CN116590195B - 假黄单胞菌、微生物制剂以及它们的应用 - Google Patents

假黄单胞菌、微生物制剂以及它们的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开了一株假黄单胞菌、微生物制剂以及它们的应用。本发明提供的假黄单胞菌的保藏编号为CCTCCNO:M2023001，通过生理生化和分子鉴定发现，该菌株属于假黄单胞菌属的新物种。通过对该菌株的生物学特性进行检测，发现该菌具有解磷、产铁载体能力，产铁载体能力达到18.54％。此外，本发明提供的假黄单胞菌还对番茄幼苗具有良好的促生效果，采用该菌株培养液对番茄幼苗进行灌根处理后，株高、茎围等都得到了大幅提高。

Description

假黄单胞菌、微生物制剂以及它们的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株假黄单胞菌、微生物制剂以及它们的应用。
背景技术
随着经济发展和农业产业改革，实现绿色、经济可持续的农业生产模式成为农业产业的发展目标。具有植物促生功能的微生物产品的使用对于减少化肥和农药的施用量，改善土壤质量，提高农产品品质等具有重要意义，因而相关微生物资源的研究和开发工作成为本领域热点之一。
目前研究发现的具有促进植物生长的微生物种类繁多，总得来说，这些微生物促进植物生长的机制主要包括：能够产生促进植物生长的代谢产物；能够拮抗有害菌，或者能够与作物种植环境中的有益菌产生协同作用；能够促进土壤中有害物质的分解，提高土壤质量；具有固氮、解磷、解钾等功能，从而可以提高土壤中能够被植物吸收利用的营养物质含量；本身能够参与并促进植物的生长和代谢，从而促进植物生长等。
然而，目前对于促进植物生长的微生物的研究大多侧重于某个或某些生物学功能，而对于菌株整体性能的研究较少。而且，随着生物技术的发展，目前对于促进植物生长的微生物资源的开发更多地依赖于人工诱变筛选和基因工程改造等人工手段，获得的菌株虽然在实验室环境中能够表现出优异的效果，但是在实际使用中由于环境变化较大，许多都难以表现出研究阶段的促生效果水平，导致开发成本高但实际应用困难等问题。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一株假黄单胞菌、微生物制剂以及它们的应用。本发明提供的假黄单胞菌具有良好的解磷和产铁载体功能，可以有效促进植物生长。而且该菌株是一株从自然环境中分离获得的林木根际细菌，对于自然环境适应性好，且能够很好地在植物根际定殖，从而可以稳定发挥促生效果。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一株假黄单胞菌，该菌株的保藏编号为CCTCC NO:M 2023001。
本发明第二方面提供一种制备铁载体的方法，所述方法包括对第一方面所述的假黄单胞菌进行培养，并收集培养产物。
本发明第三方面提供一种具有促进植物生长功能的微生物制剂，所述微生物制剂中的活性成分包括含有第一方面所述的假黄单胞菌的菌剂，和/或第一方面所述假黄单胞菌的代谢产物。
本发明第四方面提供第一方面所述的假黄单胞菌，或者，第三方面所述的微生物制剂在促进植物生长中的应用。
本发明第五方面提供一种促进植物生长的方法，所述方法包括将第一方面所述的假黄单胞菌和/或其代谢产物，或者第三方面所述的微生物制剂施用于植物根际土壤中。
通过上述技术方案，本发明至少能够取得如下有益效果：
(1)经鉴定，本发明提供的假黄单胞菌CCTCC NO：M 2023001属于假黄单胞菌属的新物种，该菌株的发现对于丰富假黄单胞菌属菌种具有重要意义，为科研和生产应用提供了新的选择。
(2)本发明提供的假黄单胞菌CCTCC NO：M 2023001具有解无机磷的能力，并且具有较好的产铁载体能力。经实验发现，该菌株还对于植物具有良好的促生效果，对于农业生产以及绿色农业产业发展具有积极作用。而且，上述功能都是目前假黄单胞菌属细菌中未报道的，从而该菌株具有很好的研究和保护价值。
附图说明
图1是实施例1中菌株YIM B06474的菌落形态图。
图2是实施例1中菌株YIM B06474的系统发育树。
图3是实施例2中菌株YIM B06474的解无机磷效果图。
图4是实施例3中菌株YIM B06474的产铁载体效果图。
图5A和图5B是实施例4中菌株YIM B06474的植物促生效果图。
生物保藏
本发明提供的假黄单胞菌，分类命名为Pseudoxanthomonas sp.YIM B06474，已于2023年1月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2023001。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
植物根际促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)泛指广泛存在于各种植物的根系或根际土壤中，能够在植物发育和生长过程中产生一定有益的作用的细菌或真菌。目前已鉴定出的PGPR菌株主要分布在芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、固氮菌属(Azotobacter)、固氮螺菌属(Azospirillum)等。
假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)是Finkmann等人在2000年描述提出的新的细菌属，该属中发现的菌种较少，而且目前尚未有报道假黄单胞菌属的微生物具有促进植物生长的功能。
本发明的发明人在研究的过程中自哀牢山自然保护区的林木根际土壤中偶然分离获得一株假黄单胞菌属的细菌，命名为YIM B06474。经鉴定，其应当属于假黄单胞菌属的一个新种。经过研究发现，该菌株具有良好的解磷效果，而且能够产铁载体，施用于土壤中时对于植物生长具有很好的促进作用，这些特征都是之前对于假黄单胞菌属细菌的研究和报道中未发现的。
基于此，本发明第一方面提供一株假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas sp.)，该菌株的保藏编号为CCTCC NO:M 2023001。
本发明第二方面提供第一方面所述的假黄单胞菌在解磷或产铁载体中的应用。
本发明第三方面提供一种制备铁载体的方法，所述方法包括对第一方面所述的假黄单胞菌进行培养，并收集培养产物。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述培养的条件包括：培养温度25-30℃，培养时间30-60h。
根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述培养采用摇瓶的方式进行时，可以在培养过程中采用100-200rpm的转速振荡培养。
本发明第四方面提供一种具有促进植物生长功能的微生物制剂，所述微生物制剂中的活性成分包括含有第一方面所述的假黄单胞菌的菌剂，和/或第一方面所述假黄单胞菌的代谢产物。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述微生物制剂中，所述假黄单胞菌的含量不低于1×106CFU/g，优选为1×107-1×1010CFU/g(当所述微生物制剂为液体制剂时，按照1mL＝1g进行换算)。
为了使得微生物制剂的性质更加稳定，方便保存和运输，根据本发明的优选实施方式，其中，所述微生物制剂中还可以含有辅料。任意本领域中可以用于微生物制剂中的辅料均可适用于本发明。优选所述辅料选自赋形剂(例如木薯淀粉、山梨醇等)、保护剂(例如糖类保护剂、谷氨酸钠、氯化钙等)和缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液、碳酸氢钠、氧化镁等)中的至少一种。
本发明的发明人在研究中发现，本发明提供的假黄单胞菌(或基于该菌株制成的菌剂等微生物制剂)在施用于植物时，能够有效促进植物生长，提高植物的株高、茎围，促进根部发育。
本发明第五方面提供第一方面所述的假黄单胞菌，或者，第四方面所述的微生物制剂在促进植物生长中的应用。
本发明中，“促进植物生长”是指促进植物对土壤中营养元素的吸收，提高植物的生长速度，例如提高植物的株高、径长、根长、植株重量、果实重量和品质等，或者缩短植物的生长周期，促进植物的根系生长发育等。
本发明第六方面提供一种促进植物生长的方法，所述方法包括将第一方面所述的假黄单胞菌和/或其代谢产物，或者第四方面所述的微生物制剂施用于植物根际土壤中。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述假黄单胞菌的施用量不低于1×108CFU/株/次，优选为1×109-1×1012CFU/株/次。
优选地，所述假黄单胞菌的施用频率为每茬作物施用1-3次。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述微生物制剂的用量使得：假黄单胞菌的施用量不低于1×108CFU/株/次，优选为1×109-1×1012CFU/株/次。
优选地，所述微生物制剂的施用频率为每茬作物施用1-3次。
优选地，所述植物选自茄科植物，优选为茄属植物，最优选为番茄。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于示例性地进一步解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。
以下实施例中，未做特殊说明的情况下，采用的试剂和材料均为购自正规化学/生物试剂或材料供应商的商购产品，试剂均为分析纯。
以下实施例中，未作特殊说明的情况下，操作温度均为室温(25±5℃)。
实施例1
本实施例用于说明假黄单胞菌CCTCC NO：M 2023001的获得、鉴定和保藏。
(一)菌株分离纯化
菌株分离和纯化过程中采用的培养基配制方法如下：
将BG11培养基、光合细菌培养基以及平板计数肉汤培养基(PCB培养基)按照1:1:1的重量比混合，然后加入15g/L琼脂，121℃高压灭菌15min。
其中，BG11培养基、光合细菌培养基和PCB培养基均购自海博生物技术有限公司(产品编号分别为HB8793、HB8882、HB8756)。
采用稀释涂布平板法和平板划线法从采集自云南省玉溪市哀牢山自然保护区的林木根际土壤样品中分离纯化得到一株细菌，命名为YIM B06474。
(二)菌株鉴定
1、分子鉴定
采用Chelex提取法提取菌株YIM B06474的总DNA作为模板，采用细菌通用引物(序列分别为上游引物：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'；下游引物：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')，采用表1中的反应体系和条件进行16S rRNA扩增。
表1PCR体系和条件
扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，(采用广州美基生物科技有限公司生产的胶回收纯化试剂盒)纯化回收后，送至北京擎科生物科技有限公司进行测序。测序结果经在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和EZBiocloud数据库(https://www.ezbiocloud.net/)比对分析。采用系统发育学分析方法，选用同源性较高的模式菌株16S rRNA序列作为参比对象，用Clustal X 1.8软件进行多序列比对，计算供试菌株与参比菌株序列的相似性。系统发育分析时排除碱基缺失位点，采用邻接法(Neighbor-joininganalysis)用MEGA 7.0构建供试菌株与参比菌株之间的系统发育树。其中，Bootstrap值设定为1000，其余均为默认值。
图2示出了绘制的菌株YIM B06474的系统发育树，从中可以看出，YIM B06474与脓性假黄单胞菌(Pseudoxanthomonasputridarboris)同源性最高，但同源率低于98.7％，根据Jongsik Chun在2018年发表的为原核生物分类使用基因组数据提出的最低标准，可以判断菌株YIM B06474为假黄单胞菌属的新种。
2、细菌形态特征及生理生化特征鉴定
参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对菌株YIM B06474进行生理生化测定，描述菌落形态特性。
菌落&细胞形态：图1示出了菌株YIM B06474在NA培养基上的菌落形态，从图中可以看出，该菌株菌落为近圆形，边缘整齐，浅黄色，菌落中间略凸起，湿润、有光泽。
生理生化特征：菌株YIM B06474革兰氏染色为阴性，盐耐受范围为0-4％(w/v)，pH耐受范围为5.5-9，说明该菌株具有一定的耐盐性和耐酸碱性。过氧化氢酶和氧化酶活性均为阳性；产碱性磷酸酶、酯酶(C4)、酯酶脂肪酶(C8)、亮氨酸芳基酰胺酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、N-乙酰基-β-氨基葡萄糖苷酶和α-甘露糖苷酶呈阳性结果；脂肪酶(C14)、缬氨酸芳酰胺酶、胱氨酸芳基酰胺酶、α-胰凝乳蛋白酶、β-葡萄糖醛酸酶、α-葡萄糖苷酶和α-岩藻糖苷酶呈阴性结果；可以同化D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、N-乙酰葡糖胺和苹果酸；无法同化D-甘露糖、柠檬酸盐、D-甘露醇、D-葡萄糖酸盐、癸酸盐、己二酸酯或苯乙酸酯。
进一步将菌株YIM B06474与Pseudoxanthomonasputridarboris菌株的表型特征进行比较，结果如下表2所示。根据比较结果可以看出，菌株YIM B06474与参考菌株Pseudoxanthomonasputridarboris均不可以将硝酸盐还原成亚硝酸盐，氧化酶和过氧化氢酶试验均呈阳性，甲基红，V-P均为阴性，均可以水解明胶和七叶皂苷，均不利用己二酸，均存在β-半乳糖苷酶(2-萘基-d-吡喃半乳糖苷)和N-乙酰基-β-葡萄糖胺酸酶；但是菌株YIMB06474在水解吐温80，利用D-甘露糖、脲酶、β-半乳糖苷酶(PNPG)和苹果酸，胰蛋白酶和类脂酶(C14)活性等方面与参考菌株Pseudoxanthomonas putridarboris存在差异。根据以上结果，YIM B06474应归类为代表假黄单胞菌属的成员，并作为新物种类型的菌株。
表2 YIM B06474与Pseudoxanthomonasputridarboris的表型特征比较结果
3、鉴定结果
结合菌株YIM B06474的分子检测结果以及细菌形态特征及生理生化特征检测结果，鉴定该菌株为假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas sp.)。
(三)菌株保藏
将上述获得的假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas sp.)YIM B06474于2023年1月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2023001。
实施例2
本实施例用于说明假黄单胞菌CCTCC NO：M 2023001的解磷效果。
(一)定性检测
无机磷固体培养基配制方法：称取葡萄糖10g、硫酸铵0.5g、氯化钠0.3g、七水硫酸镁0.3g、七水硫酸铁0.03g、四水硫酸锰0.03g、氯化钾0.3g、磷酸三钙2g，加入到1000mL水中溶解，调节pH至7.3±0.1，加入琼脂18±2g。121℃高压灭菌20min。
将实施例1中获得的菌株YIM B06474采用四点接种法接种在无机磷培养平板上，重复接种3个平板。接种完成后将平板置于28℃恒温培养箱内培养5天，培养期间每天观察细菌生长状况及菌落周围透明圈产生情况。
图3中示出了菌株YIM B06474的解无机磷效果。从图中可以看出，菌株YIM B06474在无机磷培养平板上培养时能够产生透明圈，说明该菌株具有解无机磷能力。
(二)定量测试
无机磷液体培养基配制方法：称取葡萄糖10g、硫酸铵0.5g、氯化钠0.3g、氯化钾0.3g、七水硫酸镁0.3g、七水硫酸铁0.03g、四水硫酸锰0.03g、磷酸三钙5g，加入到1000mL水中溶解，调节pH至7.3±0.1，121℃高压蒸汽灭菌,20min。
采用NB液体培养基(购自海博生物技术有限公司，产品编号为HB0108)对菌株YIMB06474进行活化，将2mL活化液(活菌数含量约为5×107CFU/mL)接种到装有200mL无机磷液体培养基的300mL三角瓶中，30℃下150rpm摇床培养7天。以未接种菌株YIM B06474的培养基为空白对照，每个处理3个重复。每天取样培养液，并将获得的培养液样品10000rpm离心10min，取上清液采用钼锑抗比色法检测培养液中水溶性磷的含量。绘制菌株YIM B06474培养液中可溶解磷含量标准曲线(y＝0.4064x+0.069，R2＝0.9989)，按照绘制的标准曲线计算可得培养7天的解磷量约为0.22mg/L。
具体计算方法：每次取2mL培养液12000rpm离心10min后，取1mL上清液加入50mL容量瓶，加2滴2,6-二硝基苯酚作指示剂，缓慢加入5mL钼锑抗显色剂，用蒸馏水定容，摇匀后静置30min，在700nm波长下比色。读出待测液的吸光值，代入标准曲线与式(1)的公式中计算。
P＝K×V/V1 式(1)
式(1)中，P为培养液中可溶性磷含量；K为从标准曲线得到的可溶性磷含量(mg/L)；V为定容的体积(mL)；V1为吸取上清液的体积(mL)
实施例3
本实施例用于说明假黄单胞菌CCTCC NO：M 2023001的产铁载体效果。
(一)定性检测
采用CAS法对实施例1中获得的菌株YIM B06474的产铁载体能力进行定性检测。
CAS显色剂配制方法：
将60.5mg铬天青S(Chrome Azurol S，CAS)加到50mL去离子水中，然后与10mL的Fe3+溶液(1mM FeCl3·6H2O,10mM HCl))混合。
水琼脂显色剂配制方法：
在100mL蒸馏水中加入1.5g琼脂，121℃高压灭菌20min，获得水琼脂。
待水琼脂冷却至不烫手时(约50℃)，在100mL水琼脂中加入10mL的CAS显色剂。即得水琼脂显色剂。
采用四点接种法将菌株YIM B06474接种在双层琼脂平板(下层为水琼脂显色剂，上层为LB固体培养基)上，重复接种3个平板，置于30℃恒温培养箱中培养5天，观察下层水琼脂显色剂的颜色变化情况。
图4示出了菌株YIM B06474的产铁载体效果。从图中可以看出，在菌落周围的培养基产生了桔黄色晕圈，说明该菌株能够产生铁载体。
(二)定量检测
将菌株YIM B06474接种在LB液体培养基中，于30℃恒温摇床上150rpm培养48h，培养结束后吸取2mL培养液用0.22μm无菌滤膜过滤，加入等体积的CAS显色剂，静置1h后用全波长酶标仪测定接菌的菌液OD630(记作“As”)，用相同方法测定未接菌的液体培养基的OD630作为参比值(记作“Ar”)。铁载体的浓度用铁载体活性单位(siderophore unit,SU)表示，SU＝[(Ar-As)/Ar]×100％，测定重复3次，取平均值进行比较。
根据检测结果计算得到菌株YIM B06474在LB液体培养基中培养48h可产铁载体浓度为18.54％。
实施例4
本实施例用于说明假黄单胞菌CCTCC NO：M 2023001对植物的促生效果。
制备菌剂：将实施例1中获得的菌株YIM B06474接种于含250mL的NB液体培养基的500mL三角瓶中，28℃下150rpm震荡培养48h，所得发酵液稀释100倍后获得的稀释液即为菌株YIM B06474菌剂(稀释液中活菌数含量约为5×108CFU/mL)。
植株种植：在每个的花盆中加入相同重量的土壤，按照每个处理3盆随机分组，每盆中栽种6株长势相近的番茄幼苗。
促生效果验证：在番茄幼苗移栽到花盆后第8天用120mL/株的上述YIM B06474菌剂对番茄幼苗进行灌根处理，同时采用等量在相同的培养条件下震荡培养48h的NB培养基对番茄幼苗进行相同处理作为对照组(CK)。
灌根处理后的番茄幼苗置于室外使其自然生长。灌根处理14天和28天时，分别测量番茄植株的茎直径和株高。
具体测量方法如下：
茎直径：在离花盆土壤表面1-1.5cm处用游标卡尺测量番茄植株的茎直径大小，各组数据取平均值±标准差即为该组番茄植株的茎直径。
株高：利用直尺测量每株番茄植株顶端到花盆土壤表层的距离，各组数据取平均值±标准差即为该组番茄植株的株高。
结果详见图5A和图5B，其中，图5A为灌根处理后14天和28天时处理组和对照组的番茄幼苗的茎直径比较结果，图5B为灌根处理后14天和28天时处理组和对照组的番茄幼苗的株高比较结果。
表3中示出了处理14天和28天，对照组和实验组番茄幼苗的株高和茎直径测量结果。经计算，灌根处理28天后，与对照组相比，处理组的株高和茎直径净增长率分别为32％和21％左右，处理组和对照组存在显著性差异。说明菌株YIM B06474的施用对于番茄的生长具有显著促进作用，而这也是首次发现的假黄单胞菌属细菌对于植物具有促生作用的效果。
表3番茄幼苗植株生长状况
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (16)

1.一株假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas sp.)，其特征在于，该菌株的保藏编号为CCTCC NO:M 2023001。
2.权利要求1所述的假黄单胞菌在解磷或产铁载体中的应用。
3.一种制备铁载体的方法，其特征在于，所述方法包括对权利要求1所述的假黄单胞菌进行培养，并收集培养产物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述培养的条件包括：培养温度25-30℃，培养时间30-60h。
5.一种具有促进植物生长功能的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中的活性成分包括含有权利要求1所述的假黄单胞菌的菌剂。
6.根据权利要求5所述的微生物制剂，其中，所述微生物制剂中，所述假黄单胞菌的含量不低于1×106CFU/g。
7.根据权利要求6所述的微生物制剂，其中，所述微生物制剂中，所述假黄单胞菌的含量为1×107-1×1010CFU/g。
8.根据权利要求5所述的微生物制剂，其中，所述微生物制剂中还含有辅料。
9.根据权利要求8所述的微生物制剂，其中，所述辅料选自赋形剂、保护剂和缓冲剂中的至少一种。
10.权利要求1所述的假黄单胞菌，或者，权利要求5-9中任意一项所述的微生物制剂在促进植物生长中的应用。
11.一种促进植物生长的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1所述的假黄单胞菌，或者权利要求5-9中任意一项所述的微生物制剂施用于植物根际土壤中。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述假黄单胞菌的施用量不低于1×108CFU/株/次；或者
所述微生物制剂的用量使得：假黄单胞菌的施用量不低于1×108CFU/株/次。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述假黄单胞菌的施用量为1×109-1×1012CFU/株/次；或者
所述微生物制剂的用量使得：假黄单胞菌的施用量为1×109-1×1012CFU/株/次。
14.根据权利要求11所述的方法，其中，所述假黄单胞菌的施用频率为每茬作物施用1-3次；或者
所述微生物制剂的施用频率为每茬作物施用1-3次。
15.根据权利要求11-14中任意一项所述的方法，其中，所述植物选自茄科植物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述植物为番茄。
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