CN109182136B - 一株具有多种难溶性磷源分解能力的黑曲霉jxz01的分离及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业微生物领域，公开了一株具有良好解磷能力的真菌及其在重金属污染修复中的应用，其分类命名为黑曲霉(Aspergillus niger)，菌株编号为JXZ01。该菌株已于2018年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC_No.15994。该菌株不仅可以通过分泌多种有机酸达到分解磷酸三钙、磷酸铁、磷酸铝和磷矿石并释放可溶性磷酸盐的目的，同时还可以通过分泌酸性磷酸酶以及植酸酶达到分解卵磷脂和植酸钙，并同时释放可溶性磷酸盐的效果。该菌株对重金属Cu、Pb、Cr和Zn等具有良好的耐受能力和修复效果，具有应用于土壤重金属污染修复领域的潜力。

Description

一株具有多种难溶性磷源分解能力的黑曲霉JXZ01的分离及 应用

技术领域

本发明属于农业微生物领域，具体地说涉及一株具有多种难溶性磷源分解能力的黑曲霉JXZ01的分离筛选及应用。

背景技术

磷元素是植物所必须的三大营养元素之一。参与植物体基本生理代谢活动并构成植物体细胞最重要组份的RNA、DNA、磷脂质以及三磷酸腺苷等物质都含有磷元素(赵琼,2005)。有研究表明，磷元素的缺乏会导致植物体出现出芽缓慢、叶片黄化、易受到植物病原菌侵染以及产量降低的现象。由此可见，土壤中可供植物直接吸收利用的磷素(速效磷)含量对植物的生长发育具有重要的影响。提高土壤中速效磷含量对于农作物增产具有重要的意义。

我国目前约有74％的耕地土壤存在磷素缺乏的问题(吉蓉,2013)。土壤中的磷元素大部分以含磷矿物和金属螯合物的形态存在，含磷矿物有羟基磷灰石、氟基磷灰石和氯磷灰石等；金属鳌合态的磷在酸性土壤中主要以铝磷和铁磷为主，而在中性或碱性土壤中则以钙磷为主。土壤中难溶性无机磷的含量约占据土壤全磷含量的50％～80％之间(刘建玲,2000)；然而，可供植物所直接吸收利用的速效磷含量则相对较低。此外，土壤中约有10％～15％的难溶性磷以有机磷的形态存在，有机磷的主要类型包括有植酸盐、磷脂质、核苷酸和磷酸糖类等。从环境学角度来看，这些有机磷类物质在水体中过多富集还会增加水体富营养化的风险。

在过去的几十年中，施用化学磷肥一般视为解决土壤磷素缺乏的首选方案。然而，化学磷肥通常面临利用效率低下的问题，有研究表明，施入土壤中的70％～90％磷素会迅速与土壤中的金属阳离子发生螯合作用而沉淀下来，最终不能被植物所直接吸收利用。此外，长期施用化肥还会导致土壤结构破坏以及土壤生态系统发生退化；而且，长期施用化肥还会导致土壤酸化和肥料中的重金属在土壤中的持续积累，增加土壤重金属污染的风险。目前重金属污染的修复方法有物理修复、化学修复以及生物修复等(串丽敏，2014)。其中物理/化学修复技术很容易造成土壤二次污染，并且成本较高；利用生物修复技术，特别是微生物修复技术，通过微生物的吸收、沉淀、氧化和还原等作用实现对重金属转化为无毒或低毒物质的手段具有成本低、无污染的特点(刘海华，2017；赵茜，2018)。

溶磷微生物是一类可以通过分泌有机酸来达到分解释放难溶性无机磷酸盐中可溶性磷酸根离子的微生物功能类群，由于溶磷微生物具有来源广、成本低和无污染的优点，通常作为制备微生物菌肥以及替代传统化肥的优选材料。目前筛选溶磷微生物常用的无机磷源为磷酸三钙(Ca₃(PO₄)₂)，种类较为单一。而且由于对溶磷微生物在土壤中的定殖状态以及功能效应相关的研究较少，一些溶磷微生物添加到土壤中易出现效益不稳定的现象。鉴于上述存在的问题，选用不同的难溶性有机/无机磷源来筛选和评价溶磷微生物，同时对溶磷微生物在土壤中的定殖动态以及溶磷能力进行动态监测，对筛选高效溶磷微生物，指导溶磷微生物菌肥田间施用措施以及提高菌肥利用效率具有重要的意义。此外，检测溶磷微生物的重金属耐受能力与重金属吸附或钝化效果，对扩大溶磷微生物的应用范围，提供新型重金属污染生物修复技术等方面都具有重要的应用价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题如下：

首先，是提供一株具有多种难溶性磷源分解能力的溶磷菌，用于制备微生物菌肥，也可用于降解磷脂类环境污染物。

其次，是检测该溶磷菌在潮土和黄棕壤中的定殖动态和溶磷能力，为该溶磷菌及其微生物菌肥的田间应用提供理论指导。

最后，是检测该溶磷菌对不同重金属的耐受能力与清除效率，为重金属生物修复技术提供新型生物材料和方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

本发明所提供的方案之一，是提供一株具有多种难溶性磷源分解能力的溶磷真菌。该菌株经鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)，菌株编号为JXZ01，该菌株目前保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，保藏日期为2018年7月19日，保藏编号为CGMCC No.15994。该菌株是由发明人于2016年4月从南京市江心洲(118.71°E,32.01°N)采集的非耕地潮土中分离得到，采样深度为0～20cm。

本发明所述的溶磷真菌JXZ01，其ITSrDNA基因上有效长度约为600bp的核苷酸序列，ITSrDNA序列如SEQ ID No.：1所示。将该序列输入GenBank，用BLAST软件与数据库序列进行比对分析，结果显示该菌株与黑曲霉(Aspergillusniger)的相似度最高，为100％。基于ITSrDNA基因的系统发育结果，该菌株JXZ01鉴定为黑曲霉的一个新种。

本发明所提供的方案之二，是所述的溶磷菌JXZ01在土壤中的应用，优选的是在潮土或黄棕壤中的应用。

更具体的，本发明所述的溶磷菌JXZ01在土壤溶磷中的应用。

进一步的，本发明所述的应用，微生物活菌按照(0.5～5)×10⁹CFU·g^-1(干土)的接种量，更优选为(0.5～2)×10⁹CFU·g^-1(干土)。

进一步的，本发明所述的溶磷菌JXZ01在降解难溶性磷源中的应用。

本发明所述的溶磷真菌JXZ01的溶磷能力较强，能够分解包括但不限于磷酸三钙(Ca₃(PO₄)₂)、磷酸铝(AlPO₄)、磷酸铁(FePO₄)、氟基磷灰石(FAp)、卵磷脂与植酸钙等多种难溶性磷源，并释放可溶性磷。在Ca₃(PO₄)₂为磷源条件下，JXZ01的可溶性磷释放量最大可达770.51mg·L^-1；在AlPO₄为磷源条件下，该菌株可溶性磷释放量最大可达431.26mg·L^-1；在FePO₄为磷源条件下，该菌株可溶性磷释放量最大可达209.52mg·L^-1；在FAp为磷源条件下，该菌株可溶性磷释放量最大可达4.24mg·L^-1；在卵磷脂为磷源条件下，该菌株可溶性磷释放量最大可达35.73mg·L^-1；在植酸钙为磷源条件下，该菌株可溶性磷释放量最大可达196.07mg·L^-1。该菌株分解难溶性无机磷主要通过释放有机酸，包括草酸、葡萄糖酸、酒石酸、甲酸、苹果酸、2-酮戊二酸、乙酸、柠檬酸与琥珀酸；分解难溶性有机磷主要通过分泌酸性磷酸酶或植酸酶。

本发明所提供的方案之三，是所述的溶磷菌JXZ01在修复重金属污染中的应用。

本发明还提供所述的溶磷菌JXZ01在土壤重金属污染修复中的应用。

所述的重金属包括但不限于铅(Pb²⁺)、铜(Cu²⁺)、镉(Cd²⁺)、铬(Cr³⁺)和锌(Zn²⁺)；特别地，该菌株对Cu²⁺、Cr³⁺、Pb²⁺和Zn²⁺的耐受能力较强，对Pb²⁺和Cu²⁺的吸附/钝化能力较好。

本发明还提供了溶磷菌JXZ01在制备微生物肥料中的应用。

本发明还提供一种微生物肥料，该微生物肥料包括本发明所述的溶磷菌JXZ01。

有益效果：本发明所述的一株溶磷菌可以利用和分解多种难溶性的有机/无机磷源，而且在土壤培养条件下依然表现出良好的定殖能力和溶磷能力。此外，所述的溶磷菌对Pb²⁺和Cu²⁺等重金属的耐受能力和修复能力较高。该菌株在培养过程中未见产生有毒或有害的分泌物，同时该菌株不会对植物产生病害，对人畜的致病性较小。在微生物菌肥研发和开发新型重金属修复技术领域中具有较大的应用潜力，属于一种优良的微生物育种。

附图说明

图1溶磷菌JXZ01基于ITSrDNA基因的系统发育进化树。

图2溶磷菌JXZ01在不同磷源条件下的选择性培养基上培养4天后的生长情况和溶磷圈，难溶性磷源分别是：Ca₃(PO₄)₂(a)；FePO₄(b)；AlPO₄(c)；FAp(d)；卵磷脂(e)；植酸钙(f)。

图3溶磷菌JXZ01在不同无机磷源条件下培养5天后有机酸分泌情况。

图4溶磷菌JXZ01在卵磷脂和植酸钙为磷源条件下培养5天的酸性磷酸酶(a)和植酸酶(b)活性变化情况。

图5溶磷菌JXZ01在潮土和黄棕壤中的定殖动态。

图6接种溶磷菌JXZ01的潮土和黄棕壤中速效磷增量的变化动态。

图7溶磷菌JXZ01对不同浓度的重金属Cd、Cr、Cu、Pb和Zn的修复效果(a)和耐受能力(b)。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，以下将结合附图列举若干实施案例，并在实验方法方面进行详细阐述。

实施例1溶磷菌的分离与鉴定

首先准备以下三种培养基：

PDA培养基：葡萄糖10.00g，马铃薯200.00g，琼脂18.00-20.00g,蒸馏水1000.00mL。

PVK无机磷培养基：葡萄糖10.00g，(NH₄)₂SO₄ 0.50g，MnSO₄·4H₂O 0.03g,KCl0.30g,MgSO₄·7H₂O 0.30g,FeSO₄·4H₂O 0.03g,NaCl 0.3g,无机磷源(Ca₃(PO₄)₂/FePO₄/AlPO₄/FAp)10.00g,琼脂18.00～20.00g,蒸馏水1000.00mL，pH 7.00～7.50。

PVK有机磷培养基：葡萄糖10.00g，(NH₄)₂SO₄ 0.50g，MnSO₄·4H₂O 0.03g,KCl0.30g,MgSO₄·7H₂O 0.30g,FeSO₄·4H₂O 0.03g,NaCl 0.30g,有机磷源(卵磷脂/植酸钙)2.00g,琼脂18.00～20.00g,蒸馏水1000mL，pH 7.00～7.50。

上述培养基灭菌条件为115℃高压蒸汽灭菌30min。上述液体培养基制备时去除琼脂。

溶磷菌的分离方法为：将10g混合均匀的土壤样品置于盛有90mL无菌水的250ml的三角瓶中，在摇床30℃，180r·min^-1条件下均匀振荡40min，静置10min后得到悬浮液。吸取100μL的上清液加入到含有900μL无菌水的离心管中，采用稀释涂布平板法梯度稀释后，将稀释梯度为10^-4、10^-5、10^-6三个梯度的稀释液取适量均匀涂于以Ca₃(PO₄)₂为唯一磷源的蒙金娜无机磷固体培养基中，将平板倒置，在30℃恒温箱中培养4～7天后，挑取具有明显溶磷圈的单菌落，溶磷真菌接种于PDA固体培养基上，并分别编号，以便后续使用。待接种后的PDA平板上长出明显的菌落后，用接种环挑取单菌落在PDA平板上反复划线纯化3～4次，同时镜检其纯度，直到获得纯培养。上述方法获得一株具有明显溶磷圈的溶磷真菌，编号为JXZ01。

将上述方法分离筛选到的溶磷真菌JXZ01，经南京钟鼎生物公司测序，根据ITSrDNA的测序结果，在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov在线查询分析，利用Blast软件在GenBank中与其它的ITS rDNA序列进行同源性比较，确定其为黑曲霉。该菌株送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.15994，保藏日期为2018年7月19日。基于ITSrDNA基因的系统发育树如图1所示，该菌株与黑曲霉ITSrDNA基因序列相似度最高。

实施例2JXZ01对不同难溶性磷源的分解能力测定

为了测定本发明菌株JXZ01溶解难溶性磷源的能力，首先用接种环将单菌落分别点接于不同磷源条件下的固体PVK平板上，30℃恒温培养3～4天，观察是否有溶磷圈的产生，以此定性地判断所筛选溶磷微生物溶磷能力的大小。JXZ01在不同磷源条件的PVK平板上的生长情况如图2所示，在以Ca₃(PO₄)₂、FAp、卵磷脂和植酸钙为磷源时能够产生明显的溶磷圈；此外，尽管在FePO₄和AlPO₄为磷源时没有产生明显的溶磷圈，但溶磷菌生长状态良好。

为了定量测定JXZ01溶磷能力的大小以及随时间的动态变化，采用液体摇瓶培养实验并进行动态取样的方法测定；具体方法如下：

首先用PDA固体培养基对溶磷真菌进行30℃恒温培养直至平板上布满白色的菌丝和黑色的孢子，采用无菌水对真菌孢子进行洗涤，并用六层无菌纱布过滤菌丝，收集孢子悬液；采用血球计数法对孢子悬液中孢子数量进行计数，并调节孢子浓度约为1×10⁸CFU·mL^-1。按照1％的接种量将上述孢子悬液分别接种到不同磷源的PVK液体培养基中，30℃，180r·min^-1摇床培养5天，每隔24h取样一次。发酵液经12000rpm离心10min，上清液分别用钼锑抗比色法及Mettler FE 20型pH计测定可溶性磷含量与pH值。

如表1和表2所示，本发明菌株JXZ01对上述六种难溶性有机/无机磷源均具有明显的溶解能力；在Ca₃(PO₄)₂、AlPO₄、FePO₄、FAp、卵磷脂和植酸钙为磷源条件下，JXZ01的最大溶磷量分别为770.51、431.26、209.52、4.24、35.73和196.07mg·L^-1。此外，在上述六种难溶性磷源条件下，发酵液pH在培养过程中都表现出了明显的降低；在Ca₃(PO₄)₂、AlPO₄、FePO₄、FAp、卵磷脂和植酸钙为磷源条件下，发酵液最低pH分别为3.66、1.99、1.88、3.10、4.64和2.09。

表1：溶磷菌JXZ01在PVK培养基中对不同难溶性磷源溶解能力的测定

注：字母不同表示同一磷源下不同取样时间的样本间具有显著性差异(p<0.05)(Duncan’s Test)。

表2：不同磷源条件下接种溶磷菌JXZ01的PVK培养基发酵液pH的变化

注：字母不同表示同一磷源下不同取样时间的样本间具有显著性差异(p<0.05)(Duncan’s Test)。

实施例3 JXZ01在无机磷源条件下分泌有机酸的测定

本发明菌株JXZ01溶解无机磷酸盐的机制主要为分泌有机酸。JXZ01在不同无机磷源条件下分泌有机酸的种类与浓度采用高效液相色谱法(HPLC)进行分离和测定。

具体方法如下：

将培养5天内的以Ca₃(PO₄)₂、FePO₄、AlPO₄、FAp为单一磷源的PVK液体发酵液样品12000rpm离心10min，将上清液经0.22μm的滤膜过滤后装入棕色进样瓶，高效液相色谱测定有机酸备用。检测的有机酸种类包括有草酸、葡萄糖酸、酒石酸、甲酸、乙酸、苹果酸、α-酮戊二酸、柠檬酸以及琥珀酸等9种有机酸。

高效液相色谱分离鉴定有机酸的色谱条件为：高效液相色谱仪为美国Agilent公司生产的Agilent 1260型液相色谱仪；色谱柱为日本Shimadzu公司生产的C₁₈色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)；柱温30℃，流动相为2.5％的磷酸二氢铵缓冲液-甲醇溶液，体积比为99％：1％，用磷酸将溶液pH值调节为2.5；流速为0.5mL·min^-1；进样量为10μL；冲洗方式为等度洗脱；紫外检测波长为210nm。

本发明菌株JXZ01在不同无机磷源条件下有机酸分泌情况如图3所示。可以看出，以Ca₃(PO₄)₂为磷源时，有机酸分泌量最高的为甲酸，最大分泌量可达632.93mg·L^-1；以FePO₄和AlPO₄为磷源时，分泌量最高的有机酸均为草酸，分别为851.10mg·L^-1和1593.37mg·L^-1；以FAp为磷源时，甲酸和柠檬酸分泌量较高，分别达到150.43mg·L^-1和183.00mg·L^-1。此外，葡萄糖酸在上述四种无机磷源条件下的各取样时间点内都有检出。

实施例4 JXZ01在有机磷源条件下分泌水解酶活性的测定

本发明菌株JXZ01分解有机磷的机制主要是通过分泌相应的水解酶来完成。在以卵磷脂和植酸钙为磷源条件下，酸性磷酸酶与植酸酶分别发挥主要的有机磷分解作用。

酸性磷酸酶活性的测定方法为对硝基苯磷酸二钠(p-NPP)底物反应法。具体操作方法为：吸取1mL以卵磷脂为磷源的PVK发酵液，加入4mL pH值为6.5的MUB和0.025mol·L^-1的对硝基苯磷酸二钠溶液1mL，震荡均匀后于37℃环境中密封培养1h。培养过后再加入1mL0.5mol·L^-1的氯化钙和4ml 0.5mol·L^-1的氢氧化钠以终止反应。震荡均匀后采用滤纸过滤悬液，并将滤液于分光光度计420nm处进行比色测定。标准曲线采用1g·L^-1的对硝基酚溶液进行制备，分别吸取对硝基酚溶液0、1、2、3、4、5mL于试管内，并用无菌水定容至5mL。每个试管内采用同上的方法，加入1mL 0.5mol·L^-1的氯化钙和4mL 0.5mol·L^-1的氢氧化钠，并震荡过滤，测定420nm处滤液的吸光值并根据相应的对硝基酚浓度绘制标准曲线。将上述发酵液培养后的420nm吸光值带入标准曲线以获得相应的生成物浓度。酶活表征以每小时1L发酵液中含有的磷酸酶作用于底物并释放出酚类化合物的摩尔质量作为1个酶活力单位，单位记做μmol·L^-1·h^-1。

植酸酶活性的测定方法为植酸钠底物反应法。具体操作方法为：首先向容量瓶中加入0.25mol·L^-1的乙酸钠缓冲液1.8mL，再加入0.2mL待测发酵液，同时设立添加等量无菌水的空白对照组。待上述液体充分混合后置于37℃环境下预热5min；其后再依次加入4ml7.5mmol·L^-1的肌醇六磷酸钠(C₆H₆O₂₄P₆Na₁₂)溶液作为反应底物，充分混合后置于37℃环境下充分反应30min。反应完毕后再分别加入4ml终止液(2体积的1:2硝酸水溶液(v/v)与1体积100g·L^-1的钼酸铵溶液以及1体积的2.35g·L^-1钒酸铵溶液混合使用)终止反应。加入终止液之后的反应液在室温下静置10min待其充分反应生产黄色复合物后，采用分光光度法对反应液在415nm处的吸光值进行测定，同时记录样品组与对照组的吸光值A与A₀，以A-A₀作为实测吸光值。将吸光值带入标准曲线计算植酸酶活性。标准曲线的绘制方法为：称取0.6804g的磷酸二氢钾于100ml容量瓶中，以0.25mol·L^-1的乙酸钠缓冲液定容至刻度线，终浓度为50.0mmol·L^-1，磷酸二氢钾事先于105℃烘干水分至恒重；分别将溶液梯度稀释为1.5625mmol·L^-1、3.125mmol·L^-1、6.25mmol·L^-1、12.5mmol·L^-1以及25mmol·L^-1的不同浓度，与上述试样与空白一起进行比色测定。植酸酶活性以每小时1L发酵液中含有的植酸酶作用于底物并释放出无机磷的摩尔质量作为1个酶活力单位，单位记做μmol·L^-1·h^-1。

本发明菌株JXZ01在卵磷脂和植酸钙为磷源条件下所表现出的酸性磷酸酶与植酸酶活性动态变化如图4所示。酸性磷酸酶和植酸酶活性最大值均出现在接种后第5天，分别为8562.96μmol·L^-1·h^-1和363.16μmol·L^-1·h^-1。

实施例5 JXZ01土壤定殖能力与溶磷能力测定

本发明菌株JXZ01在黄棕壤和潮土中可以良好定殖并发挥明显的溶磷能力。接种JXZ01的两种土壤速效磷含量表现出明显的提高。下面对土壤培养试验方法进行详细阐述。

所述的黄棕壤采集自江苏南京六合区(118°84′E,32°40′N)的一个生态养殖农场中，农田土壤长期施用包括秸秆、牛粪堆肥等类型的有机肥料，所述的潮土采集自江苏南京板桥镇(118°66′E,31°92′N)的小麦-玉米轮作模式的农田中。以上土壤样品均采集自0-20cm的表层土壤。上述两种土壤的基本理化性质如表3所示，其中潮土速效磷含量较低，属于缺磷土壤；黄棕壤速效磷含量则相对较高。为了更好地验证该菌株在土壤中与其他土著微生物相比具有竞争优势，上述土壤分别设置灭菌与未灭菌两个处理。

表3：供试土壤基本理化性质

分别将灭菌与未灭菌处理下的黄棕壤和潮土过20目筛以混合均匀，同时按照每份50g的质量装填到250mL圆柱形培养瓶中，为了防止外源微生物污染，培养瓶瓶口采用除菌滤膜进行封口。本发明菌株JXZ01接种按照1×10⁹CFU·g^-1干土的接种量将孢子液均匀地接种于不同类型土壤中，同时每种土壤以及每个处理下均设立不接菌组作为对照。为了保持土壤水分条件的一致性，土壤含水率控制在田间最大持水量的70％。最后，将所有已封口的培养瓶置于30℃恒温箱中进行培养，所有培养瓶随机摆放。培养环境的相对湿度恒定为70％，每隔5天进行开盖通气并调节土壤含水率。本试验培养周期为90天，在JXZ01接种后第30天、60天和90天分别对土壤进行破坏性采样，进行土壤速效磷含量的测定。

为了密切监测溶磷微生物的定殖数量变化趋势，分别在JXZ01接种后的第7天、14天、21天、30天、45天、60天、75天以及90天通过非破坏性采样方式对土壤进行取样并采用稀释涂布平板法监测溶磷微生物的定殖数目变化。JXZ01采用孟加拉红真菌计数平板进行稀释涂布，并通过形态学特征进行计数；黑曲霉生长特征为先产生乳白色菌丝，而后迅速被黑色孢子所覆盖，所形成的菌落边缘为淡黄色。此外，对相应培养周期下不接菌处理组土壤同样进行稀释涂布作为对照，排除土壤土著微生物对试验结果的影响。

本发明菌株JXZ01在黄棕壤和潮土中的定殖动态如图5所示，本发明所述的溶磷菌JXZ01在速效磷含量不同的两种土壤(黄棕壤和潮土)中均能够良好地定殖并表现出明显的溶磷能力。在整个培养周期内，JXZ01均能够良好定殖于土壤中，且定殖数量均在10⁶CFU·g^-1以上，且JXZ01在灭菌土壤中的定殖数量略高于其在同期未灭菌土壤中的定殖数量。此外，接种JXZ01后，土壤速效磷含量变化较大，大部分处理组土壤速效磷含量都表现出了明显的升高；如图6所示，接种该菌株可使得未灭菌的黄棕壤和潮土速效磷含量分别最大程度上升高21.28和21.29mg·kg^-1，分别出现在接种后第30天和60天；相比之下，接种该菌株使灭菌黄棕壤和潮土速效磷含量分别最大程度上升高40.53和21.02mg·kg^-1，分别出现在接种后第60天和30天。

实施例6 JXZ01重金属耐受能力与修复能力的测定

本发明菌株JXZ01对Cd²⁺、Cr³⁺、Cu²⁺、Pb²⁺和Zn²⁺等五种重金属都具有不同程度的耐受能力与修复能力。随着重金属浓度的升高，JXZ01对Cu和Pb的耐受能力与修复能力依然较高；Cu和Pb浓度为1000mg·L^-1时，接种JXZ01处理组中的重金属Pb和Cu浓度下降幅度分别可达68.21％和43.33％。下面对本试验方法进行详细阐述。

采用含有重金属但不加琼脂的液体PDA培养基进行摇瓶培养试验。将CdCl₂、CrCl₃、CuCl₂、PbCl₂和ZnCl₂等五种重金属试剂配制成水溶液，按照终浓度为100mg·L^-1、200mg·L^-1、400mg·L^-1和1000mg·L^-1的条件添加到无菌的液体PDA培养基中，分别按照1％的接种量接种1×10⁸CFU·mL^-1浓度的孢子液，30℃，180r·min^-1条件下摇床培养三天，收集发酵液并通过0.22μm滤膜进行过滤，滤液重金属浓度通过ICP进行测定。通过布氏漏斗对真菌菌丝进行抽滤收集，并在75℃条件下烘干至恒重，测定真菌菌体干重。上述试验均设置三个重复。

培养后发酵液重金属浓度变化如图7(a)所示。可以看出，在不同的重金属初始浓度下，接种本发明菌株JXZ01后液体中重金属浓度都有所降低。高重金属浓度(1000mg·L^-1)下，Pb²⁺和Cu²⁺两种重金属离子的浓度降低幅度最大，下降幅度分别可达68.21％和43.33％；而该菌株对Cd²⁺和Zn²⁺的最优修复效果出现在低浓度条件(20mg·L^-1)下，该条件下重金属Cd²⁺和Zn²⁺浓度下降幅度分别为65.86％和34.82％；接种该菌株的处理组中重金属Cr³⁺最大下降幅度为21.01％。此外，随着重金属浓度的升高，真菌菌体干重表现出下降的趋势，但在Cu²⁺、Cr³⁺和Pb²⁺三种重金属处理下，本发明菌株JXZ01在高浓度条件下菌体干重相对较大，依然能够表现出较好的生长能力，如图7(b)所示。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一株具有多种难溶性磷源分解能力的黑曲霉JXZ01的分离及应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 600

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 1

tccgtagggt gaacctgcgg aaggatcatt accgagtgcg ggtcctttgg gcccaacctc 60

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ggggggacgg gcccgaaagg cagcggcggc accgcgtccg atcctcgagc gtatggggct 480

ttgtcacatg ctctgtagga ttggccggcg cctgccgacg ttttccaacc attctttcca 540

ggttgacctc ggatcaggta gggatacccg ctgaacttaa gcatatcaat aagcggagga 600

Claims (13)

1.一株溶磷菌，其特征在于，分类命名为黑曲霉(Aspergillus niger)，菌株名称JXZ01，保藏编号为CGMCC No. 15994。

2.权利要求1所述的溶磷菌在土壤溶磷中的应用。

3.权利要求1所述的溶磷菌在降解难溶性磷源中的应用。

4.权利要求1所述的溶磷菌在降解磷酸三钙、磷酸铝、磷酸铁、氟基磷灰石、卵磷脂和/或植酸钙中的应用。

5.权利要求1所述的溶磷菌在修复重金属污染中的应用。

6.权利要求1所述的溶磷菌在铅、铜、镉、铬和/或锌引起的污染修复中的应用。

7.权利要求1所述的溶磷菌在土壤重金属污染修复中的应用。

8.权利要求1所述的溶磷菌在铅、铜、镉、铬和/或锌引起的土壤污染修复中的应用。

9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，微生物活菌按照(0.5～5)×10⁹ CFU•g^-1干土的接种量。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，微生物活菌按照(0.5～2)×10⁹ CFU•g^-1干土 的接种量。

11.权利要求1所述的溶磷菌在制备微生物肥料中的应用。

12.一种微生物肥料，该微生物肥料包括权利要求1所述的溶磷菌。

13.权利要求12所述的微生物肥料在降解难溶性磷源或在修复重金属污染中的应用。

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