CN111423996A - 一种复合菌剂、其制备方法及在土壤修复领域的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于土壤重金属修复技术领域，具体涉及一种复合菌剂、其制备方法及在土壤修复领域的应用。本发明提供了2株具有土壤重金属修复作用的天神芽孢杆菌，1株枯草芽孢杆菌，1株贝莱斯芽孢杆菌，本发明的菌株是从电镀厂周边土壤、水样、植物等材料中，通过筛选、纯化及鉴定等技术，筛选出具有高效吸附土壤重金属镉、铅的有益菌株，对菌株进行安全试验、发酵条件的研究，并进行复方配伍，经盆栽及大田试验验证等，提供了一种新的微生态制剂—土壤重金属修复菌剂。

Description

一种复合菌剂、其制备方法及在土壤修复领域的应用

技术领域

本发明属于土壤重金属修复技术领域，具体涉及一种由天神芽孢杆菌 (Bacillustianshenli strain)S5、天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenli)P46、贝莱斯芽孢 杆菌(Bacillus velezensis)S3、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)P30构成的复合微 生物菌剂、所述复合菌剂的制备方法，以及该复合菌剂在土壤重金属修复领域的 应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而 不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员 所公知的现有技术。

农田重金属污染主要来源于采矿废渣、农药、废水、污泥和大气沉降等， 过量的重金属沉积会导致植物生理功能紊乱、营养失调，镉、铅等元素在作物籽 实中富集系数较高，超过食品卫生标准，会影响作物生长、发育和产量。重金属 污染物在土壤中移动性很小，不易随水淋滤，不为微生物降解，通过食物链进入 人体后，潜在危害极大，应特别注意防止重金属对农田土壤的污染。研究显示， 我国镉污染农田土壤面积已达2000万hm²，约占总耕地面积的1/6,全国共11 个省25个地区的农田受到不同程度的Cd、Pb污染。我国金属矿产资源丰富， 铅锌储量居全球第二。矿石的采选冶等工矿活动向环境排放了大量含重金属的废水、废气和废渣，这种情况引起的土壤中铅、镉等元素的污染引起了国内外专家 学者的广泛关注。

微生物在重金属污染土壤修复中具有成本低、能耗低、无二次污染、效率 高等特点。同时部分微生物自身良好适应能力、细胞机制，也可以吸收多种类型 重金属在缩短修复时间的同时，也可以达到良好的重金属土壤转化效果。同时微 生物可以参与调控土壤中养分循环，提高土壤重金属转化速度。所以利用一些真 菌、细菌、放线菌等修复重金属污染土壤具有很大的潜力。在众多种类的微生物 中，硫酸盐还原菌和解磷菌以较高的土壤重金属耐受性和修复重金属的潜力而成 为现今研究微生物修复土壤重金属的热点。

CN108752138A中提供了一种用于农田重金属镉、铅治理的复合修复剂，包 括钝化剂、土壤调理剂及微生物菌剂的成分，该复合修复剂通过将重金属镉固化 在药剂和土壤中，通过减少镉的迁移性以降低重金属对农作物的吸收作用。发明 人认为，上述方案提供的修复剂并未能彻底解决重金属残留的问题。目前相关研 究表明，芽孢杆菌(Bacillus)具有良好的环境兼容性，广泛地用于土壤重金属 Cd、Pb污染修复。目前用于土壤重金属治理的复合修复剂多采用菌剂与化学试 剂或菌剂与植物配合进行作用。发明人认为，引入化学成分进行土壤修复容易带 来新的环境问题，可能不利于土壤长期稳定。

发明内容

针对上述研究背景，本发明提供了一种复合微生物菌剂，由天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenli strain)S5、天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenli)P46、贝莱斯芽孢 杆菌(Bacillus velezensis)S3及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)P30组成，该复合菌剂具有良好的重金属修复作用及土壤稳定性。

基于上述技术效果，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供一种复合菌剂，所述复合菌剂为天神芽孢杆菌 (Bacillustianshenli strain)S5、天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenli)P46、贝莱斯芽孢 杆菌(Bacillus velezensis)S3及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)P30或所述菌株的 培养物；

所述天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenli strain)S5，已于2019年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：中国，武汉，武汉大学， 其生物保藏号为：CCTCC NO:M20191091；

所述天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenli)P46，已于2020年3月2日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，其生物保藏号为：CGMCC NO.19444；

所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S3，已于2020年3月2日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，其生物保藏号为：CGMCC NO.19445；

所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)P30，已于2020年3月2日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，其生物保藏号为：CGMCC NO.19443。

本发明的S3、S5、P30、P46是从受重金属污染的土壤和水体中筛选出来的， 经试验测试表明，其是非常优秀的重金属吸附降解菌种。进入土壤和水体后，除 了将重金属转移到自身体内或螯合在菌体表面固定外，在其生长繁殖过程中还能 够分泌产生脂多糖、多聚糖、糖蛋白等细胞外物质，从而达到络合或沉淀重金属 离子的作用，提高重金属离子的吸附效率，降低可交换态重金属离子浓度，可以 用于重金属土壤修复微生态制剂的生产，是4株极具研究开发价值的菌株。

本发明第二方面，提供第一方面所述复合菌剂的制备方法，所述制备方法 包括如下步骤：将天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenli strain)S5、天神芽孢杆菌 (Bacillustianshenli)P46、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S3及枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)P30分别发酵得到发酵液，干燥发酵液获得菌粉，将上述菌株的 菌粉与基质进行复配得到。

本发明第三方面，提供第一方面所述复合菌剂在重金属土壤修复领域的应 用。

以上一个或多个技术方案的有益效果如下：

1.所述天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenli strain)S5、天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenli)P46、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S3及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)P30筛选自重金属污染土壤和水体，经解磷、硫酸盐还原实验及重金属修 复实验等验证是非常优秀的重金属吸附降解菌种，将其复合应用于土壤中重金属 修复，特别对于铅及镉成分具有良好的清除效果，并且不影响土地稳定性。

2.上述四种菌株的具有良好的复配效果，相比其他解磷菌与硫酸盐还原的配合具有更好的重金属离子修复效果，显示出良好的协同作用。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明 的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例3中所述各组复配菌株对重金属镉、铅修复液体摇瓶试验结 果图；

其中，图1A为重金属镉降解率直方图；

图1B为重金属铅降解率直方图。

图2为实施例7中所述产品使用前后土壤物理化学性质的变化图；

其中图2A为土壤pH值变化情况直方图；

图2B为土壤中有机质变化情况直方图；

图2C为土壤中碱解氮变化情况直方图；

图2D为土壤中速效磷变化情况直方图。

图3为实施例7中所述产品使用前后土壤4种形态镉的含量变化图；

其中，图3A为可交换态镉含量变化直方图；

图3B为可还原态镉含量变化直方图；

图3C为可氧化态镉含量变化直方图；

图3D为残渣态镉含量变化直方图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。 除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普 通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限 制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出， 否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使 用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或 它们的组合。

正如背景技术所介绍的，针对现有技术中存在的不足，本发明提出了一种具 有重金属土壤修复作用的复合菌剂。

本发明的技术方案中，第一方面，提供一种复合菌剂，所述复合菌剂为天神 芽孢杆菌(Bacillus tianshenli strain)S5、天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenli)P46、 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S3及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)P30或 所述菌株的培养物；

所述天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenli strain)S5，已于2019年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌珞珈 山，其生物保藏号为：CCTCC NO:M20191091；

所述天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenli)P46，已于2020年3月2日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，其生物保藏号为：CGMCC NO.19444；

所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S3，已于2020年3月2日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，其生物保藏号为：CGMCC NO.19445；

所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)P30，已于2020年3月2日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，其生物保藏号为：CGMCC NO.19443。

所述天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenli strain)S5具有SEQ ID NO:1所示的16S rDNA序列。

所述天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenli)P46具有SEQ ID NO:2所示的16S rDNA序列。

所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S3具有SEQ ID NO:3所示的16SrDNA序列。

所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)P30具有SEQ ID NO:4所示的16S rDNA序列。

优选的，所述复合菌剂的培养基为：玉米粉5～7.0％；豆粕3～5％；硫酸铵 0.2～0.5％；碳酸氢钠0.4～0.8％；碳酸钙0.05～0.15％，余量为水(所述百分数为 质量百分数)。

进一步优选的，所述培养基pH为6.7～6.9。

进一步优选的，所述培养基在115～126℃条件下灭菌，时间为25～35min。

本发明第二方面，提供第一方面所述复合菌剂的制备方法，所述制备方法 包括如下步骤：将天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenli strain)S5、天神芽孢杆菌 (Bacillustianshenli)P46、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S3及枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)P30分别发酵得到发酵液，干燥发酵液获得菌粉，将上述菌株的 菌粉与基质进行复配得到。

优选的，所述发酵包括斜面培养、一级种子培养、扩大培养及发酵罐培养， 待发酵罐中芽孢率达到90％以上时，收集发酵液。

进一步优选的，所述斜面培养在37℃下培养24～30h。

进一步优选的，所述一级种子培养具体方式如下：在无菌条件下用接种环 取一环接种于50mL～100mL种子液体培养基中，在37℃条件下，180rpm震荡 培养18～24h，制得一级种子液。

进一步优选的，所述扩大培养具体方式如下：以1％(v/v)的接种量，将一 级种子液接于500mL～1000mL种子液体培养基中，在37℃条件下，震荡培养 12～14h，制得二级种子液。

进一步优选的，所述发酵罐培养方式如下：以1％(v/v)的接种量，将二级 种子液接于液体发酵培养基中，于37℃条件下，通气培养28～34h；

优选的，所述干燥采用喷雾干燥的方式。

进一步优选的，向发酵液中加入0.67～1.00％(质量百分数)的轻质碳酸钙 之后进行喷雾干燥。

优选的，所述基质包括纳米改性活性炭及腐殖酸钠。

本发明第三方面，提供第一方面所述复合菌剂在土壤修复领域的应用。

优选的，所述在重金属修复领域的应用包括在制备土壤、污水重金属修复剂 中的应用。

进一步优选的，所述土壤、污水金属修复剂为重金属镉或铅修复剂。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结 合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例一、菌种的筛选

1、材料与方法

1.1样品：电镀厂周边土壤及水样等11份样品材料。

1.2筛选培养基：

菌株营养培养基：NB合成培养基，NB培养基的基础上加入1.5％的琼脂即 为固体培养基。

解磷菌菌株的筛选培养基(NBRIP)：葡萄糖1.0％、Ca₃(PO₄)₂ 0.5％、MgCl₂ 0.5％、蛋白胨0.5％、琼脂粉2.0％，pH7.2～7.4，121℃，灭菌30min。

硫酸盐还原菌菌株的筛选培养基：磷酸氢二钾0.05％、无水氯化钙0.01％、 氯化铵0.1％、七水合硫酸镁0.2％、七水合硫酸亚铁0.05％、氯化钠0.1％、抗坏 血酸0.05％、L-Cys半胱氨酸0.05％、无水硫酸钠0.5％、乳酸钠溶液0.65％、琼 脂粉2.0％，pH6.8～7.0，121℃，灭菌30min。

1.3样品初筛：

解磷菌的初筛：从电镀厂取得的土样及水样中取样1克(1ml)，混合放入 装有99ml无菌生理盐水的三角瓶中，恒温摇床30℃，180转/分，震荡培养2h。 获取悬浮液后做连续稀释，取1ml做10^-3-10^-5稀释，取10^-3-10^-5稀释液各0.1ml 加入到NBRIP培养基平板上进行稀释涂布分离单菌落，挑取有解磷圈的单菌落 进行分离纯化并斜面保存于冰箱中备用。

硫酸盐还原菌的初筛：从电镀厂取得的土样及水样中取样1克(1ml)，混 合放入装有99ml无菌生理盐水的三角瓶中，恒温摇床30℃，180转/分，震荡培 养2h。获取悬浮液后做连续稀释，取1ml做10^-3-10^-5稀释，取10^-3-10^-5稀释液各 0.1ml加入到硫酸盐还原菌培养基平板上进行稀释涂布分离单菌落，挑取生长繁 殖快的单菌落进行分离纯化并斜面保存于冰箱中备用。

1.4菌种复筛：

解磷菌的复筛：将初筛得到的解磷菌分别接种到装有NBRIP液体培养基的 250mL三角瓶内(装液量50mL)，转速180rpm，温度37℃，培养24h，观察培 养基的颜色变化及活菌数并记录时间。

硫酸盐还原菌的复筛：将初筛得到的各菌株分别接种到有硫酸盐还原菌液体 筛选培养基的250mL三角瓶内(装液量50mL)，转速180rpm，温度37℃，培 养24h，观察培养基的颜色变化及活菌数并记录时间。

1.5仪器：恒温水浴锅；培养箱；光学显微镜。

2、结果

2.1初筛结果：见表1，从11个样品中，共分离了78个菌株，通过解磷透明圈 直径比与选择培养扩增速度的筛选，共初步筛选了17株解磷菌和61株硫酸还原 菌菌株。

表1初筛结果

2.2复筛结果：见表2，P30、P46、S3、S5菌株对镉、铅的吸附效率最好。

表2复筛结果

注：1、—：表示测不到；2、P7：为从土壤中筛选的脱氟不动杆菌；3、P10：为从土壤中筛选的克雷伯氏杆菌；4、P30：为从污水中筛选出的枯草芽孢杆菌；5、P46：为从土壤中 筛选的天神芽孢杆菌；6、P51：为从污水中筛选出的枯草芽孢杆菌；7、S3：为从土壤中筛 选出的贝莱斯芽孢杆菌；8、S4：为从土壤中筛选的天神芽孢杆菌；9、S5：为从污水中筛 选出的天神芽孢杆菌；10、S9：从土中筛选出的东湖假单胞菌。

实施例二、菌种的鉴定及安全试验

1、材料与方法

1.1菌种：从电镀厂土壤及水样等样品中分离得到的微生物经初筛、复筛 后，共筛选出4株重金属降解性能较高的菌株，编号分别是P30、P46、S3和S5。

1.2细菌的形态鉴定及分子鉴定：除特别说明外，一般形态及分子试验均 参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第9版)和《微生物学实验手册》进行。

1.3安全试验：细菌的植物毒性检测是利用“珍珠”西红柿种子与“水晶”生菜 种子进行的。将种子在2％浓度的单一菌液、混合菌液(1:1:1)以及蒸馏水(控 制组)中浸泡10分钟。然后用蒸馏水冲洗，均匀放置于铺好湿滤纸的培养皿中， 放入恒温培养箱，温度设置为24℃。3-4天后记录出芽率，10天后分别记录实 验组与对照组烘干后幼苗根和茎的重量。通过观察种子发芽的延迟程度和幼苗的 生长情况，判断植物毒性。

2、结果

2.1菌种的鉴定：经细菌的形态鉴定，S5、P46属于芽孢杆菌属，细胞呈 杆状，革兰氏阳性菌，端生芽孢，无鞭毛。符合天神芽孢杆菌特征，初步认定为 天神芽孢杆菌；S3属于芽孢杆菌属，菌落呈白色蜡状，菌落形态为边缘不整齐， 平整，干燥，无皱褶，菌落较大，有运动性，初步认定为贝莱斯芽孢杆菌；P30 属于芽孢杆菌属，单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛， 能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中 央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色,初 步认定为枯草芽孢杆菌。

挑取单菌落接种至NB液体培养基中，37℃，180rpm震荡培养24h，取1-5ml 菌液利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA。16S rRNA通用引 物8f(5'-agagtttgatcctggctcag-3')和1492r(5'-ggttaccttgttacgactt-3')对该4株菌株基 因组DNA扩增并送至上海生工生物公司测序。BLAST软件比对分析该4株菌株。

综合测序与形态鉴定结果，确定菌株S5、P46属于天神芽孢杆菌，S3属于 贝莱斯芽孢杆菌，P30属于枯草芽孢杆菌。

2.2安全试验：

表3所筛选细菌对西红柿和生菜种子的发芽率及幼苗生长影响

由表3可知，P30、P46、S3、S5四株菌对西红柿及生菜种子的发芽率均具 有明显的促进作用，且对西红柿及生菜幼苗由一定的促生长作用。

实施例三、各菌株对重金属镉、铅修复液体摇瓶试验

1、材料和方法

1.1菌种：P30、P46、S3、S5

1.2培养基

NB液体合成培养基，121℃，灭菌30min。

1.3重金属镉、铅含量测定方法及仪器

测定方法：

(1)配制NB液体培养基，加入重金属镉(使培养基的重金属镉含量为5mg/L) 灭菌备用。

配制NB液体培养基，加入重金属铅(使培养基的重金属铅含量为50mg/L) 灭菌备用。

(2)设置8个处理组，分别接种对应菌株菌液1ml，6个处理分别为：

处理1：只接种P30和S3；

处理2：只接种P30和S5；

处理3：只接种P46和S3；

处理4：只接种P46和S5；

处理5：只接种P30和P46；

处理6：只接种S3和S5；

处理7：接种P30、P46、S3、S5；

处理8：接种P30、P46、S3、S5，同时加入3％纳米吸附粘土，以等量的无菌 水替代接菌液作为实验空白。

(3)对接种后的摇瓶37℃，180rpm震荡培养3天。

(4)将培养基通过0.45μm的微孔滤膜，分离菌体与培养基，用石墨炉原子吸收 仪测定滤液中镉、铅的含量。

仪器及测定标准：

土壤重金属镉、铅含量测定使用石墨炉原子吸收分光光度法，具体操作参考GB/T17141。

2试验内容与结果

1)初始重金属镉的浓度为5mg/L

结论：

处理1的重金属镉实际浓度为0.5700mg/kg,重金属实际降解率为88.60％；

处理2的重金属镉实际浓度为0.7108mg/kg,重金属实际降解率为85.78％。

处理3的重金属镉实际浓度为0.6320mg/kg,重金属实际降解率为87.36％。

处理4的重金属镉实际浓度为0.6238mg/kg,重金属实际降解率为87.52％。

处理5的重金属镉实际浓度为1.8325mg/kg,重金属实际降解率为63.35％。

处理6的重金属镉实际浓度为0.8255mg/kg,重金属实际降解率为83.49％。

处理7的重金属镉实际浓度为0.4138mg/kg,重金属实际降解率为91.72％。

处理8的重金属镉实际浓度为0.3838mg/kg,重金属实际降解率为92.32％。

2)初始重金属铅的浓度为50mg/L

结果：

处理1的重金属铅实际浓度为4.9825mg/L,重金属实际降解率为90.04％；

处理2的重金属铅实际浓度为5.2225mg/L,重金属实际降解率为89.56％；

处理3的重金属铅实际浓度为5.1025mg/L,重金属实际降解率为89.80％；

处理4的重金属铅实际浓度为4.6625mg/L,重金属实际降解率为90.68％；

处理5的重金属铅实际浓度为7.9820mg/L,重金属实际降解率为84.04％；

处理6的重金属铅实际浓度为6.5725mg/L,重金属实际降解率为86.86％；

处理7的重金属铅实际浓度为4.6720mg/L,重金属实际降解率为90.66％；

处理8的重金属铅实际浓度为4.2245mg/L,重金属实际降解率为91.55％；

结论：

由上述数据可以看出，2株解磷菌复合后对重金属镉的吸附处理效果为 63.35％，对重金属铅的吸附处理效果为84.04％；2株硫酸盐还原菌复合后对重 金属镉的吸附处理效果为83.49％，对重金属铅的吸附处理效果为86.86％；1株 解磷菌和1株硫酸盐还原菌复配后对重金属镉的吸附处理效率在85.78％-88.60％ 之间，对重金属铅的吸附处理效率在89.56％-90.68％之间。由此可以看出解磷菌 与硫酸盐还原菌复配后对重金属镉的吸附效率均高于单类菌株的修复效率。

由此可初步看出：硫酸盐还原菌与解磷菌在重金属镉、镉吸附作用上具有明 显的协同作用，将两类菌株复配后对重金属铅、镉的吸附修复效率有明显的提高。

实施例四重金属修复盆栽试验

1土壤重金属镉、铅含量测定方法：

土壤重金属总镉、总铅含量测定使用石墨炉原子吸收分光光度法，具体操作 参考GB/T17141；

土壤重金属镉、铅不同形态含量的测定方法参考BCR连续提取法。

BCR连续提取法是利用国际标准中规定的不同提取剂对土壤Cd²⁺、Pb²⁺形 态进行提取，并对提取液进行定量检测，通过对比BCR法提取土壤中的不同形 态Cd²⁺、Pb²⁺含量，可简单分析微生物的修复效果和最终修复的稳定性，

2、重金属修复盆栽试验方法

以接种环接硫酸盐还原菌S3、S5，解磷菌P30、P46分别于LB培养基中， 以160rpm，37℃恒温培养2天后，将得到的细菌菌体团聚物制备成3.0-5.0×10⁹ CFU/mL细菌悬液。将不同浓度梯度的Cd污染土壤以200g/盆分装于各个花盆中， 设置四组实验组，分别为未加菌组(CK组)，单独加硫酸盐还原菌(S组，即S3 与S5以1:1比例混合)，单独加解磷菌(P组，即P30与P46以1:1比例混合)和硫 酸盐还原菌和解磷菌联合修复组(SP组，S3、S5、P30、P46以1:1:1:1比例混合)。 CK组不加细菌，在S组花盆中加入1mL硫酸盐还原菌菌液，P组加入1mL解 磷菌菌液，SP组中各加入0.5mL硫酸盐还原菌和解磷菌，向各组中加水至土壤 含水率为60％-70％，然后将所有花盆中的土样以木铲搅拌均匀，保证加入的细 菌在土壤中分布均匀，每组三个平行。待细菌加入土壤一个月后，测量土壤可交 换态、可氧化态、可还原态及残渣态重金属镉、铅的含量。土壤重金属初始可交 换态含量设置为2ml/kg、5ml/kg、10ml/kg、20ml/kg、50ml/kg。

3、试验内容与结果

表4盆栽试验一月后取样4种价态重金属镉含量测定结果

表5盆栽试验一月后取样4种价态重金属铅含量测定结果

结论：

(1)初始添加重金属镉浓度为2mg/kg时，使用重金属修复微生态制剂后，可 交换态含量为0.08mg/kg,修复效率达到96％；初始添加重金属铅浓度为2mg/kg 时，使用重金属修复微生态制剂后，可交换态含量为0.09mg/kg，修复效率达到 95.5％；

(2)初始添加重金属镉浓度为5mg/kg时，使用重金属修复微生态制剂后，可 交换态含量为0.039mg/kg；修复效率达到99.22％；初始添加重金属铅浓度为 5mg/kg时，使用重金属修复微生态制剂后，可交换态含量为0.035mg/kg；修复 效率达到99.30％；

(3)初始添加重金属镉浓度为10mg/kg时，使用重金属修复微生态制剂后， 可交换态含量为0.082mg/kg；修复效率达到99.18％；初始添加重金属铅浓度为 10mg/kg时，使用重金属修复微生态制剂后，可交换态含量为0.081mg/kg；修复 效率达到99.19％；

(4)初始添加重金属镉浓度为20mg/kg时，使用重金属修复微生态制剂后， 可交换态含量为0.176mg/kg；修复效率达到99.12％；初始添加重金属铅浓度为 20mg/kg时，使用重金属修复微生态制剂后，可交换态含量为0.156mg/kg；修复 效率达到99.22％；

(5)初始添加重金属镉浓度为50mg/kg时，使用重金属修复微生态制剂后， 可交换态含量为0.686mg/kg；修复效率达到98.63％；初始添加重金属铅浓度为 50mg/kg时，使用重金属修复微生态制剂后，可交换态含量为0.683mg/kg；修复 效率达到98.63％。

实施例五重金属修复菌剂稳定性试验

针对实施例四中修复后的四组土壤样品(50mg/kg CK、50mg/kgSP)均以 2g为一组分成若干组份加入50mL聚乙烯离心管中。为了研究不同环境条件对 已改良土壤成分的影响，进一步探讨微生物修复土壤重金属污染对不同条件的稳 定性。第一组用以判断pH对修复稳定性的影响，具体步骤为：以NaOH和HCl 调节不同pH 3-9的酸碱溶液40mL加入管中，以150rpm，室温摇18±2h后，4000g 离心15min，测量土壤上清液中的Cd²⁺含量。第二组用以判断不同金属阳离子对 修复稳定性的影响，具体步骤为：以分析纯NaNO₃、KNO₃、Ca(NO₃)₂药品溶于 去离子水中制成0.01mol/L的Na⁺，K⁺和Ca²⁺金属阳离子盐溶液40mL加入瓶中， 以150rpm，摇18±2h后，4000g离心15min，测量土壤上清液中的Cd²⁺含量。

表6 pH对修复后土壤稳定性的影响

表7重金属阳离子对修复后土壤稳定性的影响

表6结果说明，土壤酸碱性会一定程度上改变已形成的稳定性Cd形态，尤 其在H⁺大量存在时，CdS或Cd₂(PO₄)₃等生成产物可能会被氧化或分解，导致 微生物修复结果的稳定性下降，二次释放回环境中。在碱性环境中，微生物修复 产物仍能保持稳定，不易被洗脱出释放至环境中。SP组相对CK组均表现出明 显降低活性的钝化效果。

从对比三种金属阳离子对土壤稳定性的结果来看，Ca²⁺溶液能够提取的Cd²⁺含量最多，这可能是由于Ca²⁺与Cd²⁺拥有相同的化合价，在进行离子交换时， 可能发生晶格交换，配位络合等将Cd²⁺从稳定态向可交换态活化的现象，SP组 相对CK组均表现出降低活性的钝化效果。

土壤酸碱及金属阳离子均可导致微生物修复结果的稳定性下降，但对稳定性 的影响不大，在实际应用中可忽略不计。

实施例六培养基及培养条件的优化

P30、P46、S3、S5四株菌株培养基及培养条件的优化方法一致，以S5菌株 为例说明：

为了优化用于培养菌株S5的主要营养培养基的组成，分别选择以下4种培 养基对S5进行发酵培养。倍数稀释计数法对菌液进行计数。

表8、天神芽孢杆菌S5在不同组分的营养培养基上的活菌数

表注：

1、1#培养基的组成成分:甘蔗糖蜜4.0％；豆粕2.0％；K₂HPO₄ 0.7％；KH₂PO₄0.3％；(NH)₂SO₄ 0.15％；柠檬酸钠0.05％；MgSO₄·7H₂O 0.01％，余量为水；pH 7.0-7.2。

2、甘蔗糖蜜4.0％；豆粕2.0％；KH₂PO₄ 0.3％；(NH)₂SO₄ 0.15％；柠檬酸钠0.05％；MgSO₄·7H₂O 0.01％，MnSO₄0.05％；余量为水；pH 7.0-7.2。

3、甘蔗糖蜜4.0％；蛋白胨2.0％；K₂HPO₄ 0.7％；KH₂PO₄ 0.3％；(NH)₂SO₄ 0.15％；柠檬酸钠0.05％；MgSO₄·7H₂O 0.01％，余量为水；pH 7.0-7.2。

4、玉米粉6.0％；豆粕3.5％；硫酸铵0.3％；碳酸氢钠0.6％；碳酸钙0.1％； pH＝7.0

根据活菌数与芽孢数综合分析，最终确定培养基成分为：玉米粉6.0％；豆 粕3.5％；硫酸铵0.3％；碳酸氢钠0.6％；碳酸钙0.1％；其余为水；pH＝7.0。

将接种该菌株的培养基置于不同温度下摇床培养48h，依据菌液的浑浊程度， 镜检无杂菌，可确认在10～40℃环境中的菌株能够生长，且30～40℃环境下的 菌株生长最快。将接种该菌株的培养基置于不同初始pH值环境下摇床培养48h， 在pH值范围为3.5～8.5的环境中菌株能够生长，且在pH值为6.5～7.5的环境 中生长最快。置于37℃、pH值为6.8的条件下摇床培养，转速分别设置120rpm、 150rpm、180rpm，于第12、24、36、48、60h取培养液计数。如表9、表10：

表9天神芽孢杆菌S5培养条件的优化1

表10天神芽孢杆菌S5培养条件的优化2

最终确定天神芽孢杆菌S5最佳培养条件为：рН 7.0；温度为37℃，搅拌速度180r/min，培养时间48h。

实施例七、土壤重金属修复大田试验效果评价

试验选用镉超标的金银花、川芎药田各两块。每块地面积各一亩，分别作为 实验组和对照组。两个实验组使用由S3、S5、P30及P46以1:1:1:1比例复配而 成的菌剂，使用量为1kg/亩随水冲施，对照组正常浇水灌溉，每隔1个月取一次 土壤样品，测定土壤的总镉、可交换态镉、可氧化态镉、可还原态镉及残渣态镉 含量。并在用复合菌剂前后分别测定土壤的速效磷、碱解氮及有机质含量。实验 组金银花和川芎土壤的有机质、速效磷及碱解氮含量相比于对照组明显增加；实 验组金银花和川芎土壤的可交换态镉含量明显降低，对照组交换态镉含量变化不 明显。

表11初始土壤的物理化学性质

表12复合菌剂使用一月后土壤的物理化学性质

表13复合菌剂使用前后土壤4种形态镉的含量变化

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域 的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东碧蓝生物科技有限公司泰安巴夫巴夫农业科技有限公司

<120> 一种复合菌剂、其制备方法及在土壤修复领域的应用

<130> 2010

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1458

<212> DNA

<213> 天神芽孢杆菌 (Bacillus tianshenli strain)S5 16S rDNA

<400> 1

gtggcctgcg cgtgcctata catgcaagtc gagcgaatgg attaagagct tgctcttatg 60

aagttagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cccataagac tgggataact 120

ccgggaaacc ggggctaata ccggataata ttttgaactg catggttcga aattgaaagg 180

cggcttcggc tgtcacttat ggatggaccc gcgtcgcatt agctagttgg tgaggtaacg 240

gctcaccaag gcaacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga 300

gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt 360

ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggctttcggg tcgtaaaact ctgttgttag 420

ggaagaacaa gtgctagttg aataagctgg caccttgacg gtacctaacc agaaagccac 480

ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttat ccggaattat 540

tgggcgtaaa gcgcgcgcag gtggtttctt aagtctgatg tgaaagccca cggctcaacc 600

gtggagggtc attggaaact gggagacttg agtgcagaag aggaaagtgg aattccatgt 660

gtagcggtga aatgcgtaga gatatggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctttctggtc 720

tgtaactgac actgaggcgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt 780

ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agagggtttc cgccctttag tgctgaagtt 840

aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctgaaactca aaggaattga 900

cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta 960

ccaggtcttg acatcctctg aaaaccctag agatagggct tctccttcgg gagcagagtg 1020

acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1080

gagcgcaacc cttgatctta gttgccatca ttaagttggg cactctaagg tgactgccgg 1140

tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct 1200

acacacgtgc tacaatggac ggtacaaaga gctgcaagac cgcgaggtgg agctaatctc 1260

ataaaaccgt tctcagttcg gattgtaggc tgcaactcgc ctacatgaag ctggaatcgc 1320

tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380

gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgggg taacctttat ggagccagcc 1440

gcctaagtga cagagggg 1458

<210> 2

<211> 1458

<212> DNA

<213> 天神芽孢杆菌 (Bacillus tianshenli) P46 16S rDNA

<400> 2

acctggcggc gtgctataca tgcaagtcga gcgaatggat taagagcttg ctcttatgaa 60

gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc cataagactg ggataactcc 120

gggaaaccgg ggctaatacc ggataacatt ttgaaccgca tggttcgaaa ttgaaaggcg 180

gcttcggctg tcacttatgg atggacccgc gtcgcattag ctagttggtg aggtaacggc 240

tcaccaaggc aacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga 300

cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct 360

gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg ctttcgggtc gtaaaactct gttgttaggg 420

aagaacaagt gctagttgaa taagctggca ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg 480

ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttatcc ggaattattg 540

ggcgtaaagc gcgcgcaggt ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccacg gctcaaccgt 600

ggagggtcat tggaaactgg gagacttgag tgcagaagag gaaagtggaa ttccatgtgt 660

agcggtgaaa tgcgtagaga tatggaggaa caccagtggc gaaggcgact ttctggtctg 720

taactgacac tgaggcgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc 780

acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag agggtttccg ccctttagtg ctgaagttaa 840

cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct gaaactcaaa ggaattgacg 900

ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaatttgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960

aggtcttgac atcctctgac aaccctagag atagggcttc tccttcggga gcagagtgac 1020

aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080

gcgcaaccct tgatcttagt tgccatcatt aagttgggca ctctaaggtg actgccggtg 1140

acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac 1200

acacgtgcta caatggacgg tacaaagagc tgcaagaccg cgaggtggag ctaatctcat 1260

aaaaccgttc tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagct ggaatcgcta 1320

gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380

cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtggggta acctttttgg agccagccgc 1440

ctaagggtga caaaatgg 1458

<210> 3

<211> 1456

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌 (Bacillus velezensis)S3 16S rDNA

<400> 3

tgaaagtgcg gcgtgctata catgcaagtc gagcggacag atgggagctt gctccctgat 60

gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc 120

gggaaaccgg ggctaatacc ggatggttgt ctgaaccgca tggttcagac ataaaaggtg 180

gcttcggcta ccacttacag atggacccgc ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc 240

tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga 300

cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct 360

gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg ttttcggatc gtaaagctct gttgttaggg 420

aagaacaagt gccgttcaaa tagggcggca ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg 480

ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg 540

ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg 600

ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt 660

agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg 720

taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc 780

acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg ctgcagctaa 840

cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg 900

ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960

aggtcttgac atcctctgac aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg gcagagtgac 1020

aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080

gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg 1140

acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac 1200

acacgtgcta caatggacag aacaaagggc agcgaaaccg cgaggttaag ccaatcccac 1260

aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta 1320

gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380

cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtgaggta acctttatgg agccagccgc 1440

cgaaggtgac agattt 1456

<210> 4

<211> 1456

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)P30 16S rDNA

<400> 4

gcctggcggg gtgctataca tgcagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt 60

agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg 120

aaaccggggc taataccgga tgcttgattg aaccgcatgg ttcaattata aaaggtggct 180

tttagctacc acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc 240

accaaggcaa cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca 300

cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga 360

cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaaactctgt tgttagggaa 420

gaacaagtac cgttcgaata gggcggtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 480

aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg 540

cgtaaagcgc gcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg 600

agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag 660

cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta 720

actgacgctg aggcgcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac 780

gccgtaaacg atgagtgcta agtgttagag ggtttccgcc ctttagtgct gcagcaaacg 840

cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg 900

ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 960

gtcttgacat cctctgacaa ccctagagat agggcttccc cttcgggggc agagtgacag 1020

gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080

gcaacccttg atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac 1140

aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac 1200

acgtgctaca atgggcagaa caaagggcag cgaagccgcg aggctaagcc aatcccacaa 1260

atctgttctc agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt 1320

aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380

caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac cttttggagc cagccgccga 1440

aggtgaacag agaggg 1456

Claims (10)

1.一种复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂为天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenlistrain)S5、天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenli)P46、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)S3及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)P30或所述菌株的培养物；

所述天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenli strain)S5，已于2019年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山，其生物保藏号为：CCTCC NO:M20191091；

所述天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenli)P46，已于2020年3月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其生物保藏号为：CGMCC NO.19444；

所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S3，已于2020年3月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其生物保藏号为：CGMCC NO.19445；

所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)P30，已于2020年3月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其生物保藏号为：CGMCC NO.19443。

2.如权利要求1所述复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂的培养基为：玉米粉5～7.0％；豆粕3～5％；硫酸铵0.2～0.5％；碳酸氢钠0.4～0.8％；碳酸钙0.05～0.15％，余量为水。

3.如权利要求2所述复合菌剂，其特征在于，所述培养基pH为6.7～6.9；或所述培养基在115～126℃条件下灭菌，时间为25～35min。

4.权利要求1-3任一项所述复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：将天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenli strain)S5、天神芽孢杆菌(Bacillustianshenli)P46、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)S3及枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)P30分别发酵得到发酵液，干燥发酵液获得菌粉，将上述菌株的菌粉与基质进行复配得到。

5.如权利要求4所述复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述发酵包括斜面培养、一级种子培养、扩大培养及发酵罐培养，待发酵罐中芽孢率达到90％以上时，收集发酵液。

6.如权利要求5所述复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述斜面培养在37℃下培养24～30h；

或所述一级种子培养具体方式如下：在无菌条件下用接种环取一环接种于50mL～100mL种子液体培养基中，在37℃条件下，180rpm震荡培养18～24h，制得一级种子液；

或所述扩大培养具体方式如下：以1％的接种量，将一级种子液接于500mL～1000mL种子液体培养基中，在37℃条件下，震荡培养12～14h，制得二级种子液；

或所述发酵罐培养方式如下：以1％的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于37℃条件下，通气培养28～34h。

7.如权利要求5所述复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述干燥采用喷雾干燥的方式；优选的，向发酵液中加入0.67～1.00％的轻质碳酸钙之后进行喷雾干燥。

8.如权利要求4所述复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述基质包括纳米改性活性炭及腐殖酸钠。

9.权利要求1-3任一项所述复合菌剂在土壤修复领域的应用。

10.如权利要求9所述复合菌剂在土壤修复领域的应用，其特征在于，所述在重金属修复领域的应用包括在制备土壤、污水重金属修复剂中的应用；优选的，所述土壤、污水金属修复剂为重金属镉或铅修复剂。

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