CN109628437B - 降低土壤镉含量的复合钝化剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种降低土壤镉含量的复合钝化剂的制备方法，主要包含以下步骤：步骤1：枯草芽孢杆菌依次经活化、扩培，获得枯草芽孢杆菌的菌悬液；步骤2：所得枯草芽孢杆菌的菌悬液浓度为108‑109cfu/mL，菌悬液与生物炭以体积：质量为2.5:1混合，振荡培养45‑55h，得到枯草芽孢杆菌‑生物炭复合体；步骤3：将枯草芽孢杆菌‑生物炭复合体与3％海藻酸钠溶液等体积混合，形成复合凝胶剂，用注射器将其逐滴滴入等体积的1％氯化钙溶液中，形成复合体微球，再静止24h，得到复合钝化剂。本发明还提供了复合钝化剂在油菜种植应用，经测定降低土壤中镉80.92％以及油菜中镉55.10％，同时生物含量提高75.86％。

Description

降低土壤镉含量的复合钝化剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及土壤重金属修复的技术领域，更具体地说，本发明涉及一种降低土壤镉含量的复合钝化剂及其制备方法与应用。
背景技术
2014年，国家环保部与国土资源部联合发布的《全国土壤污染状况调查公报(2014)》显示，全国土壤总的点位超标率为16.1％，其中镉(Cd)、汞、砷、铜、铅、铬、锌、镍8种无机污染物点位超标率分别为7.0％、1.6％、2.7％、2.1％、1.5％、1.1％、0.9％和4.8％，其中Cd超标率最高。由于利用强度高、化肥农药等投入量大、污水灌溉比例高等原因，菜地土壤Cd污染问题尤为突出。Cd在土壤-作物系统中的迁移性很强，易在作物体内富集，并通过食物链威胁人类健康。因此，选取合适方法修复土壤Cd污染，可降低土壤Cd生物有效性，恢复其正常的农业安全生产价值，使农产品达到国家食品卫生标准要求；同时可促进对有限耕地资源的高效利用，缓解人口增长与耕地减少的矛盾，有利于社会稳定发展。
目前生物炭在土壤重金属污染修复的研究多集中于生物炭的单独施用，将生物炭施到土壤，能增加土壤有机物质，提高土壤肥力，使作物增产。生物炭的施用能够显著影响土壤中重金属的形态和迁移行为，生物炭能降低土壤中Pb、Cd的酸可提取态含量，因而降低重金属的生物有效性，对重金属表现出很好的固定效果(孟莉蓉etal.，2018)。与活性炭等一些吸附材料相比，生物炭具有较低的吸附金属成本，是一种很有前途的吸附剂。Inyang等人研究发现生物炭对Pb、Ni、Cd和Cr的金属吸附能力分别为2.4-147mg/g、19.2-33.4mg/g、0.3-39.1mg/g和3.0-123mg/g(Inyangetal.，2016)。但是因为生物炭的孔隙度和官能团有限，其对于重金属的吸附能力仍低于活性炭等一些材料并且不能迅速和自然地扩散。对于浓度较高的受污染介质，需要在去除过程中添加大量的生物炭，从而增加了处理费用。研究发现炭化后的生物炭，基本保留了原有生物质的良好孔隙结构，具有较大的孔隙度和比表面积和丰富的土壤养分元素N、P、Ca、Mg、K及微量元素Mn、Zn、Cu等，同时生物炭还为土壤微生物提供更多载体(Chenetal.，2012)，生物炭作为一种土壤改良剂，可以减少土壤污染物对土壤微生物的毒性，有利于微生物数量和活性的增加(Andersonetal.，2014)。土壤微生物作为土壤中有生命的有机胶体，具有比表面积大，吸附及络合能力强等特点，因此微生物及其与土壤胶体成分的相互作用对重金属的修复有深刻的影响。微生物可以通过来对环境中重金属离子进行吸收、沉淀、固定、共价转化等方式，把重金属离子转化为低毒产物，从而降低环境中重金属的毒性。微生物修复重金属污染土壤因低成本、低能耗、高效率、无二次污染等特点具有非常好的应用前景。有研究表明研究枯草芽孢杆菌对土壤生物有效态Cd含量的影响，证实枯草芽孢杆菌可以降低土壤中有效Cd的含量，使有效态Cd向其他形态Cd转移(李晓晴，2013；纪宏伟etal.，2015)，但是枯草芽孢杆菌直接施加到土壤后受不同地区的土壤理化性质和农民使用技术参差不齐等因素的影响，容易导致的菌体活性下降，使得实际的钝化效果远低于理论效果。
生物炭和微生物施入土壤后均对土壤中重金属的修复起到一定作用，但是目前将生物炭修复与微生物修复相结合的研究较少。目前仅在戚鑫等人研究的生物炭固定化微生物对U、Cd污染土壤的原位钝化修复中，报道将枯草芽孢杆菌、柠檬酸杆菌和蜡样芽胞杆菌等比混合后制成菌悬液，与生物炭按体积质量比为100:10混合制备成干燥的吸附固定微生物生物炭，或者与生物炭按体积质量比为100:10混合后，再用质量分数2％的海藻酸钠及4％氯化钙溶液包埋固定，制备成干燥的包埋固定微生物生物炭，从文献中的图4中可分析出，在土壤中添加3％吸附固定微生物生物炭在75天处理后Cd去除率为56％；而添加3％包埋固定微生物生物炭在75天处理后，Cd浓度为1.75mg/kg，而空白对照浓度接近2.2mg/kg，根据文献中提供的去除率的计算公式，计算可得去除率在20.5％左右，虽然实现了重金属Cd一定程度上的降低，但是相对吸附固定微生物生物炭的去除率较低，且对于全国土壤总的点位超标率最高的Cd来说降低效果仍表现不够突出，并且在不同区域真正使用操作时，也会因土质及操作技术等条件使得实际结果和理论结果有所差异。
综合上述，生物炭和细菌在处理土壤重金属方面均有一定的效果，但是各自的弊端也非常突出，即使将二者混合施用，仍无法克服材料自身固有的缺陷以及制备方法上的改进。因此市场上亟需开发一种可以综合适用各种常规土壤环境，适用范围广，治理时效长，达到长效治理和不断扩大范围治理的目的，综合治理效果好且施用简便的、可降低土壤重金属镉的钝化剂。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供降低土壤镉含量的复合钝化剂的制备方法，将枯草芽孢杆菌的菌悬液和生物炭按2.5:1混合制备成复合体后，经3％的海藻酸钠溶液和1％的氯化钙溶液包埋固定而成的复合钝化剂，稳定性好且镉的去除率高。
本发明还有一个目的是提供一种利用降低土壤镉含量的复合钝化剂的制备方法制备成的复合钝化剂，可有效的将制备方法转换成产品，且易于操作和实现。
本发明还有一个目的是提供一种利用降低土壤镉含量的复合钝化剂在油菜种植中的应用，实际应用到油菜的盆栽试验中，可将土壤中有效态镉最高降低80.92％。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种降低土壤镉含量的复合钝化剂的制备方法，主要包含以下步骤：
步骤1：枯草芽孢杆菌依次经过活化、扩培后，获得枯草芽孢杆菌的菌悬液；其中，所得枯草芽孢杆菌的菌悬液的浓度为108-109cfu/mL；
步骤2：所得枯草芽孢杆菌的菌悬液和生物炭以体积：质量为2.5:1的比例混合后，振荡培养45-55h，得到枯草芽孢杆菌-生物炭复合体；
步骤3：所得枯草芽孢杆菌-生物炭复合体与质量百分比为3％的海藻酸钠溶液等体积混合均匀，形成复合凝胶剂；再用注射器将所得复合凝胶剂逐滴滴入等体积质量百分比为1％的氯化钙溶液中，边滴边搅拌以形成复合体微球，再静止24h，得到复合钝化剂。
优选的是，步骤1中所述活化的具体方法为：将保存的枯草芽孢杆菌接种到固体斜面斜面培养基中，在32-37℃，培养20-28h；
其中，所述固体斜面培养基包含以下重量份的组分：蛋白胨3-8份、牛肉膏1-3份、氯化钠1-3份、琼脂6-8份以及去离子水400-600份，并调节pH为7.6。
优选的是，步骤1种所述扩培的具体方法为：将活化后的枯草芽孢杆菌接种到液体培养基中，接种量按质量百分比为5-10％，在28-32℃、160-200rpm下振荡培养16-24h，获得所述枯草芽抱杆菌的菌悬液；
其中，所述液体培养基包含以下重量份的组分：蛋白胨3-8份、牛肉膏1-3份、氯化钠1-3份以及去离子水400-600份，并调节pH为7.6。
优选的是，步骤2所述生物炭是由麦秸秆碳化而成，具体制备方法为：将若干重量份的麦秸粉碎后，在350-550℃碳化2-3h后，冷却至室温，取出，经研磨后孔径为1-2毫米筛后，得到所述生物炭。
优选的是，步骤2中振荡培养的温度为：28-32℃，转速为：100-150rpm。
本发明还提供一种利用所述的降低土壤镉含量的复合钝化剂的制备方法制备成的复合钝化剂。
本发明还提供一种所述的利用降低土壤镉含量的复合钝化剂在油菜种植中的应用，其中，所述应用为：所述复合钝化剂按添加量为油菜种植土重量的1-5％添加到油菜种植土中，混合均匀，并调节混合后的种植土的田间最大持水量为60-70％，稳定25-35天后播种油菜籽。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明将枯草芽孢杆菌的菌悬液与生物炭按体积质量比2.5:1混合后，经振荡培养可以使枯草芽孢杆菌吸附挂膜，再与质量分数为3％的海藻酸钠溶液等体积混合，制成复合凝胶剂，避免使用过程中微生物活性的丧失和死亡，用注射器将复合凝胶剂向1％的氯化钙溶液逐滴滴加，可形成复合体微球，初步形成的复合剂微球静止交联24h，保证其稳定性，最后可获得能降低土壤镉含量的复合钝化剂，方法简单易操作，且经包埋固定的复合钝化剂有利于保持复合钝化剂施入土壤后的稳定性。经测量，本发明制备的复合钝化剂施入土壤后，土壤中有效态Cd最高可降低80.92％，同时可降低植物中镉含量47.56％，生物量提高75.86％，使本发明制备的复合钝化剂应用到农业生产上，在降低土壤及植物中的重金属Cd含量以及提高植物生物量方面具有重要的意义。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明所述的复合钝化剂、生物炭及枯草研报杆菌的菌悬液不同添加量对油菜生物量的影响；
图2为本发明所述的复合钝化剂、生物炭及枯草研报杆菌的菌悬液对油菜中Cd含量的影响；
图3为本发明所述的复合钝化剂、生物炭及枯草研报杆菌的菌悬液对土壤中Cd含量的影响。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供一种降低土壤镉含量的复合钝化剂的制备方法，主要包含以下步骤：
步骤1：枯草芽孢杆菌依次经过活化、扩培后，获得枯草芽孢杆菌的菌悬液；其中，所得枯草芽孢杆菌的菌悬液的浓度为108-109cfu/mL；
步骤2：所得枯草芽孢杆菌的菌悬液和生物炭以体积：质量为2.5:1的比例混合后，振荡培养45-55h，得到枯草芽孢杆菌-生物炭复合体；
步骤3：所得枯草芽孢杆菌-生物炭复合体与质量百分比为3％的海藻酸钠溶液等体积混合均匀，形成复合凝胶剂；再用注射器将所得复合凝胶剂逐滴滴入等体积质量百分比为1％的氯化钙溶液中，边滴边搅拌以形成复合体微球，再静止24h，得到复合钝化剂。
在上述方案中，将枯草芽孢杆菌的菌悬液与生物炭混合后，振荡培养可以使枯草芽孢杆菌吸附挂膜，再与质量分数为3％的海藻酸钠溶液等体积混合，制成复合凝胶剂，避免使用过程中微生物活性的丧失和死亡，用注射器中以每滴3秒的速率向1％的氯化钙溶液滴加，得到复合体微球，初步形成的复合剂微球静止交联24h，保证其稳定性，即可获得复合钝化剂。本发明制备的复合钝化剂经在盆栽油菜的种植土中应用，经测量，其土壤中有效态Cd最高可降低80.92％，以使本发明制备的复合钝化剂应用到农业生产上降低土壤中的重金属Cd具有重要的意义。
其中，本发明3％的海藻酸钠溶液是称取3g海藻酸钠溶于97mL去离子水中配制而成，并在121℃灭菌30min；称取1g氯化钙溶于99mL去离子水配制而成，并在121℃灭菌30min。
一个优选方案中，步骤1中所述活化的具体方法为：将保存的枯草芽孢杆菌接种到固体斜面斜面培养基中，在32-37℃，培养20-28h；
其中，所述固体斜面培养基包含以下重量份的组分：蛋白胨3-8份、牛肉膏1-3份、氯化钠1-3份、琼脂6-8份以及去离子水400-600份，并调节pH为7.6。
在上述方案中，通过斜面培养基可将保存的枯草芽孢杆菌活化，以保证菌种的活力。
一个优选方案中，步骤1种所述扩培的具体方法为：将活化后的枯草芽孢杆菌接种到液体培养基中，接种量按质量百分比为5-10％，在28-32℃、160-200rpm下振荡培养16-24h，获得所述枯草芽抱杆菌的菌悬液；
其中，所述液体培养基包含以下重量份的组分：蛋白胨3-8份、牛肉膏1-3份、氯化钠1-3份以及去离子水400-600份，并调节pH为7.6。
在上述方案中，通过液体培养基可将活化后的枯草芽孢杆菌进行转接培养，以富集菌种，使枯草芽孢杆菌浓度达到108-109cfu/mL，以保证菌体量以及形成有效数量的复合体微球。
一个优选方案中，步骤2所述生物炭是由麦秸秆碳化而成，具体包括以下步骤：将若干重量份的麦秸粉碎后，在350-550℃碳化2-3h后，冷却至室温，取出，经研磨后孔径为1-2毫米筛后，得到所述生物炭。
在上述方案中，经麦秸秆碳化制备的生物炭，充分利用废弃资源，变废为宝，并且生物炭的比表面积达1331m2/g，在施入土壤中可充分增加与土壤的接触面积，及增加土壤的透气性，有利于土壤中微生物数量和活性的增加。
一个优选方案中，步骤2中振荡培养的温度为：28-32℃，转速为：100-150rpm。
本发明还提供一种利用所述的降低土壤镉含量的复合钝化剂的制备方法制备成的复合钝化剂。
本发明还提供一种所述的利用降低土壤镉含量的复合钝化剂在油菜种植中的应用，其中，所述应用为：所述复合钝化剂按添加量为油菜种植土重量的1-5％添加到油菜种植土中，混合均匀，并调节混合后的种植土的田间最大持水量为60-70％，稳定25-35天后播种油菜籽。
实施例1
根据背景技术生物炭及微生物都能作为钝化剂降低土壤中重金属的含量，但是两者都存在各自的短缺，因此，充分利用各自优势将生物炭和微生物混合用于去除土壤的重金属的研究中，但是两者不同的混合比例会影响重金属的去除效果，本发明在实验前对枯草芽孢杆菌与生物炭的混合比例进行了预实验，以探究理想条件下效果最好的混合比例。
预实验：
1)按以下重量份的组分：蛋白胨5份、牛肉膏2.5份、氯化钠2.5份、琼脂7.5份以及去离子水500份，制备固体斜面培养基，并调节pH为7.6，经121℃灭菌20min，倒入试管形成斜面后冷却，然后用接种环挑取一环保存的枯草芽孢杆菌均匀涂布于固体斜面培养基上，再置于在35℃，培养24h进行活化。
2)按以下重量份的组分：蛋白胨5份、牛肉膏2.5份、氯化钠2.5份以及去离子水500份，制备液体培养基，并调节pH为7.6，经121℃灭菌20min，冷却，接种量按质量百分比为5％，在30℃、180rpm下振荡培养20h，得到枯草芽抱杆菌的菌悬液(菌浓108cfu/mL)。
3)取100份麦秸粉碎后置于马弗炉中，在380℃碳化2h后，冷却至室温，取出，经研磨后孔径为2毫米筛后，得到所述生物炭。
4)将枯草芽孢杆菌的菌悬液和生物炭按不同比例混合后，在30℃、120rpm振荡培养48h，得到枯草芽孢杆菌-生物炭复合体，将不同比例混合制备的枯草芽孢杆菌-生物复合体等体积加入1mmol/L的Cd原溶液，混合均匀，静置60-90天，稀释相同倍数后，再测定Cd最终浓度，并计算镉的去除率；每个比例的混合物设置三个重复，Cd最终浓度为三个重复的平均浓度。
表1不同比例配置的枯草芽孢杆菌-生物炭复合体对镉去除率的影响
Figure BDA0001931568170000071
Figure BDA0001931568170000081
根据表1可知，按不同比例混合的枯草芽孢杆菌-生物炭复合体对镉的去除率不同，在枯草芽孢杆菌的菌悬液和生物炭按不同体积质量比混合后，未表现出随着混合比例的变化出现线性关系，但是在枯草芽孢杆菌的菌悬液和生物炭按体积质量比为2.5:1混合时，对镉的去除率最高达到93.10％，其他混合比例下镉的去除率均低于93.10％。
另外，将枯草芽孢杆菌的菌悬液与生物炭按体积质量比为2.5:1混合制备成枯草芽孢杆菌-生物炭复合体，同时准备等体积的枯草芽孢杆菌的菌悬液、同等质量的生物碳，将三种不同钝化剂分别与1mmol/L的Cd原溶液混合均匀后，静置60-90天，稀释相同倍数后测定Cd最终浓度，并计算镉的去除率；其中，每种钝化剂设置三个重复，所测Cd浓度为三个重复的平均浓度。
表2不同钝化剂对镉去除率的影响
Figure BDA0001931568170000082
从表2中可知，枯草芽孢杆菌的菌悬液和生物炭混合后，相比单独使用枯草芽孢杆菌的菌悬液和生物炭表现出较强的去除镉的效果，经分析，可能由于枯草芽孢杆菌的菌悬液和生物炭混合后，由于生物炭具有较大比表面积的缘故，利于枯草芽孢杆菌在生物炭上附着，相当于增加了去除重金属的钝化剂，进而加强了两者之间对重金属镉的去除效果。
但是由于实验条件下，没有外界条件的干扰，而钝化剂施入土壤后或受到其他因素的影响，比如土质的酸碱性、雨水的冲刷、随肥水渗透流失等可能会影响钝化剂的试剂效果，导致枯草芽孢杆菌的菌悬液和生物炭混合后使用，尤其时间长了，会降低去除效果，因此，本发明先制备智按体积质量比2.5:1将枯草芽孢杆菌的菌悬液和生物炭混合制备成枯草芽孢杆菌-生物炭复合体，然后通过3％海藻酸钠溶液及1％氯化钙溶液进行包埋固定，再进行使用，具体以下实施例做了更详细的阐述。
实施例2
1)按以下重量份的组分：蛋白胨3份、牛肉膏1份、氯化钠1份、琼脂6份以及去离子水400-600份，制备固体斜面培养基，并调节PH为7.6，经121℃灭菌20min，倒入试管形成斜面后冷却，然后用接种环挑取一环保存的枯草芽孢杆菌均匀涂布于固体斜面培养基上，再置于32℃，培养20h进行活化。
2)按以下重量份的组分：蛋白胨3份、牛肉膏1份、氯化钠1份以及去离子水400份，制备液体培养基，并调节pH为7.6，经121℃灭菌20min，冷却，接种量按质量百分比为5％，在在28℃、160rpm下振荡培养16h，得到枯草芽抱杆菌的菌悬液。
3)将枯草芽孢杆菌的菌悬液和生物炭以体积：质量为2.5:1的比例混合后，在28℃、100rpm振荡培养45h，得到枯草芽孢杆菌-生物炭复合体。
4)称取3g海藻酸钠溶于97mL去离子水中配制得到包埋剂，称取1g氯化钙溶于99mL去离子水配制得到交联剂；将制备的枯草芽孢杆菌-生物炭复合体与所制备的包埋剂等体积充分混合制成复合体凝胶剂，再将配制好的复合体凝胶剂用注射器，以每滴3秒的速率向交联剂中滴加，得到复合体微球，初步形成的复合剂微球静止交联24h，得到复合钝化剂。
5)土壤中镉的去除率的测定
5.1供试土壤
土壤取自河北省保定市郊区漕河以南农田土壤的潮褐土。
如表3所示，其为土壤的基本理化性质。土壤pH值采用土与水的质量体积比为1:2.5混合后用pH计测定，电导率值采用土与水的质量体积比为1:5混合后用电导率仪测定。去除土壤中的杂质，配制的镉污染模拟土壤，其中镉总含量为10.08mg/kg，保持土壤湿润(田间最大持水量的60％)，稳定60天后备用。
表3土壤基本理化性质
Figure BDA0001931568170000101
5.2供试植物
油菜(绿海青梗菜)，购自青岛南北种业有限公司，分别选取籽粒饱满、大小均匀的油菜种子,采用消毒洗净备用。
5.3实验设计
设四个处理，分别为只添加重量为土壤总质量1％、3％和5％的生物炭(CB)，只添加体积为土壤质量1％、3％和5％的5×108cfu/mL枯草芽抱杆菌(BS)，添加体积为土壤质量1％、3％和5％的所制备的实施例2中的复合钝化剂(CM)以及空白(CK)，每个处理设置三个重复。保持土壤湿润(田间最大持水量的60％)，稳定30天，作为钝化材料修复镉污染土壤。
5.4盆栽种植及日常管理
为了防止营养缺乏，向土壤中按照N/P/K＝1.5:1:1.5比例施入底肥，调节土壤含水量至田间最大持水量的60％，将600g/盆的土壤装填于直径为10cm、高10cm塑料盆钵中，播种10颗油菜种子，出苗一周后间苗，每盆保留5株，置于人工温室培养。每周以称重法浇水补充土壤水分的蒸发损失，各处理在温室内随机排位，并间歇轮换，保证生长条件一致，培养期间视植物的生长状况定期追肥，确保根际环境中矿质养分的充分供给，避免植物生长过程养分胁迫的可能性发生。
5.5盆栽收获及样品采集
分别于植株种植40d破坏性采集植物和土壤样品，植物样品采集轻轻从土壤中取出植物样品，自来水冲洗干净，蒸馏水冲洗2-3次，用滤纸擦干，105℃杀青0.5h，再60℃下烘干至恒重，记录其干重，备用。土壤样品采集用不锈钢称样勺在已经收获的盆栽内挖取，土壤样品风干或冷冻干燥，备用。植物中的Cd含量采用HNO3-H2O2-HF消解，用ICP-MS进行测定。土壤中的有效态镉采用DTPA提取剂浸提，火焰原子吸收分光光度法测定(GB/T23739-2009)。
表4实施例2制备的复合钝化剂对植物生长和土壤Cd含量的影响
Figure BDA0001931568170000111
从表4分析可知，添加量相同时，与对照相比，经CB、BS以及CM处理的土壤，可使得油菜的生物量增加，油菜植株中的Cd含量和土壤中的Cd含量均有不同程度的降低；并且每个处理生物量随着添加量的增加而提高，而油菜植株中的Cd含量和土壤中的Cd含量随着添加量的增加而降低，并且在添加量为5％时，与对照相比，CB、BS以及CM各处理的生物量分别提高50.57％、33.33％和74.71％，油菜中的Cd含量分别降低30.34％、16.47％和54.20％，土壤中的Cd含量分别降低50.92％、32.50％和79.60％。
实施例3
1)按以下重量份的组分：蛋白胨8份、牛肉膏3份、氯化钠3份、琼脂8份以及去离子水600份，制备固体斜面培养基，并调节PH为7.6，经121℃灭菌20min，倒入试管形成斜面后冷却，然后用接种环挑取一环保存的枯草芽孢杆菌均匀涂布于固体斜面培养基上，再置于在37℃，培养28h进行活化。
2)按以下重量份的组分：蛋白胨8份、牛肉膏3份、氯化钠3份、琼脂8份以及去离子水600份，制备液体培养基，并调节pH为7.6，经121℃灭菌20min，冷却，接种量按质量百分比为5％，在32℃、200rpm下振荡培养24h，得到枯草芽抱杆菌的菌悬液。
3)将枯草孢杆菌的菌悬液和生物炭以体积：质量为2.5:1的比例混合后，在32℃、150rpm振荡培养55h，得到枯草芽孢杆菌-生物炭复合体。
4)称取3g海藻酸钠溶于97mL去离子水中配制得到包埋剂，称取1g氯化钙溶于97mL去离子水配制得到交联剂；将制备的枯草芽孢杆菌-生物炭复合体与所制备的包埋剂等体积充分混合制成复合体凝胶剂，再将配制好的复合体凝胶剂用注射器，以每滴3秒的速率向交联剂中滴加，得到复合体微球，初步形成的复合剂微球静止交联24h，得到复合钝化剂。
5)土壤中镉的去除率的测定
5.1-5.2同实施例2。
5.3实验设计
设四个处理，分别为只添加重量为土壤总质量1％、3％和5％的生物炭(CB)，只添加体积为土壤质量1％、3％和5％的5×108cfu/mL枯草芽抱杆菌(BS)，添加体积为土壤质量1％、3％和5％的所制备的实施例3中的复合钝化剂(CM)以及空白(CK)，每个处理设置三个重复。保持土壤湿润(田间最大持水量的60％)，稳定30天，作为钝化材料修复镉污染土壤。
5.4-5.5同实施例2。
表5实施例3制备的复合钝化剂对植物生长和土壤Cd含量的影响
Figure BDA0001931568170000121
Figure BDA0001931568170000131
从表5分析可知，添加量相同时，与对照相比，经CB、BS以及CM处理的土壤，可使得油菜的生物量增加，油菜植株中的Cd含量和土壤中的Cd含量均有不同程度的降低；并且每个处理生物量随着添加量的增加而提高，而油菜植株中的Cd含量和土壤中的Cd含量随着添加量的增加而降低，并且在添加量为5％时，与对照相比，CB、BS以及CM各处理的生物量分别提高48.27％、31.61％和73.56％，油菜中的Cd含量分别降低29.15％、15.87％和53.93％，土壤中的Cd含量分别降低50.39％、31.84％和79.87％。
实施例4
1)按以下重量份的组分：蛋白胨5份、牛肉膏2.5份、氯化钠2.5份、琼脂7.5份以及去离子水500份，制备固体斜面培养基，并调节PH为7.6，经121℃灭菌20min，倒入试管形成斜面后冷却，然后用接种环挑取一环保存的枯草芽孢杆菌均匀涂布于固体斜面培养基上，再置于在35℃，培养24h进行活化。
2)按以下重量份的组分：蛋白胨5份、牛肉膏2.5份、氯化钠2.5份以及去离子水500份，制备液体培养基，并调节pH为7.6，经121℃灭菌20min，冷却，接种量按质量百分比为5％，在30℃、180rpm下振荡培养20h，得到枯草芽抱杆菌的菌悬液。
3)将枯草孢杆菌的菌悬液和生物炭以体积：质量为2.5:1的比例混合后，在30℃、120rpm振荡培养48h，得到枯草芽孢杆菌-生物炭复合体。
4)称取3g海藻酸钠溶于97mL去离子水中配制得到包埋剂，称取1g氯化钙溶于99mL去离子水配制得到交联剂；将制备的枯草芽孢杆菌-生物炭复合体与所制备的包埋剂等体积充分混合制成复合体凝胶剂，再将配制好的复合体凝胶剂用注射器，以每滴3秒的速率向交联剂中滴加，得到复合体微球，初步形成的复合剂微球静止交联24h，得到复合钝化剂。
5)土壤中镉的去除率的测定
5.1-5.2同实施例2。
5.3实验设计
设四个处理，分别为只添加重量为土壤总质量1％、3％和5％的生物炭(CB)，只添加体积为土壤质量1％、3％和5％的5×108cfu/mL枯草芽抱杆菌(BS)，添加体积为土壤质量1％、3％和5％的所制备的实施例4中的复合钝化剂(CM)以及空白(CK)，每个处理设置三个重复。保持土壤湿润(田间最大持水量的60％)，稳定30天，作为钝化材料修复镉污染土壤。
5.4-5.5同实施例2。
表6实施例4制备的复合钝化剂对植物生长和土壤Cd含量的影响
Figure BDA0001931568170000141
Figure BDA0001931568170000151
从表6分析可知，添加量相同时，与对照相比，经CB、BS以及CM处理的土壤，可使得油菜的生物量增加，油菜植株中的Cd含量和土壤中的Cd含量均有不同程度的降低。
如图1-3所示，分别为实施例4制备的复合钝化剂、生物炭、枯草芽孢杆菌的菌悬液不同添加量对生物量、植物中镉含量及土壤中镉含量的影响，(图中CK1、CK2和CK3分别为不同钝化剂添加量1％、3％和5％时的空白对照；CB1、CB2和CB3分别为CB添加量1％、3％和5％时的生物量(图1)、植物中镉含量(图2)和土壤中镉含量(图3)；BS1、BS2和BS3分别为BS添加量1％、3％和5％时的生物量(图1)、植物中镉含量(图2)和土壤中镉含量(图3)；CM1、CM2和CM3分别为CM添加量1％、3％和5％时的生物量(图1)、植物中镉含量(图2)和土壤中镉含量(图3))，随着添加量的增加，对照的生物量，植物中镉含量及土壤中镉含量没有变化，而CB、BS及CM每个处理生物量随着添加量的增加而提高，而油菜植株中的Cd含量和土壤中的Cd含量随着添加量的增加而降低，并且在添加量为5％时，与对照相比，CB、BS以及CM各处理的生物量分别提高52.87％、35.06％和75.86％，油菜中的Cd含量分别降低31.80％、17.51％和55.10％，土壤中的Cd含量分别降低52.89％、34.34％和80.92％。本实施例是降低土壤镉和油菜中镉含量以及增加油菜生物量的最优方案。
由上述数据分析，实施例2-4中，不同条件下制备的复合钝化剂施入种植油菜的土壤中，与CK相比较，CB、BS以及CM各个指标均有变化，且同一处理中同一添加量，生物量提高量、油菜中镉降低量以及土壤中镉降低量均为实施例4＞实施例2＞实施例3，而又由于同一实施例中统一处理随着添加量的增加，生物量提高量、油菜中镉降低量以及土壤中镉降低量均成增加状态，因此，实施例4是最优的制备复合钝化剂的方案，而按实施例4制备的复合钝化剂添加量为5％，生物量提高量、油菜中镉降低量以及土壤中镉降低量达到最高状态。虽然实施例1预实验中，单独使用枯草研报杆菌-生物炭复合体对配置的镉原溶液表现出93.10％的去除率，但是实施到栽培中的土壤中对土壤中镉的去除率有所降低降低，经分析，可能由于预实验是无其他因素影响的理想条件下进行表现出理想的结果，但是施入土壤后，由于油菜栽培过程中根据生育阶段不同施肥施水、土壤中本身也存在有益菌和有害菌多种微生物、温度不恒定等因素，可能导致微生物菌种在土壤中固定不牢固或者存在竞争关系等，损害枯草芽孢杆菌的生存环境，导致死亡数增加或者随水肥流失等；而经海藻酸钠和氯化钙包埋固定的枯草研报杆菌-生物炭复合体和理想环境下的枯草研报杆菌-生物炭复合体相比，去除率降低，但能达到80.92％，去除效果表现仍较显著，并且包埋固定后的复合钝化剂稳定性高，不易随着生长周期的延长发生变化。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (7)

1.一种降低土壤镉含量的复合钝化剂的制备方法，其中，主要包含以下步骤：
步骤1：枯草芽孢杆菌依次经过活化、扩培后，获得枯草芽孢杆菌的菌悬液；其中，所得枯草芽孢杆菌的菌悬液的浓度为108-109cfu/mL；
步骤2：所得枯草芽孢杆菌的菌悬液和生物炭以体积：质量为2.5:1的比例混合后，振荡培养45-55h，得到枯草芽孢杆菌-生物炭复合体；
步骤3：所得枯草芽孢杆菌-生物炭复合体与质量百分比为3％的海藻酸钠溶液等体积混合均匀，形成复合凝胶剂；再用注射器将所得复合凝胶剂逐滴滴入等体积质量百分比为1％的氯化钙溶液中，边滴边搅拌以形成复合体微球，再静止24h，得到复合钝化剂。
2.如权利要求1所述的降低土壤镉含量的复合钝化剂的制备方法，其中，步骤1中所述活化的具体方法为：将保存的枯草芽孢杆菌接种到固体斜面培养基中，在32-37℃，培养20-28h；
其中，所述固体斜面培养基包含以下重量份的组分：蛋白胨3-8份、牛肉膏1-3份、氯化钠1-3份、琼脂6-8份以及去离子水400-600份，并调节pH为7.6。
3.如权利要求1所述的降低土壤镉含量的复合钝化剂的制备方法，其中，步骤1中所述扩培的具体方法为：将活化后的枯草芽孢杆菌接种到液体培养基中，接种量按质量百分比为5-10％，在28-32℃、160-200rpm下振荡培养16-24h，获得所述枯草芽抱杆菌的菌悬液；
其中，所述液体培养基包含以下重量份的组分：蛋白胨3-8份、牛肉膏1-3份、氯化钠1-3份以及去离子水400-600份，并调节pH为7.6。
4.如权利要求1所述的降低土壤镉含量的复合钝化剂的制备方法，其中，步骤2所述生物炭是由麦秸秆碳化而成，具体制备方法为：将若干重量份的麦秸粉碎后，在350-550℃碳化2-3h后，冷却至室温，取出，经研磨后孔径为1-2毫米筛后，得到所述生物炭。
5.如权利要求1所述的降低土壤镉含量的复合钝化剂的制备方法，其中，步骤2中振荡培养的温度为：28-32℃，转速为：100-150rpm。
6.一种利用如权利要求1-5任意一项所述的降低土壤镉含量的复合钝化剂的制备方法制备成的复合钝化剂。
7.一种如权利要求6所述的利用降低土壤镉含量的复合钝化剂在油菜种植中的应用，其中，所述应用为：所述复合钝化剂按添加量为油菜种植土重量的1-5％添加到油菜种植土中，混合均匀，并调节混合后的种植土的田间最大持水量为60-70％，稳定25-35天后播种油菜籽。
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