CN111979159A - 一种解磷菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种解磷菌剂及其制备方法与应用 Download PDF

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刘学端
周志成
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Abstract

本发明涉及微生物制剂领域，具体涉及一种解磷菌剂及其制备方法与应用。解磷菌剂选取铅锌矿区自然生长的植物根际土壤采用蒸馏水浸提获得浸提液；并配置富集培养基和含有浸提液的选择培养基；将根际土壤加入至所述富集培养基进行至少两次富集培养，获得细菌富集液；将细菌富集液进行稀释进行选择培养获得解磷菌落，并将解磷菌落混合进行传代培养，将传代培养后的菌群进行发酵扩培获得解磷菌剂，该菌剂不仅具有良好的解磷效率，还能够在重金属浓度较高的条件下良好生长且发挥解磷功能。

Description

一种解磷菌剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物制剂领域，具体涉及一种解磷菌剂及其制备方法与应用。
背景技术
磷是植物的必要元素，不仅是植物细胞的重要组成部分，且对植物生长以及植物的抗病性、抗寒性具有较大的影响，因此植物对磷的吸收极大程度上影响了植物的生长状况。
现有技术中具体公开了很多解磷菌剂，其主要通过将解磷细菌进行复合，比如将维罗纳假单胞菌、水生拉恩氏菌、巨大芽孢杆菌等细菌按照一定比列和相关的添加剂获得复合解磷菌剂，或者以摩西球囊菌、透光球囊霉、幼套球囊霉、苏格兰球囊霉中的任意一种细菌作为解磷菌剂，上述解磷菌剂在一般土壤中能够提高能被植物有效吸收的磷的含量，促进植物的生长。
但是，通常现有技术中的复合菌剂重金属耐受程度不高，尤其在高浓度重金属的环境下解磷效率低，无法在高浓度重金属矿区土壤中实现高效解磷的目的。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种解磷菌剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
选取铅锌矿区自然生长的植物根际土壤进行风干，并按照固液比为1：8-12的质量比加入至蒸馏水中，震荡处理后离心取上清液，并进行灭菌处理获得浸提液；所述矿区为广东凡口铅锌矿区；
以蛋白胨、牛肉浸膏、氯化钠和蒸馏水为原料配制并灭菌富集培养基，以所述浸提液、蛋白胨、葡萄糖、磷酸钙、硫酸镁、琼脂和蒸馏水为原料配制并灭菌获得选择培养基；以蛋白胨、葡萄糖、磷酸钙、硫酸镁和蒸馏水为原料配制并灭菌获得传代培养基；
将1-3g所述根际土壤加入至140-160ml，所述富集培养基进行两次富集培养，获得细菌富集液；
将所述细菌富集液进行稀释后涂布至所述选择培养基上进行选择培养获得透明圈菌斑，并将所述透明圈菌斑接种至传代培养基上进行传代培养，传代培养后获得液体即为解磷菌剂。
更进一步地，所述震荡处理后离心取上清液，并进行灭菌处理获得浸提液的步骤具体包括：
将所述植物根际土壤风干后加入到蒸馏水中混合，在转速为100-120rpm条件下震荡25-35min后，在4000rpm条件下离心8-10min，取上清液，在121℃的条件下灭菌20min后得到的液体即为浸提液。
更进一步地，所述富集培养基中各原料的浓度为：蛋白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，氯化钠5g/L，pH为7.4-7.6。
更进一步地，所述选择培养基中各原料的浓度为：蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸钙10g/L，硫酸镁0.5g/L，浸提液40ml/L，琼脂20g/L，pH为7.2。
更进一步地，所述传代培养基中各原料的浓度为：蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸钙10g/L，硫酸镁0.5g/L，pH为7.2。
更进一步地，所述将1-3g所述根际土壤加入至140-160ml所述富集培养基进行两次富集培养，获得细菌富集液步骤具体包括：
将1-3g所述根际土壤加入至140-160ml所述富集培养基中，在28-32℃转速为100rpm条件下震荡培养20-26h，获得富集混悬液；
将8-12ml所述富集混悬液加入至140-160ml所述富集培养基中，在28-32℃转速为100rpm条件下震荡培养20-26h，静置获取富集培养上清液即为细菌富集液。
更进一步地，所述选择培养和传代培养的培养条件为28-32℃。
本发明还提供了一种解磷菌剂，所述解磷菌剂按照上述制备方法制备获得。
本发明还提供了上述解磷制剂在在铅锌尾矿矿区土壤修复中的应用。
有益效果：
本发明通过从铅锌矿区自然生长的植物根部及其土壤中富集细菌，并通过含有根际土壤浸提液的选择培养基对富集获得细菌进行选择培养，获得具有耐重金属的菌剂并进行扩培，获得解磷菌剂，该解磷菌剂由多种微生物组成，如假单胞杆菌、寡养单胞菌、泛菌、芽孢杆菌、肠杆菌等，由于其初始生存的环境为重金属离子浓度较高，该菌剂中的某些微生物细菌如假单胞杆菌能够将重金属离子摄入至菌细胞内，然后再通过代谢排出，通过长时间的选择生长过程，该细菌对重金属离子的耐受能力逐渐增强，另外某些微生物如芽孢杆菌的细胞壁生长有蛋白质、脂多糖和磷脂构成的复杂结构，其能够与重金属离子螯合，防止重金属离子进入细胞内，菌剂中微生物相互配合相互协同，使得各种微生物能够稳定生存在高重金属离子的环境下；且解磷菌剂在代谢过程中能够分泌有机酸，使得难溶性的磷形成可溶性的磷化合物，使得土壤中有效磷含量升高，不仅能够在重金属浓度较高的条件下良好生长，而且具有良好的解磷效率。
具体实施方式
为了更加清楚阐述本发明的技术内容，在此结合具体实施例予以详细说明，显然，所列举的实施例只是本技术方案的优选实施方案，本领域的技术人员可以根据所公开的技术内容显而易见地得出的其他技术方案仍属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，选取铅锌矿区中自然生长的植物醉鱼草的根和根际土壤作为原料富集原料。
取广东凡口铅锌矿区自然生长的植物醉鱼草的根际土壤风干处理获得干燥土，干燥土样品磨制100目以下，用硝酸、氢氟酸和高氯酸在电动加热板中消解，采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测重金属含量，获得土壤中重金属含量如表1所示。
表1铅锌矿区土壤重金属含量
离子类型 浓度 离子类型 浓度
Al 33.89±7.59g/kg As 150.25±43.69mg/kg
B 387.50±60.88mg/Kg Ba 283.9±66.1mg/Kg
Ca 1.01±0.22g/kg Cd 7.62±2.10mg/Kg
Cr 68.09±17.52mg/Kg Co 36.97±6.71mg/Kg
Cu 1.66±0.33g/kg Fe 127.28±6.41g/kg
K 10.57±0.82g/kg Li 51.1±4.26mg/Kg
Mg 6.06±0.58g/kg Mn 4.62±0.18g/kg
Na 647.0±133.5g/kg Ni 51.69±7.22mg/Kg
P 634.42±20.07mg/Kg Pb 1331.7±106.1mg/Kg
Sr 35.86±4.78mg/Kg V 107.27±3.75mg/Kg
Zn 1943.8±38.6mg/Kg
实施例1
选取广东凡口铅锌矿区自然生长的植物醉鱼草的根际土壤风干处理获得干燥土，将干燥土按照1:10的质量比加入到蒸馏水中，100rpm下震荡30min后4000rpm条件下离心10min，在121℃的条件下灭菌20min后得到的液体即为浸提液。
称取原料蛋白胨、牛肉浸膏、氯化钠和蒸馏水，配制成蛋白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，氯化钠5g/L，pH为7.4-7.6的培养基，并在115℃条件下灭菌30min获得富集培养基；量取原料浸提液并称取蛋白胨、葡萄糖、磷酸钙、硫酸镁、琼脂和蒸馏水，配制成蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸钙10g/L，硫酸镁0.5g/L，浸提液40ml/L，琼脂20g/L，pH为7.2的培养基，在115℃条件下灭菌30min获得选择培养基；称取蛋白胨、葡萄糖、磷酸钙、硫酸镁和蒸馏水配置成蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸钙10g/L，硫酸镁0.5g/L，pH为7.2的培养基，在115℃条件下灭菌30min获得传代培养基。
称取2g新鲜根际土壤，置于含有150ml富集培养基的玻璃三角瓶中，置于摇床上在100rpm，30℃的富集条件下震荡培养24h，吸取震荡悬浮液10ml接种至装有140ml培养基的三角瓶中进行第二次富集培养，接种后放入摇床上在相同条件下继续震荡培养24h，静置获取富集培养基的上清液为细菌富集液。
取细菌富集液1ml进行以10倍梯度进行稀释，最低稀释至106倍，并取每一个稀释梯度的稀释液200μl，均匀的涂抹在选择培养基上，每个稀释梯度三个平板，在30℃条件下培养培养至每个培养基平板出现透明圈(磷酸钙为不可溶的沉淀，在固体培养基中呈现为白色沉淀，出现透明圈即微生物对；磷酸钙进行了解磷的作用，即为本实施例中需要的微生物)，将所有透明圈的全部挑出，接种至传代培养基上在30℃条件下进行传代扩大培养，传代培养后获得液体即为解磷菌剂。
实施例2
选取广东凡口铅锌矿区自然生长的植物醉鱼草的根际土壤风干处理获得干燥土，将干燥土按照1:8的质量比加入到蒸馏水中，100rpm下震荡30min后4000rpm条件下离心10min，在121℃的条件下灭菌20min后得到的液体即为浸提液。获得浸提液。
称取原料蛋白胨、牛肉浸膏、氯化钠和蒸馏水，配制成蛋白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，氯化钠5g/L，pH为7.4-7.6的富集培养基；量取原料浸提液并称取蛋白胨、葡萄糖、磷酸钙、硫酸镁、琼脂和蒸馏水，配制成蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸钙10g/L，硫酸镁0.5g/L，浸提液40ml/L，琼脂20g/L，pH为7.2的培养基，在115℃条件下灭菌30min获得选择培养基；称取蛋白胨、葡萄糖、磷酸钙、硫酸镁和蒸馏水配置成蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸钙10g/L，硫酸镁0.5g/L，pH为7.2的培养基，在115℃条件下灭菌30min获得传代培养基。
称取1g新鲜的根际土壤，置于含有140ml富集培养基的玻璃三角瓶中，置于摇床上在100rpm，30℃的富集条件下震荡培养24h，吸取震荡悬浮液12ml接种至装有140ml培养基的三角瓶中进行第二次富集培养，接种后放入摇床上在相同条件下继续震荡培养24h，静置获取富集培养基的上清液为细菌富集液。
取细菌富集液1ml进行以10倍梯度进行稀释，最低稀释至106倍，并取每一个稀释梯度的稀释液200μl，均匀的涂抹在选择培养基上，每个稀释梯度三个平板，在30℃条件下培养培养至每个培养基平板出现透明圈(磷酸钙为不可溶的沉淀，在固体培养基中呈现为白色沉淀，出现透明圈即微生物对；磷酸钙进行了解磷的作用，即为本实施例中需要的微生物)，将所有透明圈的全部挑出，接种至传代培养基上在30℃条件下进行传代扩大培养，传代培养后获得液体即为解磷菌剂。
实施例3
选取广东凡口铅锌矿区自然生长的植物醉鱼草的根际土壤风干处理获得干燥土，将干燥土按照1:12的质量比加入到蒸馏水中，100rpm下震荡30min后4000rpm条件下离心10min，在121℃的条件下灭菌20min后得到的液体即为浸提液。
称取原料蛋白胨、牛肉浸膏、氯化钠和蒸馏水，配制成蛋白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，氯化钠5g/L，pH为7.4-7.6的富集培养基；量取原料浸提液并称取蛋白胨、葡萄糖、磷酸钙、硫酸镁、琼脂和蒸馏水，配制成蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸钙10g/L，硫酸镁0.5g/L，浸提液40ml/L，琼脂20g/L，pH为7.2的培养基，在115℃条件下灭菌30min获得选择培养基，称取蛋白胨、葡萄糖、磷酸钙、硫酸镁和蒸馏水配置成蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸钙10g/L，硫酸镁0.5g/L，pH为7.2的培养基，在115℃条件下灭菌30min获得传代培养基。
称取3g新鲜的根际土壤，置于含有160ml富集培养基的玻璃三角瓶中，置于摇床上在100rpm，30℃的富集条件下震荡培养24h，吸取震荡悬浮液8ml接种至装有140ml培养基的三角瓶中进行第二次富集培养，接种后放入摇床上在相同条件下继续震荡培养24h，静置获取富集培养基的上清液为细菌富集液。
取细菌富集液1ml进行以10倍梯度进行稀释，最低稀释至106倍，并取每一个稀释梯度的稀释液200μl，均匀的涂抹在选择培养基上，每个稀释梯度三个平板，在30℃条件下培养培养至每个培养基平板出现透明圈(磷酸钙为不可溶的沉淀，在固体培养基中呈现为白色沉淀，出现透明圈即微生物对；磷酸钙进行了解磷的作用，即为本实施例中需要的微生物)，将所有透明圈的全部挑出，接种至传代培养基上在30℃条件下进行传代扩大培养，传代培养后获得液体即为解磷菌剂。
应用例1
根据实施例1-3的方法制备的菌剂进行细菌种类分析：提取菌剂DNA后，采用带标签(barcode)的引物对515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)扩增16SrRNA片段，利用Miseq高通量测序获得扩增子序列，在RDP数据库比对获得OTU分类，分析得到其组成为假单胞菌、寡养单胞菌、泛菌、芽孢杆菌、肠杆菌、其它。其中，以实施例1得到的菌剂做具体的阐述，其中，将实施例1获得解磷菌剂，利用UPARSE软件对扩增子进行聚类分析获取OTU丰度表格，获得细菌种类及丰度比分别为假单胞菌13.2％、寡养单胞菌20.4％、泛菌22.3％、芽孢杆菌35.7％、肠杆菌8.1％、其它0.3％。
应用例2
分别配置并稀释获得浓度为0、100、250、500、750、1000、1250、1500、1750、2000mg/L的铅重金属溶液、锌重金属溶液、镉重金属溶液，将选择培养基中的浸提液分别替换成上述配置的不同浓度的铅重金属溶液、锌重金属溶液或镉重金属溶液，其他原料和原料浓度保持不变，获得培养基，将实施例1传代培养获得的解磷菌剂接种至上述培养基上，观测菌剂在不同重金属以及不同重金属浓度培养基中的生长情况，其结果如表2所示。
表2解磷菌剂在不同浓度重金属培养基中的生长情况
Figure BDA0002665322990000071
Figure BDA0002665322990000081
由表2可知，本发明获得的解磷菌剂在含有较高浓度的铅、镉、锌重金属培养基中均生长良好，其中对铅离子的耐受程度可达1500mg/L，对镉离子的耐受程度最高可达1000mg/L，在锌离子中耐受程度最强，可至2000mg/L以上。
应用例3
分别配置并稀释获得浓度为100、500、1000、2000mg/L的铅重金属溶液和锌重金属溶液，另配置两个混合重金属溶液，其浓度为：Zn2+2000mg/L+Pb2+100mg/L、Zn2+2000mg/L+Pb2+500mg/L，配置蛋白胨、牛肉浸膏、氯化钠浓度分为10g/L、3g/L、5g/L的培养基，并分别加入等量上述配置的铅重金属溶液、锌重金属溶液和混合重金属溶液，每组配置两个培养基，向每组的两个培养基分别加入不同浓度的磷酸钙，分别为10g/L、20g/L，接种实施例1获得的解磷菌剂，培养5天后，采用Olsen法(pH8.50.5mol/LNaHCO3浸提-钼锑抗比色法)测定各培养基中有效磷含量，如表3所示。
表3解磷菌剂在不同浓度重金属条件下的解磷效率
Figure BDA0002665322990000082
Figure BDA0002665322990000091
由表3可知，该解磷制剂在较高重金属浓度下的解磷效果良好，在铅浓度达到1000mg/L时，解磷效率可达50％以上，在锌离子浓度为2000mg/L时，解磷效率可达62％以上，且在铅锌离子浓度同时存在且浓度较大时，仍具有良好的解磷效果，因此，本发明获得的解磷菌剂不仅对重金属离子具有较高的耐受性，同时能够在重金属浓度条件下体现良好的解磷效率，可应用于重金属矿区土壤的改良制剂，尤其是铅锌矿区土壤的改良剂。
以上所述实施例，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种解磷菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
选取铅锌矿区自然生长的植物根际土壤进行风干，并按照固液比为1：8-12的质量比加入至蒸馏水中，震荡处理后离心取上清液，并进行灭菌处理获得浸提液；所述铅锌矿区为广东凡口铅锌矿区；
以蛋白胨、牛肉浸膏、氯化钠和蒸馏水为原料配制并灭菌富集培养基，以所述浸提液、蛋白胨、葡萄糖、磷酸钙、硫酸镁、琼脂和蒸馏水为原料配制并灭菌获得选择培养基；以蛋白胨、葡萄糖、磷酸钙、硫酸镁和蒸馏水为原料配制并灭菌获得传代培养基；
将1-3g所述根际土壤加入至140-160ml，所述富集培养基进行两次富集培养，获得细菌富集液；
将所述细菌富集液进行稀释后涂布至所述选择培养基上进行选择培养获得透明圈菌斑，并将所述透明圈菌斑接种至传代培养基上进行传代培养，传代培养完成后的液体即为解磷菌剂。
2.根据权利要求1所述的解磷菌剂制备方法，其特征在于，所述震荡处理后离心取上清液，并进行灭菌处理获得浸提液的步骤具体包括：
将所述植物根际土壤风干后加入到蒸馏水中混合，在转速为100-120rpm条件下震荡25-35min后，在4000rpm条件下离心8-10min，取上清液，在121℃的条件下灭菌20min后得到的液体即为浸提液。
3.根据权利要求1所述的解磷菌剂制备方法，其特征在于，所述富集培养基中各原料的浓度为：蛋白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，氯化钠5g/L，pH为7.4-7.6。
4.根据权利要求1所述的解磷菌剂制备方法，其特征在于，所述选择培养基中各原料的浓度为：蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸钙10g/L，硫酸镁0.5g/L，浸提液40ml/L，琼脂20g/L，pH为7.2。
5.根据权利要求1所述的解磷菌剂制备方法，其特征在于，所述传代培养基中各原料的浓度为：蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸钙10g/L，硫酸镁0.5g/L，pH为7.2。
6.根据权利要求1所述的解磷菌剂制备方法，其特征在于，所述将1-3g所述根际土壤加入至140-160ml所述富集培养基进行两次富集培养，获得细菌富集液步骤具体包括：
将1-3g所述根际土壤加入至140-160ml所述富集培养基中，在28-32℃转速为100rpm条件下震荡培养20-26h，获得富集混悬液；
将8-12ml所述富集混悬液加入至140-160ml所述富集培养基中，在28-32℃转速为100rpm条件下震荡培养20-26h，静置获取富集培养上清液即为细菌富集液。
7.根据权利要求1所述的解磷菌剂制备方法，其特征在于，所述选择培养和传代培养的培养条件为28-32℃。
8.一种解磷菌剂，其特征在于，所述解磷菌剂按照权利要求1-7任意所述的解磷菌剂制备方法获得。
9.权利要求1-7任意一项所述方法制备的解磷菌剂或权利要求8所述的解磷菌剂在铅锌尾矿矿区土壤修复中的应用。
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