CN107557313A

CN107557313A - 一种钝化农田镉污染及促水稻增产的复合调理剂

Info

Publication number: CN107557313A
Application number: CN201710654103.3A
Authority: CN
Inventors: 蓝健益; 姜明国; 杨齐; 江朝明; 陆富海; 黄斌良; 吴华德; 黄燕菲
Original assignee: Guangxi Duodele Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangxi Duodele Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-08-03
Filing date: 2017-08-03
Publication date: 2018-01-09
Anticipated expiration: 2037-08-03
Also published as: CN107557313B

Abstract

本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一种钝化农田镉污染及促进水稻增产的复合调理剂。一种钝化农田镉污染及促进水稻增产的复合调理剂，其由短小芽孢杆菌和丛枝菌根真菌组成，二者的质量百分比为短小芽孢杆菌菌粉20‑40％，丛枝菌根真菌60‑80％。本发明的复合调理剂可明显的降低镉在水稻籽实中的富集；本发明的复合调理剂在低镉浓度下能确保水稻根系正常生长，降低了镉对水稻根系的毒害作用，对于缓解水稻生长过程中的逆境胁迫及保护水稻健康生长有着很好的作用。

Description

一种钝化农田镉污染及促水稻增产的复合调理剂

技术领域

本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一种钝化农田镉污染及促水稻增产的复合调理剂。

背景技术

土壤重金属污染治理的传统方法一般有化学法、物理法。这些方法通常处理价格昂贵，而且容易造成土壤结构破坏和影响微生物菌群，形成“二次污染”。更无法治理大面积的污染。在目前已经开展的土壤重金属污染修复技术中，以植物提取土壤中重金属的方法是主要手段之一，这种方法是利用对重金属有超常累积能力并且对重金属有一定耐受能力的植物，将土壤中的重金属提取迁移到植物体内，在适当的时期将植物收获后，便可将土壤中过多的重金属移除，从而实现对重金属污染土壤的净化。但也存在富集植物生物量小、修复需时长等局限性，而土壤中重金属的生物活性及环境行为对植物修复技术有决定性的影响。微生物修复技术通过土壤中某些微生物(芽孢杆菌、光合细菌、乳酸菌、霉菌等)对重金属进行吸附、沉淀、氧化、还原、螯合、生物甲基化、细胞内累计等作用以降低污染土壤中镉的活性和毒性。此外，微生物修复法还有操作简单、成本低、环境友好、不影响农业生产、可大面积推广应用等优点。菌根真菌是与植物营养根形成的共生体的真菌。菌根真菌生活在活的植物根部，从中获取必需的碳水化合物和其他的一些物质，但同时又向植物的根系提供植物生长所需的营养物质、酶类和水分，是一种相互有利的共生关系。广泛的例子表明菌根真菌能够抵抗重金属污染胁迫作用。菌根真菌在其中发挥的作用有两个方面：一是通过菌根真菌的固持作用，将土壤中重金属元素固定和吸附，进而积聚在菌根菌丝、泡囊及植物根系等各个部位，减少了污染土壤中的重金属元素向植株地上部分的转运；另外，菌根真菌通过促进植物的生长，植物生物量的增加所产生的“生物稀释”效应，可以间接地使植物体内重金属含量减少，菌剂的添加可以减弱土壤重金属元素对于植物植株的损伤，因此采用微生物-菌根真菌联合修复耕地土壤重金属污染可作为土壤重金属修复研究的一个重要方向。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

针对当前广泛存在的水稻田受重金属镉污染的情况，本发明提供种钝化农田镉污染及促水稻增产的复合调理剂。

本发明所提供的技术方案是：

一种钝化农田镉污染及促水稻增产的复合调理剂，其由短小芽孢杆菌和丛枝菌根真菌组成，二者的质量百分比为短小芽孢杆菌菌粉20-40％，丛枝菌根真菌60-80％。

作为优选，所述的短小芽孢杆菌的分类命名为短小芽孢杆菌Bacillus pumilusSD1-1，保藏编号CGMCC No.13628，保藏日为2017年01月19日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明还提供了所述的钝化农田镉污染及促水稻增产的复合调理剂在钝化镉污染上的应用。

本发明还提供了所述的钝化农田镉污染及促水稻增产的复合调理剂在促进作物生长上的应用。

所述的筛选吸收镉的微生物的具体方法，包括如下步骤：

(1)样品采集：所述样品来源于多得乐肥料厂(以蘑菇渣为主要原料) 以及肥沃土壤样品。

(2)菌株分离：配制分离固体培养基，每升含有蛋白胨10g、酵母膏5g、 NCl 10g、琼脂15g；pH 7.0；121℃湿热灭菌20min；冷却至55-60℃时倒平板；将采集的样品稀释涂平板，37℃培养1-3天，根据菌落生长情况挑取单菌落，转接到新的固体分离培养基上。

(3)菌株筛选：配制筛选液体培养基，每升含有：10.0g葡萄糖，8.0g 酵母膏，8.0g蛋白胨，3.0g硫酸铵，3.0g磷酸二氢钾，3.0mg镉，用蒸馏水补足体积；筛选培养基pH 7.0，分装10瓶，每瓶100mL，115℃灭菌20min；将步骤2分离获得的单菌落接种到液体筛选培养基中，37℃,180rpm培养1 天；12000rpm离心5min去除菌体，测定上清中镉剩余含量，选择使镉含量降低幅度最大的菌株作下一步研究。

所述短小芽孢杆菌Bacillus pumilusSD1-1固体制备方法，包括如下步骤：

(1)配制LB液体培养基，每升含有：10.0g蛋白胨，5.0g酵母膏，10.0 g氯化钠，pH7.0；121℃灭菌20min。

(2)种子液制备：将于4℃冰箱保存的短小芽孢杆菌Bacillus pumilusSD1-1取出，挑取菌落接种于配制好的LB培养基中，37℃，180rpm 培养16h备用。

(3)固体发酵培养基制备，固体培养基每千克包括：400g麦麸，100g 豆粕，水500g。充分混匀后用干净纱布包实，121℃条件灭菌40min。冷却至50-55℃。

(4)接种：将步骤2制备获得的种子液接种到步骤3的固体培养基中，搅拌均匀，在37℃条件培养2天。

(5)干燥，粉碎：将步骤4培养好的菌种在45℃烘箱干燥或者太阳晒干至水分含量小于20％；用粉碎机粉碎备用。

所述丛枝菌根真菌的制备方法，包括如下步骤：

(1)宿主制备：取白三叶草种子，用体积分数为10％的H₂0₂进行消毒， 28℃催芽。

(2)基质制备：取沙子、蛭石、土壤以体积比5:3:2进行充分混合。

(3)待80％的种子露白进行播种，播种时先在盆中加入基质2kg，后加入30g摩西球囊霉(Funnelliformis mosseae)和适量种子，在用0.5kg基质覆盖。

(4)待三叶草生长至三个月后，收获内含侵染植物根段、菌丝及孢子体的根际土作为接种材料。

本发明采用以下方法制备水稻栽培土样，包括以下步骤：

(1)试验采用盆栽的方法进行，每盆先装2kg土壤。

(2)所用土壤经自然风干后磨碎，经121℃下高温高压蒸汽灭菌2h，以保证去除土壤中原本含有的细菌和丛枝菌根真菌。

(3)以Cd标准液的形式，将Cd均匀加入供试土壤，共设置0、0.1、0.2、 0.3、0.4、0.5、1mg·kg^-1(纯Cd计)七个模拟浓度梯度。

(4)将短小芽孢杆菌Bacillus pumilusSD1-1菌粉与菌根真菌按2：8的质量比进行混合。

(5)同一镉浓度梯度下设置不接种(CK)和接种(CM)两个处理，每个处理3个重复。

(6)每盆接种复合菌剂50g，花盆装土后，将复合菌剂均匀平铺于花盆表面，之后加0.5kg土覆盖。

本发明采用以下方法进行水稻栽培，包括以下步骤：

(1)水稻种子用0.1％-0.2％的高锰酸钾溶液浸泡24小时；

(2)将浸泡好的水稻种子放置于托盘，在28℃恒温箱中加水浸润催芽10天；

(3)将长势相对良好且均匀的秧苗移栽到试验用塑料盆中，每盆留苗12 株；

(4)将所有水稻移至室外，在完全自然的环境下生长，2016年8月收割。本发明对添加复合菌剂的含镉土壤与未添加任何微生物的含镉土壤产出水稻含镉量进行了检测。检测方法按照国家标准NY/T1100-2006关于石墨炉原子吸收光谱法对稻米中铅、镉的测定。

本发明还用以下方法测定在施用复合菌剂与未施用复合菌剂时的水稻生长指标，包括以下步骤：

(1)株高(cm)：在水稻成熟收获期，用刻度尺测量从水稻茎基部至水稻穗顶部的长度，每个处理取10个样本的平均值。

(2)根长(cm)：于水稻成熟收获期，用刻度尺测量水稻根系最长的主根长，每个处理取10个样本的平均值。

(3)生物量(g)：以水稻根系附近土壤为介质，将水稻连同根系和根系土一同挖出，将水稻根系周围的土壤去除，然后用蒸馏水冲洗，之后用去离子水洗净后，将水稻装入干净的纸袋中。将处理好的水稻样品放入电热恒温鼓风干燥箱中，先经105℃杀青5分钟后，在70℃条件下烘干24小时至恒重，将水稻样品分为地上部分和地下部分，分别称重记录。

(4)籽实产量(g)：于水稻成熟收获期，称量每株水稻的籽实重量，每个处理取10个样本计算不同处理组的水稻产量平均值。

本发明采用以下方法测定复合菌株对镉富集及转运过程的影响，包括以下步骤：

(1)水稻植株根系镉含量测定：收获成熟水稻植株根系，用液氮磨碎。过100目筛，称量0.1g，以湿法消解，样品消解液用原子吸收光谱法测定其中的镉含量，之后根据稀释浓度计算水稻根系镉含量。

(2)水稻茎叶镉含量测定：收获成熟水稻植株茎叶，用液氮磨碎。过100 目筛，称量0.1g，以湿法消解，样品消解液用原子吸收光谱法测定其中的镉含量，之后根据稀释浓度计算水稻茎叶镉含量。

(3)水稻籽实镉含量测定：收获成熟水稻籽实，用不锈钢粉碎机粉碎。过100目筛，称量0.1g，以湿法消解，样品消解液用原子吸收光谱法测定其中的镉含量，之后根据稀释浓度计算水稻籽实镉含量。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的的复合调理剂可明显的降低镉在水稻籽实中的富集。

(2)本发明的的复合调理剂在低镉浓度下能确保水稻根系正常生长，降低了镉对水稻根系的毒害作用，对于缓解水稻生长过程中的逆境胁迫及保护水稻健康生长有着很好的作用。

附图说明

图1为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus SD1-1在LB平板上的菌落形态；

图2-1为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus SD1-1的16S rRNA和Bacillus pumilusCLB-4菌株16S rRNA序列比对结果(1-600bp)；

图2-2为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus SD1-1的16S rRNA和Bacillus pumilusCLB-4菌株16S rRNA序列比对结果(601-1200bp)；

图2-3为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus SD1-1的16S rRNA和Bacillus pumilusCLB-4菌株16S rRNA序列比对结果(1201-1382bp)；

图3为不同镉处理浓度下复合菌株对水稻株高的影响拟合曲线图；

图4为不同镉处理浓度下复合菌株对水稻根长的影响拟合曲线图；

图5为不同镉处理浓度下复合菌株对水稻生物量的影响拟合曲线图；

图6为不同镉处理浓度下复合菌株对水稻籽实产量的影响拟合曲线图；

图7为不同镉处理浓度下水稻根部镉浓度拟合曲线图；

图8为不同镉处理浓度下水稻茎叶部镉浓度拟合曲线图；

图9为不同镉处理浓度下水稻籽实镉浓度拟合曲线图。

保藏信息说明

短小芽孢杆菌Bacillus pumilus SD1-1，其保藏编号为CGMCC No.13628，保藏日期为2017年01月19日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院生物研究所。

具体实施方式

以下实施例以便更好的理解本发明，并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

筛选培养基配方：葡萄糖10g、酵母膏8g、蛋白胨8g、KH₂PO₄ 3g、 (NH₄)₂SO₄ 3g、Cd标准液(1000μg/mL)1.5mL；用800mL去离子水溶解，然后调节pH值至6.0(用1M HCl和1M NaOH调节)；用去离子水定容至 1L；115℃湿热灭菌30min。

镉标准曲线的制作：镉标准曲线的制作参照中华人民共和国国家标准 GB7475-87关于《水质铜、锌、铅、镉的原子吸收分光广度法》。具体为：配制不同浓度的镉标准液时统一用蒸馏水稀释5倍的筛选培养基(未添加镉) 作为溶剂。分别配制0.05mg/L、0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L、1mg/L的镉标准液各10mL。配制好的标准液用火焰原子分光广度仪进行测定。得到光吸收值和镉浓度的标准曲线，标准曲线的函数式为y＝0.3431x+0.0084， R²＝0.9993。其中y为光吸收值，x为镉浓度(mg/L)。

实施例1：吸收镉菌株的筛选鉴定

一、菌株的获得

1、菌株采集：2015年9月与中国广西南宁市双定镇多得乐肥料厂有机肥原料堆(蘑菇渣)取样100g一个，肥料厂沃土样品取样100g一个。

2、吸收镉元素菌株的分离筛选

(1)用去离子水配制分离培养基，每升含有蛋白胨10g、酵母膏5g、 NCl 10g、琼脂15g；pH7.0；121℃湿热灭菌20min；冷却至55-60℃时倒平板。

(2)取10g样品放入250mL三角瓶中，加入90mL无菌水并加入适量的玻璃珠，于磁力搅拌器上搅拌30min。是样品与水充分混合，将细胞分散。取1mL土壤悬液加入盛有9mL无菌水的指形瓶中充分混匀，然后从中取出 1mL加入盛有9mL无菌水的指形瓶中充分混匀。以此类推，制成10^-1、10^-2、 10^-3、10^-4、10^-5等不同稀释度的样品溶液。取10^-3、10^-4、10^-5 3个稀释度各100 μL样品涂布在分离培养基上，37℃恒温培养。

(3)24h后，观察细菌菌落生长情况，挑取单菌落，转接到新的筛选培养基上，划线分离纯化。

(4)配制pH7.0的筛选培养基(液体)，培养基成分为：葡萄糖10g、酵母膏8g、蛋白胨8g、KH₂PO₄ 3g、(NH₄)₂SO₄ 3g、Cd标准液(1000μg/mL) 1.5mL；用800mL去离子水溶解，然后调节pH值至7.0(用1M HCl和1M NaOH调节)；用去离子水定容至1L；115℃湿热灭菌30min。

(5)将步骤(3)得到的细菌接种到液体培养基中。37℃，180rpm培养，其中细菌培养1天，真菌培养三天。

(6)细菌培养液12000rpm离心5min，收集上清液，用蒸馏水稀释5 倍后测定剩余镉的含量。真菌培养液12000rpm离心15min，收集上清液，用蒸馏水稀释5倍后测定剩余镉的含量。通过剩余镉含量的测定筛选出具有吸收镉能力的菌株。

(7)实验结果表明本次分离到的SD1-1，SD1-2，SD1-3，SD1-5， SD2-1,SD2-3，SD2-4在液体培养条件下均有吸收培养液中镉元素的能力。从菌落形态观察，除SD1-5为丝状真菌，其余菌株为芽孢杆菌类细菌。其中SD1-5 在37℃，180rpm培养3天对含镉量为1.5mg/L的培养液镉吸收效率为65％； SD1-1，SD1-2，SD1-3，SD2-1，SD2-3，SD2-4在37℃，180rpm培养1天对浓度为1.5mg/L的镉元素吸收效率分别为100％，77％，78.3％，79％，88.7％， 80.9％。本发明仅以吸收效率最高的SD1-1菌株为对象，研究其种属，固体制备方法以及在被镉污染水稻上的具体应用。

二、SD1-1菌株的固体培养

1、配制LB液体培养基，每升含有：10.0g蛋白胨，5.0g酵母膏，10.0g 氯化钠，pH7.0；121℃灭菌20min。

2、种子液制备：将于4℃冰箱保存的菌株SD1-1取出，挑取菌落接种于配制好的LB培养基中，37℃，180rpm培养16h备用。

3、固体发酵培养基制备，固体培养基每千克包括：400g麦麸，100g豆粕，水500g。充分混匀后用干净纱布包实，121℃条件灭菌40min。冷却至 50-55℃。

4、接种：将步骤2制备获得的种子液接种到步骤3的固体培养基中，搅拌均匀，在37℃条件培养2天。

5、干燥，粉碎：将步骤4培养好的菌种在45℃烘箱干燥或者太阳晒干至水分含量小于20％；用粉碎机粉碎备用。

三、菌株的鉴定

如图1所示，菌株SD1-1在LB培养基上的形态，在37℃培养24h后，呈白色菌落，菌落表面光滑，不透明，菌落边缘不规则，菌落半径约2mm。

如图2-1到2-3所示，菌株SD1-1的分子鉴定结果，以37℃，180rpm 培养24h的SD1-1菌液为模板，利用引物K1:5-aactgaagagtttgatcctggctc-3，K2:5-tacggttaccttgttacgactt-3扩增得到其16S rRNA，经测序获得一条长1382bp 的核苷酸序列，测序得到的序列为SEQ ID NO.1所示，经同源性比对分析表明，其与Bacillus pumilus CLB-416S rRNA序列的同源性为100％。

四、丛枝菌根真菌的制备

本发明采用以下方法制备丛枝菌根真菌，包括如下步骤：

1、宿主制备：取白三叶草种子，用体积分数为10％的H₂0₂进行消毒，28℃催芽。

2、基质制备：取沙子、蛭石、土壤以体积比5:3:2进行充分混合。

3、待80％的种子露白进行播种，播种时先在盆中加入基质2kg，后加入 30g摩西球囊霉(Funnelliformis mosseae)和适量种子，在用0.5kg基质覆盖。

4、待三叶草生长至三个月后，收获内含侵染植物根段、菌丝及孢子体的根际土作为接种材料。

五、水稻生长指标测定

(1)株高(cm)：于水稻成熟收获期，用刻度尺测量从水稻茎基部至水稻穗顶部的长度，每个处理取10个样本的平均值。

如图3所示，通过对水稻植株高度与土壤镉处理浓度的拟合曲线可以看出，在没有添加外源Cd²⁺时，CM组水稻平均株高为71.7±1.1cm，而CK组为66.9.1±0.7cm，CM组比CK组提高7.17％。随着镉处理浓度的提高，水稻株高呈现先增高后下降的趋势，重金属含量越高则水稻株高生长受到的抑制越强。当镉处理浓度达到试验最大值1mg·kg^-1，水稻株高受到明显的抑制，表明此浓度下镉胁迫已对水稻株高生长造成明显影响，进而影响水稻植株的生长发育。

另外，施加复合菌剂(m短小芽孢杆菌：m菌根真菌＝2：8)可以明显的缓解这种抑制作用，增强水稻抗镉胁迫的能力，表明在低镉浓度下AMF对水稻的镉胁迫有一定的保护作用，降低了其对水稻生长的损害，缓解了低镉污染土壤对水稻产生的负面影响。

(2)根长(cm)：在水稻成熟收获期，用刻度尺测量水稻根系最长的主根长，每个处理取10个样本的平均值。

如图4所示，通过对水稻根长与土壤镉处理浓度的拟合曲线可以看出，在没有添加外源镉的条件下，CM组水稻平均根长为22.9±0.3cm，而CK组仅为19.6±1.0cm，GM组比CK组平均高出3.3cm，提高16.8％。随着Cd²⁺胁迫浓度的提高，水稻根长呈现先升高后下降趋势，达到抑制浓度后，重金属含量越高则水稻根长生长受到的抑制作用越强。当镉处理浓度达到试验最大值1mg·kg^-1，水稻根长生长受到明显的抑制，表明此浓度下镉胁迫已对水稻根系生长造成明显影响，进而影响水稻植株的生长发育。而菌剂的施加可以明显的缓解这种抑制作用，增强水稻抗镉胁迫的能力。表明在低镉浓度下复合菌能确保水稻根系正常生长，降低了镉对水稻根系的毒害作用，对于缓解水稻生长过程中的逆境胁迫及保护水稻健康生长有着很好的作用。

如图5所示，通过对水稻生物量与不同镉处理浓度的拟合曲线可以看出，水稻生物量随着镉胁迫浓度的增加总体呈现下降的趋势，CM组的水稻生物量整体高于CK组，CM组比CK组平均增加幅度为17.5％。复合菌剂侵染水稻根系后，菌根与根系形成良好的互利共生，促进水稻生长，增加干物质的积累，增强水稻的生长和抗逆境能力，缓解低镉污染对水稻的胁迫作用。

如图6所示，通过对水稻籽实产量与不同镉处理浓度的拟合曲线可以看出，低镉条件下，随着镉胁迫浓度的提高，水稻籽实产量呈现逐渐降低的趋势，而CM组较CK组籽实产量平均提高12.7％。表明在低镉胁迫条件下，施加复合菌剂不仅促进水稻对于营养物质的吸收，还可以缓解了重金属胁迫给植物生长带来的不利影响，从而保证了水稻的生产。

六、复合菌株对镉富集及转运过程的影响测定

标准曲线绘制：准确量取镉标准使用液0.00mL，5.0mL，10.0mL，20.0 mL，30.0mL，40.0mL于6个50mL容量瓶中，用硝酸溶液定容至刻度。镉浓度为0.0μg/L，50.0μg/L，100.0μg/L，200.0μg/L，300.0μg/L，400.0μg/L。镉标准样品依次用火焰原子分光光度仪进行测定。试验测得镉的标准曲线为 y＝0.3543x+0.0118，R²＝0.9985。

水稻植株根系镉含量测定：收集成熟水稻根系，洗净，取适量放入干净的研钵中，然后用液氮磨碎。消解方法参照国家标准NY/T 1100-2006《稻米中铅、镉测定的石墨炉原子吸收光谱法》中的方法，样品消解液火焰原子吸收光谱法测定其中的镉含量，之后根据稀释浓度计算水稻植株根系镉含量。

如图7所示，通过对水稻根系镉含量与不同镉处理浓度拟合曲线可以看出，随着土壤中镉含量的增加，水稻根系镉含量随之增长，在试验所设浓度梯度内，土壤镉含量与水稻根系镉含量呈现线性相关的关系。在不同的土壤镉处理浓度下，CM组相比于CK组水稻根系镉含量均较高，这表明复合菌剂的加入，促进了水稻植株根系对于土壤中重金属镉的固定，从而在一定程度上减少了镉想水稻植株地上部分转运。

茎叶镉含量测定：收集成熟水稻茎叶样品，洗净，取适量放入干净的研钵中，用液氮磨碎。消解方法参照国家标准NY/T 1100-2006《稻米中铅、镉测定的石墨炉原子吸收光谱法》中的方法，样品消解液火焰原子吸收光谱法测定其中的镉含量，之后根据稀释浓度计算水稻植株茎叶镉含量。

如图8所示，通过水稻茎叶镉含量与不同镉处理浓度拟合曲线可以看出，水稻茎叶镉含量会随着土壤镉含量的增加而增大。在不同的土壤镉处理浓度下，CM组的水稻茎叶镉含量均不同程度CK组，这表明复合菌剂的加入可促进水稻植株根系对于土壤中重金属镉的固定，减少了其向地上部分的转运。

七、含镉稻米样品处理及镉含量测定

待稻谷成熟，收集稻谷，分别将CK组合和CM组的稻谷进行晒干、脱壳。对稻米中镉含量的测定参照国家标准NY/T 1100-2006《稻米中铅、镉测定的石墨炉原子吸收光谱法》的方法进行，具体操作为：

1、配0.5mol/L的硝酸溶液：吸取。3.2mL硝酸(ρ＝1.42g/mL)加入 50mL水中，稀释至100mL。

2、配制100mg/L镉标贮备准液：准确称取0.1000g光谱金属镉于50mL 烧杯中，加入20mL稀硝酸(1+5)，微热溶解，冷却后转移至1000mL，用水定容至标线，摇匀。

3、配制500μg/L镉标准液：临用前将镉标准贮备溶液用步骤1的获得硝酸溶液逐级稀释至目标浓度。

4、配制混合酸溶液：硝酸(ρ＝1.42g/mL)：高氯酸(ρ＝1.68g/mL)＝4:1

5、样品消解：1，2，3号盆收集的稻米，各称取30g。经研磨至全部通过孔径0.25mm尼龙筛，然后称取1g试样(精确到0.001g)于100mL锥形瓶中，加入混合酸10mL及数粒玻璃珠，摇匀后放置过夜。加一小漏斗，放在电热板上缓慢加热，若变棕黑色，应稍冷，补上少量硝酸，继续加热直至冒白烟，消化液呈无色透明或略带黄色。取下冷却，用水定量转移并定容到 25mL，混合待测。同时做空白试验。

如图9所示，随着土壤中镉浓度的提高，水稻籽实中的镉含量也随之增加，但CM组的籽实镉含量均不同程度低于CK组，添加复合菌剂可明显的降低镉在水稻籽实中的富集。这可能是因为菌剂的添加使镉更多的在根系固定或被钝化，减少了其向地上部分的转运。另一方面水稻生物量的增加对镉在水稻体内的浓度有一定的稀释作用。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西多得乐生物科技有限公司

<120> 一种钝化农田镉污染及促进水稻增产的复合调理剂

<130> ZYWS

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1382

<212> DNA

<213> Bacillus pumilus

<400> 1

gaagggagct tgctcccgga tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc 60

ctgtaagact gggataactc cgggaaaccg gagctaatac cggatagttc cttgaaccgc 120

atggttcaag gatgaaagac ggtttcggct gtcacttaca gatggacccg cggcgcatta 180

gctagttggt ggggtaatgg ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga 240

tcggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc 300

ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat 360

cgtaaagctc tgttgttagg gaagaacaag tgcgagagta actgctcgca ccttgacggt 420

acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca 480

agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg 540

aaagcccccg gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag 600

gagagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc 660

gaaggcgact ctctggtctg taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg 720

attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg 780

ccccttagtg ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact 840

gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa 900

gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac aaccctagag atagggcttt 960

cccttcgggg acagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 1020

tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca 1080

ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg 1140

ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggacag aacaaagggc tgcaagaccg 1200

caaggtttag ccaatcccat aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact 1260

gcgtgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg 1320

gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagttgcaac acccgaagtc ggtgaggtaa 1380

cc 1382

Claims

1.一种钝化农田镉污染及促进水稻增产的复合调理剂，其特征在于，其由短小芽孢杆菌和丛枝菌根真菌组成，二者的质量百分比为短小芽孢杆菌菌粉20-40％，丛枝菌根真菌60-80％。

2.根据权利要求1所述的钝化农田镉污染及促进水稻增产的复合调理剂，其特征在于，所述的短小芽孢杆菌的分类命名为短小芽孢杆菌Bacilluspumilus SD1-1，保藏编号CGMCCNo.13628，保藏日为2017年01月19日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

3.根据权利要求1或2所述的钝化农田镉污染及促进水稻增产的复合调理剂在钝化镉污染上的应用。

4.根据权利要求1或2所述的钝化农田镉污染及促进水稻增产的复合调理剂在促进作物生长上的应用。