtccttag 1080
ttaccagcac gttatggtgg gcactctaag gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt 1140
ggggatgacg tcaagtcatc atggccctta cggcctgggc tacacacgtg ctacaatggt 1200
cggtacagag ggttgccaag ccgcgaggtg gagctaatcc cacaaaaccg atcgtagtcc 1260
ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cgaatcagaa 1320
tgtcgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagtggg 1380
ttgcaccaga agtagctagt ctaaccttcg ggaggacgta ccacgggata aggggc 1436

Claims (10)

1.一株溶磷菌，其特征在于：名称为Pseudomonas sp.YLYP29，于2017年06月28日保藏于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2017391。
2.权利要求1所述的溶磷菌在溶解难溶磷酸盐中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述的难溶磷酸盐为磷酸钙、磷酸铝或磷酸铁。
4.一种复配菌剂，其特征在于包括权利要求1所述的Pseudomonas sp.YLYP29和Rhodococcus pyridinivorans XB；
所述的Rhodococcus pyridinivorans XB，于2016年09月28日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCCNO：60054。
5.根据权利要求4所述的复配菌剂，其特征在于：
所述的Pseudomonas sp.YLYP29和Rhodococcus pyridinivorans XB制成浓度为108～1010cfu/mL的菌悬液。
6.根据权利要求4或5所述的复配菌剂，其特征在于：
所述的Pseudomonas sp.YLYP29和Rhodococcus pyridinivorans XB按照体积比2～3：3～5进行混合。
7.权利要求4～6任一项所述的复配菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将Pseudomonas sp.YLYP29和Rhodococcus pyridinivorans XB分别接种于LB液体培养基中，于28～30℃条件下活化12～18h；
(2)挑取活化好的2种单菌分别接种于LB液体培养基中，分别培养至细菌数为108～1010cfu/mL；
(3)将2种单菌按照2～3：3～5的体积比均匀混合，即得多功能复配菌剂。
8.权利要求4～6任一项所述的复配菌剂在溶磷和/或降解DEHP中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：
所述的复配菌剂在NBRIP培养基中，可溶性磷含量达543.3～581.4mg/L；
所述的复配菌剂在含DEHP的MSM培养基中，对DEHP降解率为93.6％～100％。
10.权利要求4～6任一项所述的复配菌剂在改良土壤质量中的应用。
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