CN105734041A - 生物炭负载PSB钝化剂的制备及其修复Pb污染土壤的方法 - Google Patents

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Abstract

生物炭负载PSB钝化剂的制备方法，属于土壤修复的技术领域，采用绿针假单胞菌，将其进行固定化处理，以生物炭为载体，将培养至对数生长期的绿针假单胞菌接种到发酵罐中，加入生物炭进行发酵培养，然后进行固定化处理，得到生物炭负载PSB钝化剂。本发明还提供了一种用生物炭负载PSB钝化剂修复Pb污染土壤的方法，本发明的方法简单、易操作，适用于大规模生产，本发明的生物炭负载PSB钝化剂对土壤的修复能力高，铅的去除率高。

Description

生物炭负载PSB钝化剂的制备及其修复Pb污染土壤的方法
技术领域
本发明属于土壤修复的技术领域，涉及生物钝化剂对土壤的修复，具体涉及生物炭负载PSB钝化剂的制备及其修复Pb污染土壤的方法。本发明生物炭负载PSB钝化剂的制备方法简单、易操作，易于大规模生产，用于修复Pb污染土壤的方法简单、快捷，修复能力强。
背景技术
据统计，目前我国已有2667万hm2的耕地受到不同程度的重金属污染，已经导致土壤肥力退化、农作物产量降低和品质下降，威胁到人们的食品安全；受污染耕地占到全国耕地总面积的20％，大面积中轻度复合污染是我国重金属污染土壤的典型特征。
在众多土壤重金属修复技术中，利用含磷物质钝化土壤中Pb、Cd、Zn等重金属已经被证明是一种有效的方法。我国农田磷肥施加量很高，但其利用率很低，施到土壤中的磷肥当季利用率只有10％～25％，累积利用率不到50％，导致土壤全磷与有效磷含量之比高达130～500。
溶磷菌(Phosphatesolubilizingbacteria，简称PSB)广泛存在于土壤中，可以将土壤中无效磷通过其生命活动转化为有效磷。经PSB活化的磷既可以促进重金属的钝化，降低作物对重金属的吸收，又能促进农作物的生长；避免了化学钝化修复过程中大量投加钝化剂造成的二次污染、破坏土壤结构，治理成本过高等不足。因此利用微生物技术修复重金属污染土壤受到国内外的重视，成为当前国际研究的热点。但是，该方法目前存在的主要问题是直接施加外源活性PSB非常容易流失，或者被土著微生物吞噬。因而，研究微生物技术修复重金属污染，并保证施加的PSB不流失、不被土著微生物吞噬，对农业的可持续发展具有重要的意义。
发明内容
本发明为解决现有技术中在利用微生物技术修复重金属污染时，加入的活性PSB非常容易流失，或者被土著微生物吞噬，从而导致修复效果下的技术问题，提供了一种生物炭负载PSB钝化剂的制备及其修复Pb污染土壤的方法。本发明生物炭负载PSB钝化剂的制备方法简单，制备的生物炭负载PSB钝化剂应用到受污染的土壤中，修复效果好，对铅的去除率高。
本发明为实现其目的采用的技术方案是：
生物炭负载PSB钝化剂的制备方法，采用绿针假单胞菌，将其进行固定化处理，以生物炭为载体，将培养至对数生长期的绿针假单胞菌接种到发酵罐中，加入生物炭进行发酵培养，然后进行固定化处理，得到生物炭负载PSB钝化剂。
生物炭通过下述方式制备：以牛粪为原料，风干后，于缺氧条件进行热解，自然冷却后，研磨，得到生物炭。
于缺氧条件进行热解时，控制热解温度330-360℃，恒温热解2-2.5h。
培养至对数生长期的绿针假单胞菌通过下述方式制备：
a、筛选，采集重金属污染的土壤置于蒸馏水中，振荡培养后，接种于含有磷矿粉的选择性培养基中，进行再培养，即得到溶磷菌群混菌菌液；
b、驯化，取步骤a的溶磷菌群混菌菌液进行离心处理，然后用灭菌的选择性培养基洗涤，然后接种到含有重金属Pb的选择性培液体培养基中，进行摇床培养，重新传代，进行驯化；
c、驯化结束后，筛选所得驯化菌群，对比溶磷圈大小，得到1株耐受重金属的高效解磷单菌，然后用发酵培养基培养至对数期，甘油保存；经鉴定该株高效溶磷单菌为：绿针假单胞菌(Pseudomonascholoeaphtis)；
d、将甘油保存的绿针假单胞菌活化后接种于新鲜的发酵培养基，振荡培养至对数生长期，得到培养至对数生长期的绿针假单胞菌。
生物炭负载PSB钝化剂的制备包括以下步骤：
e、将培养至对数生长期的菌种按5％-8％的接种量接入含有发酵培养基的发酵罐中，发酵罐中按照70-80g/L的比例加入生物炭，发酵温度28-32℃，DO值为6-9mg/L，培养至对数生长期，获得发酵液；
f、向步骤e中获得的发酵液中按质量体积比18-23g/L加入灭菌的海藻酸钠，充分搅匀，获得悬浊液，备用；
g、制备18-23g/L的CaCl2无菌溶液，将步骤f获得的悬浊液逐滴注入到CaCl2溶液中获得固化小球，继续强化10-15h后过滤去除小球，在无菌条件下风干，获得生物炭负载PSB钝化剂。
步骤a中，采集重金属污染土壤5-10cm处的土壤置于蒸馏水中，于28-32℃恒温振荡培养22-26h后，接种于含有磷矿粉的选择性培养基中，进行再培养，即得到溶磷菌群。
步骤a中，含有磷矿粉的选择性培养基的配方为：10g葡萄糖，5gCa3(PO4)2，5gMgCl2·6H2O，0.25gMgSO4·7H2O，0.2gKCl,0.1g(NH4)2SO4，1000ml纯净水。
步骤b中，取步骤a的溶磷菌群混菌菌液进行离心处理，然后用灭菌的选择性培养基洗涤2-3次，然后接种到含有重金属Pb浓度为500mg/L的选择性培液体培养基中，于28-32℃、110-130rpm条件下进行摇床培养7-8天，重新传代，进行驯化5-6次。
步骤b中，所述的灭菌的选择性培养的配方为：5gCa3(PO4)2，5gMgCl2·6H2O，0.2gKCl,0.1gNH4NO3，1000ml蒸馏水；所述的含有重金属Pb的选择性培养基的配方为：5gCa3(PO4)2，5gMgCl2·6H2O，0.2gKCl,0.1gNH4NO3，0.5gPb(NO3)2，1000ml蒸馏水。
一种用生物炭负载PSB钝化剂的制备方法制备的生物炭负载PSB钝化剂修复Pb污染土壤的方法，将生物炭负载PSB钝化剂与受污染的含磷土壤按质量比1:(900-1100)的比例混合，混合后填入土柱中，然后用地下水对土柱进行淋溶，保持湿度达到田间持水量的45-55％，室温稳定60-65天，实现对污染土壤的修复。
本发明的有益效果是：
1、生物炭负载绿针假单胞菌的制备工艺简单易行，操作方便，易于大规模生产，所使用的原材料来源丰富、价格低廉。
2、生物炭作为载体有助于PSB解磷效果在土壤中的表达，可以高效转化土壤内源磷用于重金属钝化，同时也可以促进农作物生长。
3、生物炭本身是一种良好的土壤改良剂，有利于对土壤的改良，避免二次污染。
4、本发明提出利用土壤内源磷钝化重金属，可以避免传统钝化方法中钝化剂的大量投加造成的二次污染，降低经济成本低。
5、由于生物炭性质稳定，作为绿针假单胞菌的载体可以长期保持其在土壤中的活性，在土壤中建立有效的钝化体系，使得钝化效果长期稳定。
6、本发明生物炭负载PSB这一钝化剂的制备，主要是利用生物炭含有的营养元素与多孔结构为目的菌株提供一个快速生长繁殖的环境，从而为PSB在土壤中快速繁殖表达解磷效果提供有利条件；创新之处在于其修复方式是以生物炭负载PSB活化土壤内源磷达到钝化土壤中的重金属的目的，避免添加大量含磷物质带来的二次污染与土壤质量下降的问题。
7、本发明制备的生物炭是在较低的温度与较短的时间内热解获得，在此条件下获得生物炭含有相对较多的有机质可为PSB生长提供一定的碳源，热解过程中产生的无机矿物质可为PSB生长提供微量元素，并且在此条件下获得生物炭具有较大的比表面积与适于PSB吸附的孔径；过高的温度使得有机质大量分解、过低则不能获得较大的比表面积；恒温热解更有利于获得性质稳定的生物炭，不会因为温度的剧烈变化破坏生物炭结构；时间的影响与温度的影响类似。因此，在制备生物炭负载PSB钝化剂的过程中，必须严格控制热解温度为330-360℃(优选350℃)，且必须是恒温热解，从而获得性质稳定的活性炭。
8、本发明中控制菌种的接种量为5％-8％，过低的接种量会延长发酵时间，过大的接种量会带入接种液中的杂质，虽能缩短发酵时间，但过短的时间不利于菌种在生物炭上的负载；控制70-80g/L的比例加入生物炭，过低的生物炭导致发酵液过剩利用不充分、过高的生物炭导致微生物负载不彻底，单位生物炭上的菌数较少，起到负载的作用；发酵温度28-32℃，DO值为6-9mg/L的设定是为了目的菌株快速繁殖。
9、加入海藻酸钠主要是起到粘连作用，海藻酸钠溶于水后形成粘稠的液体将溶液中悬浮的生物炭连接起来，含量较低不能起到粘连的作用。
10、由于海藻酸钠溶液与Ca2+生成不溶于水的沉淀，18-23g/L的CaCl2无菌溶液的目的是较高Ca2+浓度有利于与悬浊液中的海藻酸钠快速反应生成固体，将负载了PSB的生物炭沉淀析出，强化时间10-15h是为了保证强化的强度，强化时间小于10h强化强度不够，造成获得生物炭负载PSB小球开裂、粉末化。
11、生物炭负载PSB钝化剂与受污染的含磷土壤按质量比1:(900-1100)的比例混合，在此比例条件下PSB可以在土壤中有效繁殖，添加量过低PSB没有足够的载体为依托与土著微生物竞争快速繁殖，大于这个比例经济性降低。室温稳定60-65d是为了让PSB发挥作用，即修复过程。
附图说明
图1是实施例1中不同方式处理的土壤中Pb形态含量变化图。
图2是牛粪的电镜图像。
图3是牛粪制备的生物炭的电镜图像。
图4是负载微生物的电镜图像。
图5是图4的局部放大图。
图6是CK的XRD图谱。
图7是GNF的XRD图谱。
其中K代表高岭土，Q代表SiO2，C代表PbCO3，P代表Pb3(PO3)2，E代表Pb5(PO4)3Cl。
具体实施方式
本发明将外源PSB先吸附在生物炭上，再施加入土壤进行修复，生物炭可以为活性微生物的生长繁殖提供保护区域和营养源，实现外源PSB在新环境的繁殖与表达。生物炭为微生物的生存提供了大量的附着点位和空间，并且生物炭自身的分解产物为微生物的繁殖提供养分，可促进微生物的繁殖。并且，本发明研究生物炭负载PSB的制备与使用方法，实现通过微生物活化土壤无效内源磷固定重金属，同时提高土壤肥力，实现重金属污染土壤经济、快速修复。对我国农业可持续发展提供了一个新的途径和技术方法。下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
本发明所述的发酵培养基的配方均为：10g葡萄糖，5gNa3PO4，5gMgCl2·6H2O，0.25gMgSO4·7H2O，0.2gKCl，0.1g(NH4)2SO4，1000ml蒸馏水。
一、生物炭负载PSB钝化剂的制备
实施例1
生物炭的制备：
本发明中选用牛粪作为制备生物炭的原料，将原料洗净风干后置于密闭金属容器中堆满形成缺氧环境，在马弗炉中350℃恒温加热2小时，自然冷却后研磨过60目筛，作为目标生物炭干燥保存备用。
绿针假单胞菌的筛选和驯化：
a、筛选，在蓄电池厂污水灌溉造成的农田重金属污染土壤中采集上层5-10cm的土壤5g置于装有90ml蒸馏水的250ml三角瓶中，在30℃恒温振荡器中振荡培养24小时，接种于含有磷矿粉的选择性培养基中，再培养5天，即为溶磷菌群；
b、驯化，取步骤a的溶菌群混菌菌液5ml，8000rpm离心5min，用灭菌的选择性培养基洗涤2次，溶磷菌群接种到含有重金属Pb浓度为500mg/L的选择性培液体培养基中，在30℃，120rpm摇床里培养7天，重新传代，共驯化5次；
c、驯化结束后，将所得驯化菌群利用稀释平板法筛选，对比溶磷圈大小，得到1株耐受重金属的高效解磷单菌，发酵培养基培养至对数期，甘油保存于-20℃冰箱，经鉴定该株高效溶磷单菌为绿针假单胞菌(Pseudomonascholoeaphtis)。
绿针假单胞菌的固定化：
d、将甘油保存的绿针假单胞菌活化后重新接种于新鲜的发酵培养基，振荡培养至对数生长期；
e、将步骤d中振荡培养至对数生长期的菌种按照7％的接种量接入含有发酵培养基的发酵罐中，发酵罐中按照75g/L的比例加入生物炭，发酵温度为30℃，设定DO值为6mg/L，发酵时间为49h，培养至对数生长期，获得发酵液中绿针假单胞菌的浓度达到108/ml；
f、向步骤e中获得的发酵液中按质量体积比20g/L加入灭菌的海藻酸钠，充分搅匀，获得悬浊液，备用；
g、制备20g/L的CaCl2无菌溶液，将步骤f获得的悬浊液逐滴注入到CaCl2溶液中获得固化小球，继续强化12h后过滤去除小球，在无菌条件下风干，获得生物炭负载PSB钝化剂。
实施例2
生物炭的制备：
本发明中选用牛粪作为制备生物炭的原料，将原料洗净风干后置于密闭金属容器中堆满形成缺氧环境，在马弗炉中330℃恒温加热2.5小时，自然冷却后研磨过60目筛，作为目标生物炭干燥保存备用。
绿针假单胞菌的筛选和驯化：
a、筛选，在蓄电池厂污水灌溉造成的农田重金属污染土壤中采集上层5-10cm的土壤6g置于装有90ml蒸馏水的250ml三角瓶中，在28℃恒温振荡器中振荡培养26小时，接种于含有磷矿粉的选择性培养基中，再培养5天，即为溶磷菌群；
b、驯化，取步骤a的溶菌群混菌菌液5ml，8000rpm离心5min，用灭菌的选择性培养基洗涤2次，溶磷菌群接种到含有重金属Pb浓度为490mg/L的选择性培液体培养基中，在28℃，100rpm摇床里培养8天，重新传代，共驯化6次；
c、驯化结束后，将所得驯化菌群利用稀释平板法筛选，对比溶磷圈大小，得到1株耐受重金属的高效解磷单菌，发酵培养基培养至对数期，甘油保存于-20℃冰箱，经鉴定该株高效溶磷单菌为绿针假单胞菌(Pseudomonascholoeaphtis)；
绿针假单胞菌的固定化：
d、将甘油保存的绿针假单胞菌活化后重新接种于新鲜的发酵培养基，振荡培养至对数生长期；
e、将步骤d中振荡培养至对数生长期的菌种按照6％的接种量接入含有发酵培养基的发酵罐中，发酵罐中按照70g/L的比例加入生物炭，发酵温度为28℃，设定DO值为7mg/L，发酵时间为48h，培养至对数生长期，获得发酵液中绿针假单胞菌的浓度达到108/ml；
f、向步骤e中获得的发酵液中按质量体积比18g/L加入灭菌的海藻酸钠，充分搅匀，获得悬浊液，备用；
g、制备18g/L的CaCl2无菌溶液，将步骤f获得的悬浊液逐滴注入到CaCl2溶液中获得固化小球，继续强化13h后过滤去除小球，在无菌条件下风干，获得生物炭负载PSB钝化剂。
实施例3
生物炭的制备：
本发明中选用牛粪作为制备生物炭的原料，将原料洗净风干后置于密闭金属容器中堆满形成缺氧环境，在马弗炉中340℃恒温加热2.1小时，自然冷却后研磨过60目筛，作为目标生物炭干燥保存备用。
绿针假单胞菌的筛选和驯化：
a、筛选，在蓄电池厂污水灌溉造成的农田重金属污染土壤中采集上层5-10cm的土壤7g置于装有90ml蒸馏水的250ml三角瓶中，在29℃恒温振荡器中振荡培养23小时，接种于含有磷矿粉的选择性培养基中，再培养6天，即为溶磷菌群；
b、驯化，取步骤a的溶菌群混菌菌液5ml，8000rpm离心5min，用灭菌的选择性培养基洗涤2次，溶磷菌群接种到含有重金属Pb浓度为510mg/L的选择性培液体培养基中，在29℃，130rpm摇床里培养7天，重新传代，共驯化5次；
c、驯化结束后，将所得驯化菌群利用稀释平板法筛选，对比溶磷圈大小，得到1株耐受重金属的高效解磷单菌，发酵培养基培养至对数期，甘油保存于-20℃冰箱，经鉴定该株高效溶磷单菌为绿针假单胞菌(Pseudomonascholoeaphtis)。
绿针假单胞菌的固定化：
d、将甘油保存的绿针假单胞菌活化后重新接种于新鲜的发酵培养基，振荡培养至对数生长期；
e、将步骤d中振荡培养至对数生长期的菌种按照5％的接种量接入含有发酵培养基的发酵罐中，发酵罐中按照80g/L的比例加入生物炭，发酵温度为31℃，设定DO值为8mg/L，发酵时间为50h，培养至对数生长期，获得发酵液中绿针假单胞菌的浓度达到108/ml；
f、向步骤e中获得的发酵液中按质量体积比21g/L加入灭菌的海藻酸钠，充分搅匀，获得悬浊液，备用；
g、制备21g/L的CaCl2无菌溶液，将步骤f获得的悬浊液逐滴注入到CaCl2溶液中获得固化小球，继续强化10h后过滤去除小球，在无菌条件下风干，获得生物炭负载PSB钝化剂。
实施例4
生物炭的制备：
本发明中选用牛粪作为制备生物炭的原料，将原料洗净风干后置于密闭金属容器中堆满形成缺氧环境，在马弗炉中360℃恒温加热2.3小时，自然冷却后研磨过60目筛，作为目标生物炭干燥保存备用。
绿针假单胞菌的筛选和驯化：
a、筛选，在蓄电池厂污水灌溉造成的农田重金属污染土壤中采集上层5-10cm的土壤8g置于装有90ml蒸馏水的250ml三角瓶中，在32℃恒温振荡器中振荡培养25小时，接种于含有磷矿粉的选择性培养基中，再培养5天，即为溶磷菌群；
b、驯化，取步骤a的溶菌群混菌菌液5ml，8000rpm离心5min，用灭菌的选择性培养基洗涤2次，溶磷菌群接种到含有重金属Pb浓度为500mg/L的选择性培液体培养基中，在32℃，130rpm摇床里培养7天，重新传代，共驯化6次；
c、驯化结束后，将所得驯化菌群利用稀释平板法筛选，对比溶磷圈大小，得到1株耐受重金属的高效解磷单菌，发酵培养基培养至对数期，甘油保存于-20℃冰箱，经鉴定该株高效溶磷单菌为绿针假单胞菌(Pseudomonascholoeaphtis)。
绿针假单胞菌的固定化：
d、将甘油保存的绿针假单胞菌活化后重新接种于新鲜的发酵培养基，振荡培养至对数生长期；
e、将步骤d中振荡培养至对数生长期的菌种按照8％的接种量接入含有发酵培养基的发酵罐中，发酵罐中按照73g/L的比例加入生物炭，发酵温度为29℃，设定DO值为7mg/L，发酵时间为48h，培养至对数生长期，获得发酵液中绿针假单胞菌的浓度达到108/ml；
f、向步骤e中获得的发酵液中按质量体积比22g/L加入灭菌的海藻酸钠，充分搅匀，获得悬浊液，备用；
g、制备22g/L的CaCl2无菌溶液，将步骤f获得的悬浊液逐滴注入到CaCl2溶液中获得固化小球，继续强化11h后过滤去除小球，在无菌条件下风干，获得生物炭负载PSB钝化剂。
实施例5
生物炭的制备：
本发明中选用牛粪作为制备生物炭的原料，将原料洗净风干后置于密闭金属容器中堆满形成缺氧环境，在马弗炉中350℃恒温加热2.4小时，自然冷却后研磨过60目筛，作为目标生物炭干燥保存备用。
绿针假单胞菌的筛选和驯化：
a、筛选，在蓄电池厂污水灌溉造成的农田重金属污染土壤中采集上层5-10cm的土壤10g置于装有90ml蒸馏水的250ml三角瓶中，在30℃恒温振荡器中振荡培养25小时，接种于含有磷矿粉的选择性培养基中，再培养5天，即为溶磷菌群；
b、驯化，取步骤a的溶菌群混菌菌液5ml，8000rpm离心5min，用灭菌的选择性培养基洗涤2次，溶磷菌群接种到含有重金属Pb浓度为500mg/L的选择性培液体培养基中，在31℃，120rpm摇床里培养7天，重新传代，共驯化6次；
c、驯化结束后，将所得驯化菌群利用稀释平板法筛选，对比溶磷圈大小，得到1株耐受重金属的高效解磷单菌，发酵培养基培养至对数期，甘油保存于-20℃冰箱，经鉴定该株高效溶磷单菌为绿针假单胞菌(Pseudomonascholoeaphtis)。
绿针假单胞菌的固定化：
d、将甘油保存的绿针假单胞菌活化后重新接种于新鲜的发酵培养基，振荡培养至对数生长期；
e、将步骤d中振荡培养至对数生长期的菌种按照5％的接种量接入含有发酵培养基的发酵罐中，发酵罐中按照78g/L的比例加入生物炭，发酵温度为31℃，设定DO值为8mg/L，发酵时间为49h，培养至对数生长期，获得发酵液中绿针假单胞菌的浓度达到108/ml；
f、向步骤e中获得的发酵液中按质量体积比23g/L加入灭菌的海藻酸钠，充分搅匀，获得悬浊液，备用；
g、制备23g/L的CaCl2无菌溶液，将步骤f获得的悬浊液逐滴注入到CaCl2溶液中获得固化小球，继续强化15h后过滤去除小球，在无菌条件下风干，获得生物炭负载PSB钝化剂。
对比实施例1
首先，在缺氧条件下热解鸡粪制备生物碳，并粉碎(粒径小于1mm)；然后，将生物碳和猪粪按质量比1/1的比例混合，添加适量土壤以控制混合料C/N为30，得到堆肥原料；最后，将堆肥原料置于堆肥场所进行堆肥处理，堆肥期间，适时调节含水率使含水率保持在50％-60％，每天翻堆一次以避免局部厌氧，堆肥过程持续30天，直到堆肥原料形成腐殖物质，即为土壤修复剂。
该方案针对的是有机物或镉污染土壤的修复，有机物污染、镉污染与铅污染是完全不同的污染类型，在进行土壤修复时，修复机理和修复作用完全不同，如果将其用于对铅污染的土壤，则无法实现对铅污染的修复。
对比实施例2
(1)分别取假单胞菌菌剂、木霉菌菌剂、青霉菌菌剂、产碱杆菌菌剂、地衣芽孢杆菌菌剂和枯草芽孢杆菌菌剂并混合均匀，得复合微生物；
(2)复合微生物与有机载体混合，使微生物吸附于有机载体上，得复合微生物制剂；
(3)分别取复合微生物制剂、土壤调理剂和营养剂，然后将三者混合均匀，其中土壤调理剂包括木屑、干草、刈割草、蛭石、树叶、木屑、麦秆和锯屑中的至少一种，营养剂由以下质量百分比的物质组成：硫酸铵16.8％、氯化钠8.5％、磷酸二氢钾16.8％、硝酸铵1.7％、殖酸56.2％。
该方案针对的是有机物污染土壤的修复，有机物污染与铅污染是完全不同的污染类型，在进行土壤修复时，修复机理和修复作用完全不同，如果将其用于对铅污染的土壤，则无法实现对铅污染的修复。
对比实施例3
用于农药污染土壤修复的微生物固定化颗粒的制备方法，采取以下步骤：
a.载体材料的破碎与筛分：先将多孔炭粉碎成均匀颗粒，高温高压蒸汽灭菌，干燥备用；
b.细菌斜面培养：在基础培养基中接入菌种，在28-30℃温度下置于培养箱中斜面培养48小时；
c.细菌种子液制备：用接种环在所述基础培养基上接取菌种，接入到液体种子培养基，放入摇床在温度28-30℃条件下培养20-24小时，制得细菌种子液；
d.固定化颗粒制备：将培养了12-14小时的所述细菌种子液与所述多孔炭颗粒按照重量5-20％的比例混合，在30℃温度下振荡培养24-48小时，然后加入质量浓度为2-4％的羧甲基纤维素水溶液作为交联剂，经12-18小时化学交联，然后将所述经过化学交联的多孔炭颗粒转移至剂质量浓度为1-2％的壳聚糖水溶液中，进行一次加固反应22-24小时，再将所述经过一次加固的多孔炭颗粒转移到质量浓度为2-3％的海藻酸钠水溶液中，进行二次加固24小时，然后将所述经过二次加固的多孔炭颗粒用无菌水冲洗并浸泡24小时；
e.增殖培养：将所述浸泡过的多孔炭颗粒取出接入增殖培养基中，放入摇床在温度28-30℃条件下培养24小时，然后更换增殖培养基两次，每次重复增殖培养步骤，最终得到微生物固定化颗粒成品。
该方案针对是农药污染土壤的修复，农药污染与铅污染是完全不同的污染类型，在进行土壤修复时，修复机理和修复作用完全不同，如果将其用于对铅污染的土壤，则无法实现对铅污染的修复。
上述方案中采用两次加固的固定化处理(先进行化学交联，然后再经过壳聚糖一次加固，再经过海藻酸钠二次加固，浸泡后进行增殖培养)，本发明通过对海藻酸钠与CaCl2无菌溶液浓度的控制，结合生物炭与菌种接种量的控制，无需进行化学交联，只需进行一次加固即可，且加固后无需进行增殖培养，得到的生物炭负载PSB钝化剂稳定性高、微生物细胞高度密集，细胞活性提高，菌成活率高，菌的活性更强，相较于上述固定化处理工艺，生物炭负载PSB钝化剂性质更稳定，菌含量、菌活性、菌成活率更高，应用到对铅污染土壤的修复，修复效果更好，相同铅污染的土壤修复，本发明的修复率相较于采用两次加固的固定化处理的修复剂的修复率提高30％以上，修复所用时间更短。
二、用生物炭负载PSB钝化剂修复Pb污染土壤的方法
用活性炭负载绿针假单胞菌修复土壤重金属的方法，包括以下步骤：
A、在未受污染的农田土壤中采集5-35cm这一层的土壤，室温干燥至恒重，将土壤粉碎后过2.5mm尼龙筛，备用，作为空白对照组编号CK。
B、对步骤A中的土壤按照如下方式进行预处理：
(1)将备用土壤装填在土柱中，施加磷肥(磷酸二铵)1g/kg模拟施肥，用5L马氏瓶装满地下水对土柱进行淋溶，收集底部淋出液，重新加入到马氏瓶中(避免磷元素的流失)，循环3d后，稳定7d，获得模拟施肥的土壤。
(2)配制浓度为2g/L的Pb(NO3)2的溶液，用马氏瓶对步骤(1)中土柱进行淋溶，收集底部淋出液，重新加入到马氏瓶中(避免重金属离子从其它渠道流失)，循环3d后，稳定7d；通过控制Pb(NO3)2溶液的量获得总铅含量为600mg/kg。
C、称取本发明制备的生物炭负载绿针假单胞菌钝化剂与受污染土壤按照1g/kg的比例将二者混合均匀，将混合土壤填入一维土柱中，土柱的尺寸为半径12.5cm，装填高度40cm，夯实编号为GNF；同时将制备的初始土壤(编号CK)、只添加生物炭无绿针假单胞菌的土壤(编号TNF)作为对照。
D、土柱淋溶：用10L马氏瓶装满地下水对土柱淋溶模拟灌溉；保持土壤湿度达到田间持水量的50％，室温稳定60d使生物钝化剂起作用，最终得到目的土壤。
E、分析步骤D土壤中有效磷、全磷、Pb的各形态含量变化。
结果表明使用本发明中制备的生物炭负载PSB材料可有效钝化修复受铅污染的农田土壤，实验结果表明目标微生物绿针假单胞菌在土壤中大量繁殖，土壤中有效磷含量显著增加，离子交换态铅含量显著降低，土壤酶活性增强，达到了修复铅污染土壤的目的。处理后土壤中各指标含量变化如表1所示。
表1
土壤类型 有效磷mg/kg 离子交换态铅mg/kg pH
CK 1.54 46 6.6
TNF 4.1 40.5 6.6
GNF 16.4 - 6.5
对比实施例1 1.56 45.8 6.8
对比实施例2 1.63 43 6.7
对比实施例3 2.16 39.2 6.8
实验结果表明，生物炭负载PSB材料可以使PSB(绿针假单胞菌)快速繁殖活化土壤内无效磷，达到钝化土壤中铅的目的。钝化稳定后土壤中残渣态铅含量显著增加，弱酸提取态则显著降低90％，可交换态含量为0，OlsenP含量显著增加至6mg/kg以上，并达到一种钝化平衡状态。因此，本发明制备的生物炭负载PSB材料可以显著提高土壤OlsenP含量，达到钝化重金属、促进植物生长的目的，在土壤重金属污染治理中具有广阔的应用前景。

Claims (10)

1.生物炭负载PSB钝化剂的制备方法，采用绿针假单胞菌，将其进行固定化处理，其特征在于：以生物炭为载体，将培养至对数生长期的绿针假单胞菌接种到发酵罐中，加入生物炭进行发酵培养，然后进行固定化处理，得到生物炭负载PSB钝化剂。
2.根据权利要求1所述的生物炭负载PSB钝化剂的制备方法，其特征在于，生物炭通过下述方式制备：以牛粪为原料，风干后，于缺氧条件进行热解，自然冷却后，研磨，得到生物炭。
3.根据权利要求2所述的生物炭负载PSB钝化剂的制备方法，其特征在于，于缺氧条件进行热解时，控制热解温度330-360℃，恒温热解2-2.5h。
4.根据权利要求1所述的生物炭负载PSB钝化剂的制备方法，其特征在于，培养至对数生长期的绿针假单胞菌通过下述方式制备：
a、筛选，采集重金属污染的土壤置于蒸馏水中，振荡培养后，接种于含有磷矿粉的选择性培养基中，进行再培养，即得到溶磷菌群混菌菌液；
b、驯化，取步骤a的溶磷菌群混菌菌液进行离心处理，然后用灭菌的选择性培养基洗涤，然后接种到含有重金属Pb的选择性培养基中，进行摇床培养，重新传代，进行驯化；
c、驯化结束后，筛选所得驯化菌群，对比溶磷圈大小，得到1株耐受重金属的高效解磷单菌，然后用发酵培养基培养至对数期，甘油保存；经鉴定该株高效溶磷单菌为：绿针假单胞菌(Pseudomonascholoeaphtis)；
d、将甘油保存的绿针假单胞菌活化后接种于新鲜的发酵培养基，振荡培养至对数生长期，得到培养至对数生长期的绿针假单胞菌。
5.根据权利要求1所述的生物炭负载PSB钝化剂的制备方法，其特征在于，生物炭负载PSB钝化剂的制备包括以下步骤：
e、将培养至对数生长期的菌种按5％-8％的接种量接入含有发酵培养基的发酵罐中，发酵罐中按照70-80g/L的比例加入生物炭，发酵温度28-32℃，DO值为6-9mg/L，培养至对数生长期，获得发酵液；
f、向步骤e中获得的发酵液中按质量体积比18-23g/L加入灭菌的海藻酸钠，充分搅匀，获得悬浊液，备用；
g、制备18-23g/L的CaCl2无菌溶液，将步骤f获得的悬浊液逐滴注入到CaCl2溶液中获得固化小球，继续强化10-15h后过滤去除小球，在无菌条件下风干，获得生物炭负载PSB钝化剂。
6.根据权利要求4所述的生物炭负载PSB钝化剂的制备方法，其特征在于，步骤a中，采集重金属污染土壤5-10cm处的土壤置于蒸馏水中，于28-32℃恒温振荡培养22-26h后，接种于含有磷矿粉的选择性培养基中，进行再培养，即得到溶磷菌群。
7.根据权利要求4所述的生物炭负载PSB钝化剂的制备方法，其特征在于，步骤a中，含有磷矿粉的选择性培养基的配方为：10g葡萄糖，5gCa3(PO4)2，5gMgCl2·6H2O，0.25gMgSO4·7H2O，0.2gKCl,0.1g(NH4)2SO4，1000ml纯净水。
8.根据权利要求4所述的生物炭负载PSB钝化剂的制备方法，其特征在于，步骤b中，取步骤a的溶磷菌群混菌菌液进行离心处理，然后用灭菌的选择性培养基洗涤2-3次，然后接种到含有重金属Pb浓度为490-510mg/L的选择性培养基中，于28-32℃、110-130rpm条件下进行摇床培养7-8天，重新传代，进行驯化5-6次。
9.根据权利要求4所述的生物炭负载PSB钝化剂的制备方法，其特征在于，步骤b中，所述的灭菌的选择性培养基的配方为：5gCa3(PO4)2，5gMgCl2·6H2O，0.2gKCl,0.1gNH4NO3，1000ml蒸馏水；所述的含有重金属Pb的选择性培养基的配方为：5gCa3(PO4)2，5gMgCl2·6H2O，0.2gKCl,0.1gNH4NO3，0.5gPb(NO3)2，1000ml蒸馏水。
10.一种用权利要求1所述生物炭负载PSB钝化剂的制备方法制备的生物炭负载PSB钝化剂修复Pb污染土壤的方法，其特征在于，将生物炭负载PSB钝化剂与受污染的含磷土壤按质量比1:(900-1100)的比例混合，混合后填入土柱中，然后用地下水对土柱进行淋溶，保持湿度达到田间持水量的45-55％，室温稳定60-65天，实现对污染土壤的修复。
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