CN114480183A - 阿氏芽孢杆菌hz18-3及其用途 - Google Patents

阿氏芽孢杆菌hz18-3及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18‑3CGMCC NO.23635，其已于2021年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏中心登记入册编号为：CGMCC NO.23635，保藏日期为：2021年10月20日，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明提供的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18‑3培养简单、周期短、无生态毒性、可利用的碳源种类丰富、耐盐性强、可耐受pH范围广，可通过固氮、解磷、产铁载体等促进植物生长发育，产纤维素酶分解纤维素，有利于土壤修复，同时能够有效抑制疮痂链霉菌的生长，抗性良好。

Description

阿氏芽孢杆菌HZ18-3及其用途
技术领域
本发明属于生物工程技术领域。
背景技术
芽孢杆菌广泛存在于土壤环境中，具有较高的环境兼容性和重金属离子吸附性，且可以改善土壤理化性质，因此在重金属污染土壤修复领域的发展前景十分广阔。芽孢杆菌也是常见的植物根际促生菌(PGPR)，芽孢杆菌广泛存在于土壤环境中，具有较高的环境兼容性和重金属离子吸附性，且可以改善土壤理化性质，因此在重金属污染土壤修复领域的发展前景十分广阔。
阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai),简称阿氏芽孢杆菌,分布广泛,在动物肠道、植物根际、深海、高原均有发现,其应用主要有两方面,一是降解或合成某种大分子化合物等,二是与植物共生或者促进植物生长等。有研究发现，阿氏芽孢杆菌耐镉能力极强。它极易在环境中存活、定殖，且具备环境友好、安全无毒等特点，因此在农业生产上得到广泛应用，有效防控了黄瓜枯萎病、香蕉枯萎病、西瓜枯萎病等作物的土传病害。阿氏与合成农药相比，它们的优势包括混合活性分子、无毒性和在淡水和土壤中可繁殖性。因此，基于化肥农药的替代，可适用于马铃薯普通疮痂病的防治。
发明内容
本发明的第一目的是提供一株阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3，其保藏编号为CGMCC NO.23635。
本发明所提供的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.23635，保藏日期为：2021年10月20日，保藏单位简称为CGMCC，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的第二目的是提供阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3在制备防治马铃薯疮痂病菌剂中的应用。
本发明提供的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3，培养简单、无生态毒性、耐盐碱、可利用的碳源种类丰富，能固定空气中的氮气，分解土壤中的难溶性磷，可产生纤维素酶、铁载体等，同时能够有效抑制马铃薯疮痂病病原菌的生长，在马铃薯疮痂病的生物防治和盐碱土地改良中具有非常广泛的应用前景。
附图说明：
图1是阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3筛选结果图。
图2是阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3抑菌结果图。
图3是阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3耐盐结果图。
图4是阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3pH敏感性测定结果图。
图5是阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3解磷、解钾结果图。
图6是阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3产铁载体、产纤维素酶的测定结果图。
图7是阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3马铃薯疮痂病防治效果盆栽结果图。
图8是阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3马铃薯疮痂病防治效果大田结果图。
具体实施方式：
如无特殊说明，下列实施例中待测菌株均指阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)HZ18-3。
如无特殊说明，下列实施例中的活化均指阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3在马铃薯固体培养基上扩大培养三次。
实施例1
菌种的分离与鉴定
1.培养基：
马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose agar,PDA)培养基(g/L)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000m L，pH自然。
2.菌株来源：
阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3于2021年3月5日分离自广东惠州马铃薯土壤。取1g土样放入50ml离心管中，加入10ml无菌水震荡均匀，于37℃、200rpm的摇床上振荡30min，静置至澄清。在超净工作台中将制备好的土壤悬浮液进行梯度稀释，分别取100μL 10-3、10-4、10-5倍稀释液在LB固体培养基上进行涂布，重复3次，37℃培养24h。24h后在超净工作台中挑取形态不同的菌落分别划线纯化，37℃培养24h，重复纯化3次。将得到的纯的单菌落转移到试管斜面培养基中，放入4℃冰箱保存备用。
3.筛选结果：
分离得到如图1所示，菌株分类特性：菌落形态为圆形、乳白色、边缘整齐且透明度差。该菌株为革兰氏阳性菌,细胞形状为杆状,长宽比为3.8,可分解石蕊牛乳产酸,符合芽孢杆菌属菌株的生理生化特性，可利用蛋白质、多种糖及淀粉。将该菌株命名为HZ18-3。
4.细菌菌株鉴定方法：
采用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。以待测菌株基因组DNA为模板，利用细菌16S rRNA基因通用引物27F/1492R扩增目的片段，PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR原液送博迈德生物工程股份有限公司测序。16S rRNA基因序列分析，经过序列对比鉴定，菌株HZ18-3以ZJJH-2为标准菌株的阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)HZ18-3，测序结果如SEQ ID NO.1所示序列。
实施例2
菌株生理生化分析
采用梅里埃API 20NE非发酵G+杆菌鉴定试剂盒试验菌株HZ18-3生理生化指标。阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3能利用柠檬酸盐，能利用半乳糖、甘露醇，不能利用葡萄糖胺。甲基红实验、柠檬酸盐实验、H2S产生实验、脲酶实验、氧化酶实验、接触酶实验、淀粉水解、硝酸盐还原实验均呈阳性。V-P实验、吲哚实验均呈阴性。详细结果如下表：
表1生理生化性质分析
Figure BDA0003464146110000051
注：+：阳性反应；-：阴性反应
实施例3
菌株对疮痂链霉菌抑制效果
马铃薯疮痂病病原菌4.1765(购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏编号为：CGMCC NO.4.1765)在马铃薯培养基上28℃培养5天；用1ml无菌水刮取孢子和菌丝体，制成一定浓度的病原体悬液，要求100μl体积涂布平板时菌丝生长后可以铺满平板表面。
取活化后的菌株HZ18-3于5ml马铃薯液体培养基，37℃，摇床培养24h。
将试验马铃薯疮痂病病原菌4.1765涂布于不同平板上(PDA)，在平板上局部点接6μl菌株HZ18-3，28℃培养，3天以后观察。得到如图2所示的实验结果：阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3能有效抑制试验马铃薯疮痂病病原菌4.1765生长。抑菌圈直径达35.8mm。
实施例4
菌株耐盐测试试验
基础培养基为LB液体培养基，向LB固体培养基中加入NaCl，调节盐浓度为0％、1％、3％、5％、9％、11％、12％，调节pH为7.0，121℃高压灭菌20min。
将活化后的待测菌株HZ18-3分别接种于五种不同盐浓度的LB液体培养基上，以不接种菌的培养基为空白对照，放入37℃的恒温培养箱中培养24h观察菌株HZ18-3的生长情况。测定OD值。结果如下，随着NaCl浓度的升高，菌株HZ18-3的浓度呈先上升再下降的趋势，表明HZ18-3更适宜含盐性的环境，当盐浓度达到12％
时，还能正常生长。证明该菌株可以在盐碱地改良中应用，具有耐盐性，适合作为微生物盐碱地改良剂。
表2HZ18-3耐盐结果
盐浓度(％) 0 2 4 6 8 10 12
OD<sub>600</sub> 0.89 1.13 1.27 1.06 0.68 0.46 0.12
实施例5
菌株对不同pH敏感性测定
基础培养基LB液体培养基，分别调节pH值为3、5、7、9、11、13。将活化后的待测菌株HZ18-3接种于六种pH值的敏感性测定培养基上，放入37℃的恒温培养箱中培养24h，观察待测菌株HZ18-3的生长情况。若菌株HZ18-3能够正常生长，说明该菌株能够耐受该pH；反之，则说明该菌株不能耐受该pH。测定其浓度OD值，结果如下，当pH小于5以及大于11时，菌株HZ18-3生长明显受到抑制，pH为11还能继续正常生长。证明该菌株可以在盐碱地改良中应用，具有耐碱性，适合作为微生物盐碱地改良剂。
表3HZ18-3 pH敏感性测定
pH 3 5 7 9 11 13
OD<sub>600</sub> 0.24 0.72 0.89 0.76 0.70 0.12
实施例6
菌株固氮、解磷能力试验结果
阿须贝无氮培养基(g/L)：磷酸二氢钾0.2g，硫酸镁0.2g，NaCl 0.2g，碳酸钙5.0g，甘露醇10g，硫酸钙0.1g，用ddH2O定容，调pH至7.0-7.5。
解磷培养基(g/L)：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸锰0.03g，硫酸钾0.3g，硫酸亚铁0.03g，磷酸三钙5.0g，琼脂15g。
在阿须贝无氮培养基和解磷培养基上各滴6μL菌株HZ18-3，生长5天之后有固氮(如图5A所示)、解磷圈产生(如图5B所示)，菌落轻微凸起，固氮圈大小为18.4mm，解磷圈大小为7.5mm。证明该菌株具有固氮、解磷能力，即将空气中的N2和植物不能吸收的无效磷转化成植物可以吸收的氨和有效磷，促进植物对大量营养元素的吸收，施用固氮解磷菌能促进植物生长，提高土壤的供氮能力，降低土壤pH与电导率，进而使植物根系微生态环境得到改善。
实施例7
菌株产纤维素酶、铁载体能力试验结果
羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基：CMC-Na15 g，磷酸氢二钠2.5g，磷酸二氢钾1.5g,蛋白胨2.5g，琼脂粉20g，用蒸馏水定容至1000mL，pH 7.2～7.5。
MSA基础培养基(1L)：葡萄糖4g，蛋白胨5g，氯化钾0.5g，硫酸镁0.5g，用ddH2O定容，调pH至7.0。
磷酸缓冲液(100mL)：磷酸二氢钠590.5mg，磷酸氢二钠2.427g，氯化铵250mg，磷酸二氢钾75mg，氯化钠125mg，用ddH2O定容至100mL。
CAS染液(100mL)：A液：称取铬天青S60.5 mg，用ddH2O定容至50mL，然后加入10mL1mmol/L的氯化铁(用10mmol/L盐酸配制)；B液：称取72.9mg六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)，用ddH2O定容至40mL；将A液混匀后缓缓沿杯壁加入到B液中。MSA-CAS培养基：向1L MSA基础培养基中依次加入50mL磷酸缓冲液和50mL CAS染液，混匀即可。
将纯化后的菌种点种在羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基上，30℃倒置培养48h后，用0.5％刚果红染色30min,1mol/L NaCl脱色30min，刚果红可以与羧甲基纤维素钠形成红色复合物,但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应，根据每株菌平板上透明圈的大小，初步判断细菌纤维素酶产量的相对高低。
将菌株接种于MSA-CAS液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养2d后。培养液由蓝色转变为橙黄色，结果为阳性，表明该菌株可产生铁载体(如图6所示)。
实施例7
菌株对马铃薯疮痂病防治盆栽试验
将马铃薯品种夏波蒂组培苗移栽至蛭石的花盆(直径17cm)中，生长15d后选取长势一致的幼苗，采用灌根法接种100mL疮痂链霉菌孢子悬液(1×107CFU/mL)于花盆中；再生长20d后接入100mL阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)菌株HZ18-3的发酵液(1×108CFU/mL)，对照组不加生防菌，并以未接种任何菌剂的处理为空白对照，每个处理重复3次。待马铃薯收获后，依据疮痂病病害分级标准，分别统计发病率、病情指数和防治效果。
统计结果显示，只有病原菌处理的马铃薯发病率达到100％，病情指数达到71.15％，而HZ18-3处理之后的马铃薯发病率为60％，病情指数为15％，菌株HZ18-3对马铃薯疮痂病的防效达到78.92％。
马铃薯疮痂病发病统计：
分级标准：
0级：薯皮健康，无病斑
1级：发病病斑面积为0-1/6
2级：发病病斑面积为1/6-1/3
3级：发病病斑面积为1/3-1/2
4级：发病病斑面积为1/2以上
发病率(％)＝发病块茎数/调查总块茎数×100
病情指数＝(各病级块茎数×该病级数代表值)/(调查个体总和×最高病级数)×100
相对防效(％)＝(对照组病情指数–处理组病情指数)×100/对照组病情指数
统计表
Figure BDA0003464146110000111
实施例8
菌株对马铃薯疮痂病防治大田试验
在广东省惠东县大田设置两个处理，CK:常规施肥：T:常规施肥后加阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3进行拌种，每克拌种剂含有1×108CFU活菌数。每个处理重复3次。待马铃薯收获后，观察其防治效果。结果显示，菌株HZ18-3对马铃薯疮痂病具有明显的防治效果(如图8所示)，可在马铃薯疮痂病防控中应用。
本发明提供的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3，培养简单、周期短、无生态毒性、耐盐碱、可利用的碳源种类丰富，能固定空气中的氮气，分解土壤中的难溶性磷，可产生纤维素酶、铁载体等，同时能够有效抑制马铃薯疮痂病病原菌的生长，在马铃薯疮痂病的生物防治和盐碱土地改良中具有非常广泛的应用前景。
序列表
<110> 山东施可丰生物科技有限公司
<120> 阿氏芽孢杆菌HZ18-3及其用途
<130> P21051
<141> 2022-01-11
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1408
<212> DNA
<213> 阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)
<400> 1
ctccttacgg ttactccacc gacttcgggt gttacaaact ctcgtggtgt gacgggcggt 60
gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta ctagcgattc 120
cagcttcatg taggcgagtt gcagcctaca atccgaactg agaatggttt tatgggattg 180
gcttgacctc gcggtcttgc agccctttgt accatccatt gtagcacgtg tgtagcccag 240
gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg tcaccggcag 300
tcaccttaga gtgcccaact aaatgctggc aactaagatc aagggttgcg ctcgttgcgg 360
gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc tgtcactctg 420
tcccccgaag gggaacgctc tatctctaga gttgtcagag gatgtcaaga cctggtaagg 480
ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat 540
tcctttgagt ttcagtcttg cgaccgtact ccccaggcgg agtgcttaat gcgttagctg 600
cagcactaaa gggcggaaac cctctaacac ttagcactca tcgtttacgg cgtggactac 660
cagggtatct aatcctgttt gctccccacg ctttcgcgcc tcagcgtcag ttacagacca 720
aaaagccgcc ttcgccactg gtgttcctcc acatctctac gcatttcacc gctacacgtg 780
gaattccgct tttctcttct gcactcaagt tccccagttt ccaatgaccc tccacggttg 840
agccgtgggc tttcacatca gacttaagaa accgcctgcg cgcgctttac gcccaataat 900
tccggataac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccgtggc 960
tttctggtta ggtaccgtca aggtacgagc agttactctc gtacttgttc ttccctaaca 1020
acagagtttt acgacccgaa agccttcatc actcacgcgg cgttgctccg tcagactttc 1080
gtccattgcg gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga gtctgggccg tgtctcagtc 1140
ccagtgtggc cgatcaccct ctcaggtcgg ctatgcatcg ttgccttggt gagccgttac 1200
ctcaccaact agctaatgca ccgcgggccc atctgtaagt gatagccgaa accatctttc 1260
aatcatctcc catgaaggag aagatcctat ccggtattag cttcggtttc ccgaagttat 1320
cccagtctta caggcaggtt gcccacgtgt tactcacccg tccgccgcta acgtcataga 1380
agcaagcttc taatcagttc gctcgact 1408

Claims (10)

1.一株阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3，其保藏编号为CGMCCNO.23635。
2.依据权利要求1所述阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3在制备抑制马铃薯疮痂病病原菌生长菌剂中的应用。
3.依据权利要求1所述阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3在制备微生物盐碱地改良剂中的应用。
4.依据权利要求3所述阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3在制备微生物盐碱地改良剂中的应用，其特征在于，所述盐碱地的盐质量浓度不高于12％。
5.依据权利要求3所述阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3在制备微生物盐碱地改良剂中的应用，其特征在于，所述盐碱地的pH为5-11。
6.依据权利要求1所述阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3在将空气中的N2转化植物可吸收氨中的应用。
7.依据权利要求1所述阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3在将难溶性磷转化植物可吸收磷中的应用。
8.依据权利要求1所述阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3在产生铁载体中的应用。
9.依据权利要求1所述阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3在分解纤维素中的应用。
10.依据权利要求1所述阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)HZ18-3在制备防治马铃薯疮痂病制剂中的应用。
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