CN110283811A - 利用Fe3O4磁性纳米粒子固定溶磷菌溶解中低品位磷矿的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用Fe3O4磁性纳米粒子固定溶磷菌溶解中低品位磷矿的方法。首先采用溶剂热法制备磁性纳米Fe3O4粒子；然后以土壤为原料，经分离、富集、筛选等步骤得到合格的溶磷菌；接着将活化后的溶磷菌、磁性纳米Fe3O4粒子分别制成悬浮液，将两者混合实现固定化；最后将固定后的溶磷菌接种到含中低品位磷矿粉的培养基中进行培养即可。本发明利用了Fe3O4良好的生物相容性、易与菌株细胞表面基团结合、能增强菌株表面活性等特点，得到的固定化菌株溶磷效果更强，与游离菌株相比其溶磷效果提升了30％‑60％，能更好地处理中低品位磷矿，具有操作简单、环境友好、经济效益较好等优势。
Description
技术领域
本发明涉及微生物及磷资源开发利用技术领域，具体涉及一种利用Fe304磁性纳米粒子固定溶磷菌溶解中低品位磷矿的方法。
背景技术
磷矿资源是磷化工和农业发展的重要基础原料。虽然我国磷矿储量丰富，但90％以上属于中低品位磷矿，品位在18％以下的磷矿占到总储量的一半。磷矿资源是一种不可再生资源，为了使磷资源得到充分利用，在高品位磷矿不断开采濒临枯竭的同时，必须进行中低品位磷矿的加工利用。
微生物的活动对土壤磷素循环(包括磷的转化和有效性)影响很大。国内外大量研究证实，土壤中存在许多能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的速效磷的溶磷微生物，具有这种能力的微生物称为溶磷菌或解磷菌，包括细菌、真菌和放线菌。利用土壤中溶磷菌处理中低品位磷矿，解决中低品位磷矿资源难利用的问题，具有无污染、来源广和成本低廉等优点。相关技术参见发明人团队较早前公开的中国发明专利CN105502318A、CN105752955A、C N102173399A、CN102174585A等。
为了增加溶磷菌的溶磷能力，我们尝试对其进行固定化。目前，常用的细胞固定化方法有包埋法和吸附法。包埋法具有生物相容性好、固定化效率高、成本低等优点，应用范围较广，但是传统的包埋法传质阻力和空间位阻较大，因而生物活性较低。吸附法降低了传统包埋法传质阻力，生物活性较高，相对而言有较好的发展潜力，但是吸附材料的开发是一大难点。
纳米磁性材料是一种集纳米材料和磁性材料于一身的新型功能材料，其种类很多，包含过渡态的金属氧化物(如γ-Fe2O3、Co3O4、Fe3O4)、铁氧体(如 CoFe2O4、BaFe12O19)、过渡金属磁性粒子(Fe、Co、Ni等)以及铁与稀土离子的合金(Fe-M-B、Fe-M-C、Co68.25Fe4.5Si12.25B15等)(Chiriac H,Moga AE,Iacob G, et al.Amorphous magneticmicrospheres for biomedical applications[J].Journal of Magnetism&MagneticMaterials,2005,293(1):28-32.)。
纳米磁性Fe3O4作为一种功能材料，具有以下优点：(1)超顺磁性，防止由于磁性引起的团聚现象；(2)较高的饱和磁化强度，确保在外部磁场下易于分离和传递；(3)粒径均一，纳米颗粒本身的尺寸相依性；(4)分散性好、稳定性高，磁性纳米颗粒的应用范围扩大；(5)表面易功能化，便于后期处理，应用范围扩大(林桃.磁性纳米核壳结构固定化酶的制备及性能[D].2018.)。此外，纳米磁性Fe3O4还具有较高的生物相容性，极易与菌类细胞表面的羟基、羧基、磷酰基、硫酸脂基、酰胺基结合而趋于稳定，可优选为菌株固定化材料，增加溶磷菌的稳定性和表面活性。
本发明首先从自然界筛选出溶磷菌作为优势菌种，该菌种对环境具有极强的适应性兼具高效溶磷的效果；然后通过溶剂热法制得了粒径均匀、生物相容性好的纳米磁性Fe3O4；最后利用纳米磁性Fe3O4粒子固定化溶磷菌，所得混合物是一种溶解中低品位磷矿的良好候选物。
发明内容
本发明的目的在于解决现有中低品位磷矿开发利用过程中存在的上述问题，提供一种新的微生物溶磷解决方案。该方案利用溶剂热法合成的纳米Fe3O4粒子固定从自然界中筛选出的高效溶磷菌，再利用其溶解中低品位磷矿，具有制备方法简单、菌株适应力强、菌株固定化后稳定性好等有益效果。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
利用Fe3O4磁性纳米粒子固定溶磷菌溶解中低品位磷矿的方法，包括以下步骤：(a)分别制备纳米Fe3O4粒子和高效溶磷菌备用；(b)将高效溶磷菌活化后制成悬浮液，将纳米Fe3O4粒子制成悬浮液，将溶磷菌悬浮液与Fe3O4悬浮液混合均匀，分离得到固定化菌株；(c)将固定化菌株加入到含中低品位磷矿的培养基中培养即可。
进一步的，步骤(a)制备纳米Fe3O4粒子的方法具体如下：将氯化铁或其水合物、乙酸钠、柠檬酸钠溶于乙二醇中，所得混合物在180-200℃下保温消解 16-20h，接着急速冷却至室温，最后进行磁分离、洗涤、干燥即可。
更进一步的，氯化铁或其水合物、乙酸钠、柠檬酸钠三者的重量份数比为4-5:8-12:1，乙二醇与柠檬酸钠的用量比为60-120mL:1g。
进一步的，步骤(a)中制备高效溶磷菌的方法具体如下：将土壤与无菌水混合后置于恒温摇床中进行摇瓶培养，静置后取上清液即为初始菌悬液；将初始菌悬液与富集培养基混合后置于恒温摇床中进行摇瓶培养，得到富集溶磷菌悬液；将富集溶磷菌悬液接种到溶磷平板培养基上进行恒温培养，观察是否出现溶磷圈，初筛得到具有溶磷能力的菌株；将初筛得到的溶磷菌接种至溶磷培养基中恒温培养，通过比较培养基上清液磷含量，复筛得到高效溶磷菌，此即为目标菌株。最后将目标菌株接种到溶磷斜面培养基中，保存在4℃的冰箱中。
更进一步的，分离时土壤与无菌水混合时的比例为50-100g:1L，恒温摇床转速为150-170r/min，培养温度26-35℃，培养时间20-30min；初始菌悬液与富集培养基混合时的体积比为1:3-4，初筛时恒温摇床转速为150-170r/min，培养温度为26-35℃，培养时间48-72h；复筛时恒温摇床转速为150-170r/min，培养温度为26-35℃，培养时间5-7d；每次摇瓶培养完成后离心分离转速为 8000-12000r/min。
进一步的，步骤(b)中活化方法具体为：将筛选好的高效溶磷菌接种在溶磷平板培养基中，于26-35℃下培养24-48h。
进一步的，步骤(b)中分别利用灭菌后的溶磷培养基和水配制溶磷菌悬浮液以及Fe3O4悬浮液，接着按照溶磷菌：Fe3O4＝1-2:1的质量比将两种悬浮液混合，然后室温下搅拌4-6h并进行磁分离，洗涤得到固定化菌株备用。
进一步的，步骤(c)中按照10％-20％的接种量将固定化菌株接种到含中低品位磷矿的培养基中，在26-35℃培养120-168h。
进一步的，溶磷培养基或富集培养基按照重量份数计的配方为：葡萄糖8-12 份，(NH4)2SO4 0.4-0.6份，MgSO4·7H2O 0.2-0.6份，KCl 0.2-0.6份，NaCl 0.2-0.6 份，FeSO4·7H2O 0.02-0.06份，Ca3(PO4)2 5-10份，蒸馏水1000份，pH＝7.0；溶磷平板培养基或溶磷斜面培养基是在溶磷培养基的基础上增加了10-15份琼脂；含中低品位磷矿的培养基是将溶磷培养基中的Ca3(PO4)2替换为相同份数的中低品位磷矿粉，中低品位磷矿粉使用前需过200-300目筛网。
本发明所使用的高效溶磷菌来源于土壤，通过分离、富集、筛选、再筛选得到。本发明所使用的纳米磁性Fe3O4采用溶剂热法制备得到，该方法具有工艺简单，所得纳米粒子高纯、超细且粒径均匀，对溶剂选择性灵活等优点。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)利用溶剂热制备的Fe3O4纳米粒子粒径合适，便于与菌株结合形成较好的固定化效果；(2)充分利用Fe3O4纳米粒子生物相容性好的优点，完成固定化后溶磷菌的表面活性和稳定性得到了增强，为提升菌株的溶磷效果开拓了一种新方法；(3)有望解决中低品位磷矿亟待开发的问题，通过Fe3O4磁性纳米粒子固定化溶磷菌的方式实现了中低品位磷矿的高效、无污染利用。
附图说明
图1为本发明实施例1中利用磁性纳米Fe3O4颗粒固定化溶磷菌前后的红外光谱对照图；
图2为本发明实施例1-3中不同来源的磁性纳米Fe3O4颗粒固定化溶磷菌以及游离溶磷菌(未固定)溶磷能力对比图。
具体实施方式
为使本领域普通技术人员充分理解本发明的技术方案和有益效果，以下结合具体实施例进行进一步说明。
本发明制备磁性纳米Fe3O4粒子的过程具体如下：将1.08g六水氯化铁、2.4g 乙酸钠和0.25g柠檬酸钠溶于30mL乙二醇中，待固体完全溶解后移至50mL消解罐中。将消解罐放入烘箱中，加热至180℃保温16h。反应结束后，用流水将消解罐急速冷却至室温，将反应液转移至烧杯中，用磁铁进行磁分离，底部黑色产物即为磁性纳米Fe3O4粒子。所得产物用乙醇、超纯水反复清洗后，分散在 10mL超纯水中，放入4℃的冰箱保存，此即为Fe3O4悬浮液。
由于涉及到纳米粒子的制备，上述操作每一步都要进行超声处理以便分散均匀。所得反应液无需等黑色产物完全沉淀，便可将上层液体倾倒掉，这有助于纳米粒子粒径均匀。
在整个过程中所使用到的各种培养基成分十分相似，各培养基的配方按照重量份数计具体如下：
富集培养基或溶磷培养基：葡萄糖8-12份，(NH4)2SO4 0.4-0.6份，MgSO4· 7H2O0.2-0.6份，KCl 0.2-0.6份，NaCl 0.2-0.6份，FeSO4·7H2O 0.02-0.06份， Ca3(PO4)2 5-10份，蒸馏水1000份，pH＝7.0。
含低品位磷矿的溶磷培养基：葡萄糖8-12份，(NH4)2SO4 0.4-0.6份，MgS O4·7H2O0.2-0.6份，KCl 0.2-0.6份，NaCl 0.2-0.6份，FeSO4·7H2O 0.02-0.06 份，200-300目筛分处理后的中低品位磷矿粉5-10份，蒸馏水1000份，pH＝7.0。
溶磷平板培养基或溶磷斜面培养基：葡萄糖8-12份，(NH4)2SO4 0.4-0.6份，MgSO4·7H2O 0.2-0.6份，KCl 0.2-0.6份，NaCl 0.2-0.6份，FeSO4·7H2O 0.02-0. 06份，Ca3(PO4)2 5-10份，琼脂10-15份，蒸馏水1000份，pH＝7.0。
实施例1
(1)分离：将50g植物根际土壤与500mL无菌水混合，放入28℃恒温摇床中，于165r/min条件下摇瓶培养30分钟，沉淀后取上清液，得到初始菌悬液。
(2)富集：将10mL初始菌悬液与40mL富集培养基混合后置于28℃恒温摇床中，于165r/min条件下摇瓶培养72小时，得到富集好的溶磷菌悬液。
(3)初筛：将富集好的溶磷菌悬液接种至溶磷平板培养基上，28℃培养72h，观察溶磷平板上是否出现溶磷圈，初步筛选出具有溶磷活性的菌株(出现溶磷圈表示该菌株具有溶磷活性)。
(4)复筛：用接种环将初筛得到的溶磷菌接种至含50mL溶磷培养基的锥形瓶中，将锥形瓶置于28℃的恒温摇床中，于165r/min条件下发酵培养7天。以同样条件下灭活菌株摇瓶作对照，测定培养液离心过滤所得上层清液的磷含量，采用钼锑抗比色法确定其有效磷含量，根据测定结果筛选出高效溶磷菌。经测定，在等量磷矿粉作为底物的条件下，可溶磷含量最高的菌株为高效溶磷菌株。将复筛所得菌株置于溶磷斜面培养基上，保存在4℃的冰箱里。
(5)活化：将保存的高效溶磷菌菌株接种至溶磷平板培养基中，28℃培养 36h。
(6)配制菌悬液：将一定量溶磷湿菌体(活化后的高效溶磷菌)加入到 500mL溶磷培养基中，利用旋涡仪振荡得到溶磷菌悬浮液，经计算菌株的浓度为100mg/L。
(7)固定化：按照Fe3O4与溶磷菌(干重)1:1的质量比，将制得的Fe3O4悬浮液与溶磷菌悬浮液混合，室温下电动搅拌4h，用磁铁对固定化菌株进行分离，倾去未吸附的游离菌株。用超纯水反复冲洗(3次以上)，得到固定化溶磷菌。将其分散在灭菌后的溶磷培养基中，保存在4℃冰箱内。
(8)按照10％的接种量将固定化溶磷菌接入含中低品位磷矿粉的培养基中，在28℃、165r/min下摇瓶培养120h小时后取样，采用钼锑抗比色法测定培养液中的溶磷量。
对比例1
步骤(1)-(5)与实施例1相同，跳过步骤(6)-(7)进行步骤(8)，直接以活化后的溶磷菌(游离溶磷菌)为原料，以同样的接种量将其接种到含中低品位磷矿粉的培养基中，在同样的条件下进行培养。同样采用钼锑抗比色法测定培养液中的溶磷量。
实施例2
实施例2与实施例1基本相同，不同之处在于：所选用的土壤为较为贫瘠、缺少植被的矿区土壤。矿区土壤中溶磷菌的种类和溶磷能力与植物根际土壤有所差别。
实施例3
实施例3与实施例1基本相同，不同之处在于：所选用的土壤为较为肥沃、有丰富磷来源的农田土壤。农田中溶磷菌的种类和溶磷能力与植物根际土壤、矿区土壤也有所差别。
实施例2和3同样设置了对比例(游离溶磷菌)。
为了充分了解磁性纳米Fe3O4粒子固定化溶磷菌前后的变化，取实施例1中的相应产物进行了红外光谱分析，结果如图1所示。587.19cm-1处的宽吸收带对应Fe-O伸缩振动，400-600cm-1为Fe-O伸缩振动峰。固定化溶磷菌后，纳米 Fe3O4位于3419.83cm-1处的吸收峰向高波数段移至3442.37cm-1处，说明纳米 Fe3O4微粒表面吸附的-OH与溶磷菌发生了作用。另外，固定化后1635.65cm-1处吸收增强，说明溶磷菌可能与Fe3O4形成C＝O健。根据1384.96cm-1处在负载后吸收强度增加且向低波数段移动至1384.69cm-1以及在1049.76cm-1处有明显的吸收峰，可推测形成了C-O键、C-N键。由图1还可以看出，溶磷菌使用纳米Fe3O4固定化后其官能团种类明显增加，如1635.65cm-1到1384.69cm-1处出现了蛋白质分子中甲基的反对称弯曲振动峰[δas(CH3)]，这一结果与文献(吴伟林. 纳米Fe3O4负载铜绿假单胞菌吸附铀U(Ⅵ)的特性与机理研究[D].南华大学, 2013.)记载相符。综合以上结果可以确定，使用纳米Fe3O4固定化溶磷菌后其表面官能团增加，有助于增加溶磷菌的稳定性和表面活性以及菌株的溶磷能力。
实施例1-3及各自对比例溶磷能力结果如图2所示。由图2可知，从不同来源的土壤样品中分离出的菌株溶磷效果不同，但通过磁性纳米Fe3O4粒子进行固定后，溶磷效果均得到了一定的提升，与游离菌株相比溶磷效果提升了 30％-60％。
Claims (10)
1.利用Fe3O4磁性纳米粒子固定溶磷菌溶解中低品位磷矿的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)分别制备纳米Fe3O4粒子和高效溶磷菌备用；
(b)将高效溶磷菌活化后制成悬浮液，将纳米Fe3O4粒子制成悬浮液，将溶磷菌悬浮液与Fe3O4悬浮液混合均匀，分离得到固定化菌株；
(c)将固定化菌株加入到含中低品位磷矿的培养基中培养即可。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(a)中制备纳米Fe3O4粒子的方法具体为：将氯化铁或其水合物、乙酸钠、柠檬酸钠溶于乙二醇中，所得混合物在180-200℃下保温消解16-20h，接着急速冷却至室温，最后进行磁分离、洗涤、干燥即可。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：氯化铁或其水合物、乙酸钠、柠檬酸钠三者的重量份数比为4-5:8-12:1，乙二醇与柠檬酸钠的用量比为60-120mL:1g。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(a)中制备高效溶磷菌的方法具体为：将土壤与无菌水混合后置于恒温摇床中进行摇瓶培养，静置后取上清液即为初始菌悬液；将初始菌悬液与富集培养基混合后置于恒温摇床中进行摇瓶培养，得到富集溶磷菌悬液；将富集溶磷菌悬液接种到溶磷平板培养基上进行恒温培养，观察是否出现溶磷圈，初筛得到具有溶磷能力的菌株；将初筛得到的溶磷菌接种至溶磷培养基中恒温培养，通过比较培养基上清液磷含量，复筛得到高效溶磷菌。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：分离时土壤与无菌水混合时的比例为50-100g:1L，恒温摇床转速为150-170r/min，培养温度26-35℃，培养时间20-30min；初始菌悬液与富集培养基混合时的体积比为1:3-4，初筛时恒温摇床转速为150-170r/min，培养温度为26-35℃，培养时间48-72h；复筛时恒温摇床转速为150-170r/min，培养温度为26-35℃，培养时间5-7d；每次摇瓶培养完成后离心分离转速为8000-12000r/min。
6.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于：制得的高效溶磷菌需接种到溶磷斜面培养基中，保存在4℃环境中。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(b)中活化方法具体为：将筛选好的高效溶磷菌接种在溶磷平板培养基中，于26-35℃下培养24-48h。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(b)中分别利用灭菌后的溶磷培养基和水配制溶磷菌悬浮液以及Fe3O4悬浮液，接着按照溶磷菌:Fe3O4＝1-2:1的质量比将两种悬浮液混合，然后室温下搅拌4-6h并进行磁分离，洗涤得到固定化菌株备用。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(c)中按照10％-20％的接种量将固定化菌株接种到含中低品位磷矿的培养基中，在26-35℃培养120-168h。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于：溶磷培养基或富集培养基按照重量份数计的配方为：葡萄糖8-12份，(NH4)2SO4 0.4-0.6份，MgSO4·7H2O 0.2-0.6份，KCl 0.2-0.6份，NaCl 0.2-0.6份，FeSO4·7H2O 0.02-0.06份，Ca3(PO4)2 5-10份，蒸馏水1000份，pH＝7.0；溶磷平板培养基或溶磷斜面培养基是在溶磷培养基的基础上增加了10-15份琼脂；含中低品位磷矿的培养基是将溶磷培养基中的Ca3(PO4)2替换为相同份数的中低品位磷矿粉，中低品位磷矿粉使用前需过200-300目筛网。
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