CN102250794A

CN102250794A - 一种日本假黄单胞菌和微生物菌剂及它们的应用

Info

Publication number: CN102250794A
Application number: CN2011101671495A
Authority: CN
Inventors: 郭萍; 朱昌雄; 田云龙; 刘雪; 李峰; 叶婧
Original assignee: Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculturem of CAAS
Current assignee: Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculturem of CAAS
Priority date: 2011-06-21
Filing date: 2011-06-21
Publication date: 2011-11-23
Anticipated expiration: 2031-06-21
Also published as: CN102250794B

Abstract

本发明提供了一种保藏号为CGMCCNo.4797的日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonasjaponensis），以及含有此日本假黄单胞菌的微生物菌剂，还提供了所述日本假黄单胞菌或微生物菌剂在降解石油烃中的应用、在生物修复石油污染中的应用、在生物修复石油污染的土壤中的应用、以及在生物修复石油污染的水体中的应用。本发明提供的保藏号为CGMCCNo.4797的日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonasjaponensis）及含有该菌的微生物菌剂对石油烃具有很强的降解能力，可以广泛地应用于降解石油烃以及对石油污染的修复，如对石油污染的土壤的修复和对石油污染的水体的修复等。

Description

一种日本假黄单胞菌和微生物菌剂及它们的应用

技术领域

本发明涉及一种日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas japonensis），以及一种含有该日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas japonensis）作为活性成分的微生物菌剂和它们的应用；更确切地说，涉及一种保藏号为CGMCC No. 4797的日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas japonensis），以及含有此日本假黄单胞菌的微生物菌剂，还涉及所述日本假黄单胞菌或微生物菌剂在降解石油烃中的应用、在生物修复石油污染中的应用、在生物修复石油污染的土壤中的应用、以及在生物修复石油污染的水体中的应用。

背景技术

当今世界，石油已经成为人类最主要的能源之一，大量的石油及其加工品进入土壤造成土壤的石油污染，给人类乃至整个生物圈带来危害，从而成为世界性的环境问题。在对石油污染的研究中，生物修复作为一种潜在的高效、低成本的清洁技术正日益受到重视。

生物修复（Bioremediation）是指通过生物（特别是微生物）催化降解有机污染物，从而修复被污染的环境或消除环境中的污染物的受控的或自发进行的过程。

“石油烃”是石油及其加工品中的主要污染成分，研究发现微生物对石油烃能够起到降解作用。微生物降解石油烃是19世纪末发现的。20世纪50年代前，以美国C.E.佐贝尔为代表，对海洋微生物降解石油烃进行了广泛的研究。50年代初气相色谱问世，放射性同位素示踪法的普遍应用，对研究石油烃的微生物降解机制起了积极的作用。60年代以来，由于海上石油污染日趋严重，促使不少沿海国家，如美国、加拿大、日本、英国和苏联等国，积极开展了有关海洋微生物降解石油烃的研究工作。70年代中期，美国学者还用基因工程的技术培育了“超级微生物”，以期能有效地降解石油烃。

中国自1975年起，先后对青岛胶州湾、渤海、厦门港、黄海和东海石油降解微生物的数量、分布、种类组成和影响降解因素等进行了调查研究。

在影响微生物对石油烃的降解的主要因素中，微生物的生理特性是决定降解石油烃能力的关键因素之一。目前已经分离得到的微生物菌株对石油烃降解能力还较低，因此，迫切需要开发出一种能够高效降解石油烃的微生物菌株及相关的微生物菌剂。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的微生物菌株对石油烃的降解能力低的缺点，提供一种能够高效地降解石油烃的微生物菌株及相关的微生物菌剂和应用。

为了实现第一个发明目的，提供了一种日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas japonensis），其中，该日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas japonensis）的保藏编号为CGMCC No. 4797。

为了实现第二个发明目的，提供了一种降解石油烃的微生物菌剂，其中，该微生物菌剂含有日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas japonensis）作为活性成分，其中，该日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas japonensis）的保藏编号为CGMCC No. 4797。

此外，本发明还提供了所述日本假黄单胞菌或所述微生物菌剂在降解石油烃中的应用。

本发明还提供了所述日本假黄单胞菌或所述微生物菌剂在生物修复石油污染中的应用。

本发明还提供了所述日本假黄单胞菌或所述微生物菌剂在生物修复石油污染的土壤中的应用。

本发明还提供了所述日本假黄单胞菌或所述微生物菌剂在生物修复石油污染的水体中的应用。

本发明的日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas japonensis）菌株是通过大量筛选工作筛选到的，该菌株对石油烃具有很强的降解能力。该菌株已于2011年04月28日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No. 4797。本发明提供的保藏号为CGMCC No. 4797的日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas japonensis）及含有该菌的微生物菌剂对石油烃具有很强的降解能力，可以广泛地应用于降解石油烃以及对石油污染的修复，如对石油污染的土壤的修复和对石油污染的水体的修复等。

附图说明

图1显示了本发明筛选的保藏号为CGMCC No. 4797的日本假黄单胞菌（Pseudoxant homonas japonensis）在固体TSA培养基上培养24小时的形态；

图2显示了本发明筛选的保藏号为CGMCC No. 4797的日本假黄单胞菌（Pseudoxant homonas japonensis）在固体TSA培养基上培养24小时后经菌苔染色后在光学显微镜的100倍油镜下的形态。

具体实施方式

本发明提供了一种日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas japonensis），其中，该日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas japonensis）的保藏编号为CGMCC No. 4797。经过16s rDNA扩增与测序分析，保藏编号为CGMCC No. 4797的菌株具有SEQ ID NO：1所示的16s rDNA序列。

本发明还提供了一种降解石油烃的微生物菌剂，其中，该微生物菌剂含有日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas japonensis）作为活性成分，其中，该日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas japonensis）的保藏编号为CGMCC No. 4797。所述微生物菌剂中含有的日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas japonensis）的量可以在很大范围内改变，优选情况下，每克所述微生物菌剂所含的总活菌数可以为0.1-2.5×10¹⁰个，更优选为0.5-1×10¹⁰个。

根据本发明，所述微生物菌剂还含有培养基，所述培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、石油筛选培养基和PDA培养基中的一种或几种，优选为牛肉膏蛋白胨培养基。上述培养基能够商购得到或者根据“微生物培养基手册”（Microbiology Culture Media Manual）的记载制备得到。例如，所述牛肉膏蛋白胨培养基可以含有牛肉膏、蛋白胨、NaCl和水，其中，相对于100重量份的牛肉膏，蛋白胨的含量可以为150-250重量份，NaCl的含量可以为50-150重量份，水的含量可以为15000-25000重量份，pH值可以为7.2-7.4；培养基中加入1.2重量%的琼脂可制成固体培养基。

本发明还提供了保藏号为CGMCC No. 4797的日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas japonensis）及含有该菌株的微生物菌剂在降解石油烃中的应用。

本发明还提供了保藏号为CGMCC No. 4797的日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas japonensis）及含有该菌株的微生物菌剂在生物修复石油污染中的应用。

本发明还提供了保藏号为CGMCC No. 4797的日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas japonensis）及含有该菌株的微生物菌剂在生物修复石油污染的土壤中的应用。

本发明还提供了保藏号为CGMCC No. 4797的日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas japonensis）及含有该菌株的微生物菌剂在生物修复石油污染的水体中的应用。

下面通过具体的实施例对本发明进行更进一步的说明。

实验材料

一、筛选菌种的石油样品：

采自胜利油田的原油与市售0#柴油按1：4的比例混合均匀，作为实验用石油。

二、土壤样品为采自山东胜利油田的三种不同的石油污染土壤样品的1：1：1的混合物，其分别为：

1）采油井周围的落地原油污染土壤；

2）油泥沙；和

3）长期堆放油泥沙的耕层土。

三、培养基

1）富集培养基：K₂HPO₄·3H₂O 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NH₄NO₃ 1.0g，CaCl₂ 0.02g，蒸馏水1000mL，调至PH7.0，121℃灭菌20min，待冷却后加入5g石油。

2）分离培养基（PDA培养基）：马铃薯粉6.0g，葡萄糖20g，琼脂20g，加入蒸馏水直至1000ml，并在115℃高压灭菌20分钟备用。

3）菌种保存培养基：牛肉膏蛋白胨培养基

4）石油筛选培养基（液体）：NaNO₃ 1.5g，(NH4)₂SO₄ 1.5g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，KCl 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，CaCl₂ 0.002g，蒸馏水1000mL，调至pH8.0，121℃灭菌20min，冷却后加入2.5g石油。培养基中加入1.2重量%的琼脂制成固体筛选培养基。

5）固体TSA培养基：胰蛋白胨 15g，大豆胨5g，氯化钠30g，琼脂15g，加入蒸馏水直至终体积为1000ml，pH值为7.1-7.5。

实施例1

1、石油烃降解菌株的富集分离

称取5g石油污染土壤混合物加入装有100mL富集培养基的250mL三角瓶中，于28℃、180r/min的恒温摇床条件下培养，5天后吸取5mL培养液转接至新鲜的富集培养基，相同条件培养5天，如此连续富集培养25天，培养液经梯度稀释后涂布在固体PDA培养基上，于28℃培养；待平板长出菌落后，挑取不同形态的单菌落采用划线分离法反复进行分离纯化，直到得到单菌株的纯培养物，纯化后的菌株保存于牛肉膏蛋白胨培养基斜面。

2、高降解活性菌株的筛选

将上述纯化的菌株分别接种到装有100mL筛选培养基的250mL三角瓶中，28℃、180r/min的条件下培养5天，将培养液稀释100倍后涂布在固体筛选培养基上，观察各菌株在固体培养基中的生长情况，筛选出生长较快、菌落较多的菌株。

挑取各菌株的单菌落分别接种到装有50ml液体牛肉膏蛋白胨培养基的250ml三角瓶中，在28℃、180r/min的恒温摇床中培养24h，测定菌液在600nm处的吸光度，用灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基调节其质量浓度使OD600nm约为0.4，以此稀释的菌液作种子接种筛选培养基。

吸取5ml准备好的种子液接种到装有100mL筛选培养基的250mL三角瓶中，在28℃、180r/min的恒温摇床中培养4天后测定石油含量，每一种子液的处理重复三次，计算平均降解率，筛选出石油降解率最高的菌株，并对该菌株进行了生物保藏，保藏号为CGMCC No. 4797。

实施例2

根据《常见细菌系统鉴定手册》[4]和《放线菌系统学原理、方法及实践》[5]中记载的实验内容和实验方法，对筛得的保藏号为CGMCC No. 4797的菌株进行菌种鉴定。

1、形态分析

对保藏号为CGMCC No. 4797的菌株进行形态分析并在光学显微镜下观察，结果分别如图1和2所示。

菌落形态观察是在固体TSA培养基上进行的，将菌株划线接种后，于28℃恒温培养24小时观察菌落形态。保藏号为CGMCC No. 4797的菌株的菌落为浅黄色，圆形，质地光滑，表面隆起。挑取培养24小时菌苔染色后在光学显微镜的100倍油镜下观察。在显微镜下可清楚的看到，保藏号为CGMCC No. 4797的菌株的菌体细胞呈长杆形，并且单个出现。

2、16s rDNA鉴定

16s rDNA的PCR扩增和测序：采用试剂盒（北京全式金生物技术公司）提取并纯化保藏号为CGMCC No. 4797的菌种的总DNA，然后以总DNA为模板，对16s rDNA保守序列进行PCR扩增获得目的基因片段。

PCR扩增引物分别为：

27f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和；

1492r（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）。

PCR总反应体系为50uL，具体包括：

10×Buffer	5μL
		10 mmol/ L dNTP	4μL
反向引物	1μL
		正向引物	1μL
Taq 酶（5U/μL）	1μL
		模板DNA	2μL
ddH₂O	补足至50μL

PCR反应条件为：94 ℃预变性5min，94℃变性1min，50℃退火1min，72 ℃延伸2min，此步骤共进行35个循环，最后72℃延伸10min。

扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检验。PCR产物测序工作由北京三博远志生物技术公司完成。测序结果显示，保藏号为CGMCC No. 4797的菌株具有SEQ ID NO：1所示的16s rDNA序列。

经系统发育分析：登陆http://www.ncbi.nlm.nih.gov，将所测序列通过BLAST程序与核酸数据库中的序列进行对比分析查找相同或相似的核苷酸序列，然后利用序列比对软件ClustalX 2.0和系统发育分析软件MEGA 4.0.2构建系统进化树。在MEGA软件中，构建系统进化树的方法使用Neighbor-Joining法，碱基替代模型选择Kimura双参数模型，进化树可靠性检验选用自展检验（bootstrap）1000次重复检测，DNA 序列变异中的转换和颠换赋于相同的加权值。经过分析显示，保藏号为CGMCC No. 4797的菌株属于日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas japonensis）。

实施例3

称取10g石油污染土壤混合物（石油含量1.25克）加入装有100mL牛肉膏蛋白胨培养基（保藏号为CGMCC No. 4797的日本假黄单胞菌的接种量为每克培养基所含的总活菌数为0.5×10¹⁰个）的250mL三角瓶中，于28℃、180r/min的恒温摇床条件下培养，3天后检测石油污染土壤混合物中的石油含量，结果为0.49克，该菌株对石油的降解率约为60.8%。

实施例4

称取10g石油污染土壤混合物（石油含量1.25克）加入装有100mL牛肉膏蛋白胨培养基（保藏号为CGMCC No. 4797的日本假黄单胞菌的接种量为每克培养基所含的总活菌数为0.8×10¹⁰个）的250mL三角瓶中，于28℃、180r/min的恒温摇床条件下培养，3天后检测石油污染土壤混合物中的石油含量，结果为0.42克，该菌株对石油的降解率约为66.4%。

实施例5

称取10g石油污染土壤混合物（石油含量1.25克）加入装有100mL牛肉膏蛋白胨培养基（保藏号为CGMCC No. 4797的日本假黄单胞菌的接种量为每克培养基所含的总活菌数为0.3×10¹⁰个）的250mL三角瓶中，于28℃、180r/min的恒温摇床条件下培养，3天后检测石油污染土壤混合物中的石油含量，结果为0.51克，该菌株对石油的降解率约为59.2%。

由上述结果可以看出，本发明筛选出的保藏号为CGMCC No. 4797的日本假黄单胞菌对石油烃具有优良的降解能力，可以广泛地应用于降解石油烃以及对石油污染的修复，如对石油污染的土壤的修复和对石油污染的水体的修复等。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所

<120> 一种日本假黄单胞菌和微生物菌剂及它们的应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 1408

<212> DNA

<213> 日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonasjaponensis）16s rDNA

<400> 1

ctacacatgc aagtcgaacg gcagcacagg agagcttgct ctctgggtgg cgagtggcgg 60

acgggtgagg aatacatcgg aatctacctt ttcgtggggg ataacgtagg gaaacttacg 120

ctaataccgc atacgaccta cgggtgaaag tgggggaccg caaggcctca cgcgattaga 180

tgagccgatg tccgattagc tagttggcgg ggtaatggcc caccaaggcg acgatcggta 240

gctggtctga gaggatgatc agccacactg gaactgagac acggtccaga ctcctacggg 300

aggcagcagt ggggaatatt ggacaatggg cgcaagcctg atccagccat accgcgtggg 360

tgaagaaggc cttcgggttg taaagccctt ttgttgggaa agaaatccta tcggttaata 420

accggtgggg atgacggtac ccaaagaata agcaccggct aacttcgtgc cagcagccgc 480

ggtaatacga agggtgcaag cgttactcgg aattactggg cgtaaagcgt gcgtaggtgg 540

tggtttaagt ctgctgtgaa agccctgggc tcaacctggg aattgcagtg gatactggat 600

cactagagtg tggtagaggg atgcggaatt tctggtgtag cagtgaaatg cgtagagatc 660

agaaggaaca tccgtggcga aggcggcatc ctgggccaac actgacactg aggcacgaaa 720

gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccctaaacg atgcgaactg 780

gatgttgggt gcaacttggc acccagtatc gaagctaacg cgttaagttc gccgcctggg 840

gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900

tatgtggttt aattcgatgc aacgcgaaga accttacctg gtcttgacat ccacggaact 960

ttccagagat ggattggtgc cttcgggaac cgtgagacag gtgctgcatg gctgtcgtca 1020

gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg tccttagttg 1080

ccagcacgta atggtgggaa ctctaaggag accgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg 1140

gatgacgtca agtcatcatg gcccttacga ccagggctac acacgtacta caatggtggg 1200

gacagagggc tgcaaacccg cgagggtgag ccaatcccag aaaccctatc tcagtccgga 1260

ttggagtctg caactcgact ccatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcag atcagcattg 1320

ctgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtttgtt 1380

gcaccgggag caggtagctt aacgtcgg 1408

Claims

1.一种日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas japonensis），其特征在于，该日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas japonensis）的保藏编号为CGMCC No. 4797。

2.一种降解石油烃的微生物菌剂，其特征在于，该微生物菌剂含有日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas japonensis）作为活性成分，其中，该日本假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas japonensis）的保藏编号为CGMCC No. 4797。

3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其中，每克所述微生物菌剂所含的总活菌数为0.1-2.5×10¹⁰个。

4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其中，每克所述微生物菌剂所含的总活菌数为0.5-1×10¹⁰个。

5.根据权利要求2-4中的任意一项所述的微生物菌剂，其中，该微生物菌剂还含有培养基，所述培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、石油筛选培养基和PDA培养基中的一种或几种。

6.根据权利要求5所述的微生物菌剂，其中，所述培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。

7.权利要求1所述的日本假黄单胞菌或权利要求2-6中的任意一项所述的微生物菌剂在降解石油烃中的应用。

8.权利要求1所述的日本假黄单胞菌或权利要求2-6中的任意一项所述的微生物菌剂在生物修复石油污染中的应用。

9.权利要求1所述的日本假黄单胞菌或权利要求2-6中的任意一项所述的微生物菌剂在生物修复石油污染的土壤中的应用。

10.权利要求1所述的日本假黄单胞菌或权利要求2-6中的任意一项所述的微生物菌剂在生物修复石油污染的水体中的应用。