CN113736701B - 一株嗜根寡氧单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株嗜根寡氧单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）及其应用。该嗜根寡氧单胞菌于2020年06月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20011。本发明的嗜根寡氧单胞菌生长快，可以溶解无机磷酸钙。本发明的嗜根寡氧单胞菌可以抑制植物病原菌水稻纹枯病菌和油菜菌核病菌。本发明的嗜根寡氧单胞菌可以显著提早番茄和小白菜种子的发芽时间，在不同时间均可以显著提高发芽率，对番茄和小白菜种子根部发育和幼苗生长有显著的促进作用。本发明的嗜根寡氧单胞菌还可以在含盐条件下快速降解聚乙烯醇。
Description
技术领域
本发明属于生物的技术领域，具体涉及一株可提高植物耐盐性及可降解聚乙烯醇的嗜根寡氧单胞菌及其应用。
背景技术
全球土壤盐分的扩展主要发生在干旱和半干旱沿海地区，并因化肥的大量使用和灌溉方式的不当而逐渐加剧。高含盐土壤会干扰植物的生长和各种代谢过程，使植物更容易受到土壤传播的病原体的侵害，导致全球农作物每年损失达120亿美元。
近年来，能够促进植物抗逆生长的根际细菌在土壤生物修复和生物防治中显示出了巨大的应用潜力，它不仅具有促进植物生长和保护根系免受生物和非生物胁迫的能力，还能起到恢复土壤肥力，降低土壤污染物含量等作用。
寡氧单胞菌（Stenotrophomonas）在环境中无处不在并且功能多样，用途广泛，因此在生物技术应用中受到越来越多的关注。据文献报道，寡氧单胞菌显示出高耐盐度，菌株可合成防渗透物质海藻糖，或在菌体内积聚海藻糖和葡萄糖基甘油。寡氧单胞菌对高盐分土壤中生长的多种作物具有促进生长的作用。菌体能够通过水解酶，拮抗化合物和铁载体的合成来从生物学上控制植物真菌疾病，寡氧单胞菌还可以代谢产生多种有机化合物，例如酚类化合物，多环芳烃，硒化合物和异生物质。研究揭示某些菌株具有生物降解聚乙烯醇（PVA）的能力。PVA是一种人工合成的水溶性高分子化合物，在纺织、造纸、化工等行业有广泛的用途,但是在自然环境中它很难被降解，是水体中的难降解污染物之一。
嗜根寡氧单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）人畜生物安全性高，最适生长温度较低，因此可以安全地用于农业生产和其他直接应用，是生物肥料，生物防治和生物修复应用的理想候选者。据报道，嗜根寡氧单胞菌能够定殖在棉花、番茄、甜椒等作物的根部，消除有害的根际微生物，减少植物病害，保护植物根系免受环境中渗透胁迫。但是，同时具备高逆境耐受性、高植物促生能力和环境污染物降解能力的嗜根寡氧单胞菌菌株还十分缺乏。
发明内容
发明目的：为解决现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一株嗜根寡氧单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）CNBG-PGPR-6，其保藏编号为 CGMCCNo.20011，该菌株可提高植物耐盐性及可降解聚乙烯醇。
本发明还要解决的技术问题是提供了嗜根寡氧单胞菌在降解有机磷和/或无机磷中的应用。
本发明还要解决的技术问题是提供了嗜根寡氧单胞菌在固氮方面的应用。
本发明还要解决的技术问题是提供了嗜根寡氧单胞菌在植物种植方面的应用。
本发明还要解决的技术问题是提供了嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6在对植物病原菌抑制中的应用。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一株嗜根寡氧单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）CNBG-PGPR-6，所述嗜根寡氧单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）CNBG-PGPR-6于2020年06月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20011，分类命名为嗜根寡氧单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila），保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明内容还包括所述的嗜根寡氧单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）CNBG-PGPR-6在提高植物耐盐性中的应用。
本发明内容还包括所述的嗜根寡氧单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）CNBG-PGPR-6在降解聚乙烯醇中的应用。
本发明内容还包括所述的嗜根寡氧单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）CNBG-PGPR-6在溶解无机磷和/或有机磷中的应用。
其中，所述无机磷来源于磷酸三钙，其他含磷无机物，例如磷酸钙、磷酸镁、磷酸铁、磷酸铝也适用于本发明。
其中，所述有机磷来源于卵磷脂，其构成磷脂成分包括大豆磷脂酸、大豆酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酰甘油。其他有机磷化合物，例如植酸钙、甲基对硫磷、对硫磷、蝇毒磷、久效磷、甲胺磷、二嗪农、乐果、氧乐果、异硫磷、马拉硫磷、毒死蜱、杀螟硫磷、丙线磷也适用于本发明。
本发明内容还包括所述的嗜根寡氧单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）CNBG-PGPR-6在固氮方面的应用。
本发明内容还包括所述的嗜根寡氧单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）CNBG-PGPR-6在抑制植物病原菌中的应用。
其中，所述植物病原菌包括但不仅限于水稻纹枯病菌和油菜菌核病菌。其它病原菌，例如草莓灰霉菌、小麦赤霉菌、小麦纹枯菌、水稻纹枯菌、番茄早疫菌、油菜菌核菌、葡萄炭疽菌、稻瘟菌、水稻恶苗菌、香蕉枯萎菌也适用于本发明。
本发明内容还包括所述的嗜根寡氧单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）CNBG-PGPR-6在植物种植方面的应用。
其中，所述植物为小白菜或番茄，其他植物，例如菠菜、西红柿、油菜也可以适用。
其中，所述嗜根寡氧单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）CNBG-PGPR-6在促进植物种子发芽方面的应用，特别是小白菜种子和番茄种子。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明的嗜根寡氧单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）CNBG-PGPR-6，保藏编号为CGMCC No.20011，生长快，稳定性好，可在大体积装置中放大培养，耐盐度强，能在30℃和4℃下于2%、4%、6%盐度下的培养基上生长，并且表现出良好的解磷固氮能力。在30℃和4℃条件下用聚乙烯醇（PVA）作为唯一碳源时，能在同时含有0.1% PVA和2% NaCl的平板培养基上生长。同时，本发明的嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6可以显著提早小白菜和番茄种子的发芽时间，而且在各个时间段均可以显著提高发芽率。本发明的嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6对盐胁迫条件下的小白菜和番茄种子发芽率、根部发育和幼苗生长有显著的促进作用。
附图说明
图1为嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6在平板培养基上的菌落形态；
图2为嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6在扫描电子显微镜下的细胞形态；
图3为嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6系统进化树；
图4为嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6在不同浓度盐培养基上生长状况；
图5为嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6生长曲线；
图6为嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6在含PVA培养基上生长状况；
图7为嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6在无机磷（A）及有机磷（B）平板培养基上生长情况；
图8为嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6在固氮平板培养基上生长状况；
图9为嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6对植物病原体水稻纹枯病菌和油菜菌核病菌的抑制作用。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1 嗜根寡氧单胞菌的分离、鉴定
（1）样品稀释与涂布
取0.5g土壤样品（采自江苏南京周边农田）于装有4.5mL磷酸缓冲液（PBS）的离心管中，充分震荡，即为10-1梯度。采用十倍梯度稀释法，逐步将样品悬液稀释至10-6倍，分别吸取样品悬液和稀释液100µL，均匀的涂布在营养琼脂Nutrient Agar（NA）固体培养基平板上，倒置于恒温培养箱中30℃过夜培养。NA培养基配方如下（每升）：10.0g蛋白胨，3.0g牛肉粉，5.0g氯化钠，15.0g琼脂，pH值7.3±0.1。NB液体培养基成分同NA，但是不含琼脂成分。
（2）菌株分离与纯化
将长出菌落且数量适中的平板取出，挑取单菌落，接种到新鲜培养基上继续培养，连续转接5代以上，确保获得纯培养菌株。
（3）染色与保藏
挑取待检测菌株的菌落于载玻片中央区域，经过草酸铵-结晶紫染液初染、碘液媒染、75%乙醇脱色、番红复染四个步骤后，显微镜镜检观察，记录染色结果；将完成纯化和染色的单菌落从NA固体培养基平板上挑至无菌NA液体培养基中，200r/m、30℃下培养24±2h，震荡摇匀后，将60%无菌甘油：菌液按1:1体积比进行混合，分装于无菌保菌管中，标记并置于-80℃冰箱中保藏。
（4）菌株鉴定
将含有对应编号菌株的平板从4℃冰箱中取出，挑取单菌落为DNA模板，进行PCR扩增和16S rDNA测序与序列比对，具体操作如下：
1）扩增体系：
50μL扩增体系有以下成分组成：2X Taq酶Master Mix（25 μL，艾科瑞生物，2XAccurate Taq 预混液）、上游引物27F（1 μL）、下游引物1492R（1 μL）、DNA模板（1 μL）、ddH2O（22 μL）。其中27F序列为：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTC AG-3’，1492R序列为：5’-GGYTACCTTGTTACGACT T-3’。
2）扩增条件：
预变性温度：94 ℃，第一步变性：94 ℃ 30 s，第二步退火：56 ℃ 60 s，第三步延伸：72 ℃ 45 s，循环次数：30次，第四步最后延伸：72 ℃ 10 min，第五步保存：4 ℃。
3）琼脂糖凝胶电泳鉴定，核酸序列测序及鉴定
称取1g琼脂糖溶解于100 mL TBE电泳缓冲液，微波加热至溶液澄清透明，加入1‰的GelRed核酸染料，摇晃均匀，静置至无气泡，缓慢倒入胶板，静置1h左右，取出凝固的胶块置于电泳槽中，在每个胶孔中加入4μL PCR扩增产物，120V 20min跑胶，取出胶块置于凝胶成像仪中，选择UV光照并拍照，若胶块上约1400-1500 bp处条带清晰，则认为PCR扩增成功，使用AxyPrepTM PCR Cleanup Kit核酸纯化试剂盒纯化PRC扩增产物，并送至南京擎科生物科技有限公司测序，将返回的序列输入至National Center for BiotechnologyInformation （NCBI）网站的在线序列检索工具The Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)中进行检索，比对结果显示，本发明提供的细菌菌株为嗜根寡氧单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila），属于变形菌门（Proteobacteria），γ变形菌纲（Gammaproteobacteria），黄色单胞菌目(Xanthomonadales)，黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)，寡氧单胞菌属（Stenotrophomonas）。嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6保藏编号为 CGMCC No.20011 的菌落形态为：在平板培养基表面菌落较小，圆形，整体呈凸透镜状，淡黄色至无色，质地均匀。于油镜下观察到的嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6的菌体呈短杆状。扫描电子显微镜照片显示菌体细胞长约1.5μm、宽约0.2μm。革兰氏染色结果显示为革兰氏阴性菌。
实施例2 嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6在NB液体培养基中的生长及耐盐生长能力测试
取出菌株CNBG-PGPR-6按5%接种量接入NB液体培养基中，置于30℃下培养72 h，每隔0.5h测定菌液600nm波长处的吸光值（OD值），设三组平行样品，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制生长曲线。
由图4可知，菌株CNBG-PGPR-6可在约17h进入生长平台期，OD600值为1.16。菌株数量持续稳定时间较长。
挑取少许嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6在NA营养琼脂培养基（含0.5%氯化钠）和含2%、4%、6%、8%氯化钠的NA培养基上划线培养（图4）。两组设定培养温度分别为30 ℃和4℃。结果显示，当培养温度为30℃时，嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6可在含高达6%氯化钠的营养琼脂培养基上生长，但是生长速率慢于低氯化钠含量的营养琼脂培养基。当培养温度为4℃时，嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6可以在最高含2%氯化钠的营养琼脂培养基上生长，生长缓慢，但是若转接至原始培养基或者放置于30℃培养温度下，菌株就可以恢复高生长活性。
取出菌株CNBG-PGPR-6按5%接种量接入含2%、4%、6%氯化钠的NA液体培养基中，置于30℃下培养72 h，每隔0.5h测定菌液600nm波长处的吸光值（图5）。结果表明在含2%氯化钠的培养基中，嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6可在约30 h进入生长平台期，OD600值为1.1。在含4%氯化钠的培养基中，嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6可在约36h才达到最大生长量，OD600值为0.9。在含6%氯化钠的培养基中，嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6几乎不进行营养生长。
实施例3 嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6的PVA降解能力
1）培养基配方
含聚乙烯醇（PVA）的营养琼脂培养基的组成如下：1g PVA 1799（聚合度为1700，国药化学试剂，中国上海），1.4g K2HPO4，0.27g KH2PO4，0.25g MgSO4，0.05g CaCl2、0.02gFeSO4、0.02g NaCl、0.2g Na2NO3和0.2g (NH4)2NO3，15g 琼脂粉，加水至1升，pH值调至7.0，灭菌后制备固体平板培养基待用。此培养基中聚乙烯醇（PVA）为唯一碳源供细菌生长。液体PVA培养基不含琼脂粉成分。
2）基本步骤
准备步骤1）所述PVA营养琼脂培养基，同时准备额外含有2%NaCl的PVA营养琼脂培养基。将嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6转接到上述两种PVA营养琼脂培养基上，每种接种两个平板，分别在30℃和4℃培养条件下培养7天。菌落如果能利用PVA作为碳源复制生长，则该菌落可能降解PVA。同时应使用PVA显色反应确定PVA降解能力。将3ml I2-KI（12.7 g/L I2和25 g/L KI）和硼酸（4g/L）（1:4体积比）混合物添加到平板中并在黑暗中反应30分钟。碘-硼酸混合液变为亮黄色即说明有PVA被生物降解。
傅立叶变换红外光谱检测：将10 ml培养物于4℃下在10000 rpm/min转速下离心30分钟，然后将上清液通过膜滤器（孔径为0.22-μm，Millipore）过滤，接着将含有PVA的上清液冷冻干燥后，室温条件下使用傅立叶变换红外（FTIR）光谱仪测量其在最高6%盐度生长条件下的红外光谱。使用不含细菌培养物的PVA培养基作为对照。
为了准确测定PVA降解率，将嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6接种至含有0.1% PVA和2 % NaCl 的液体培养基中，每日采样培养基上清液，过滤（0.22μm孔径，Millipore）去除菌体，通过碘量法定量测定上清液中残留的PVA。具体方法如下：将0.75ml 4%硼酸和0.15mlI2-KI添加到样品中，加蒸馏水至2.5ml，黑暗中放置30分钟后使用分光光度计在690nm波长下测定PVA含量。PVA标准曲线设计为0、5、10、20、50和100μg/ml六点。实验重复三次。
3）实验结果
当培养温度为30℃时，嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6可在最高含有2%
NaCl的PVA固体培养基上正常生长。在培养温度为4℃时，嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6的生长速度明显放缓，通常需要2周左右才能观察到菌落（图6）。PVA显色反应证实嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6在最高含盐2%及4-30℃生长温度下，都可以降解利用PVA作为唯一碳源获得能量。傅立叶变换红外光谱的分析表明，相对于对照组，羟基的伸缩振动带（3000-3700 cm-1）与1700 cm-1区域对应的羰基吸收峰都出现了明显的变化，证实了在含盐2%的培养条件下，嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6对PVA的降解能力。定量测试显示嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6可以在一天时间内降解37%的溶解PVA，一周内降解率可以达到52.4%。
实施例4 嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6的无机磷降解能力
1）培养基的配置
配置无机磷固体培养基平板，成分为葡萄糖10g，磷酸三钙2g，碳酸钙0.1g，无水硫酸镁0.5g，硫酸铵0.5g，氯化高铁0.005g，氯化钾 1.7g，琼脂20g，水1L（注：碳酸钙溶液需单独灭菌冷却后与培养基其它成分混匀后制平板培养基）。
2）无机磷降解能力的定性实验
用接种环挑取适量嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6菌种于无机磷固体平板上，将平板置于30℃下恒温培养，观察菌落周围是否出现解磷圈。经实验可知，菌株嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6在无机磷固体平板上能够快速生长，3d时开始出现微弱解磷圈，显示其有微弱的解磷能力（图7A）。
实施例5 嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6的有机磷降解能力
1）培养基的配置
配置有机磷固体培养基平板，成分为葡萄糖2 g，卵磷脂2 g，碳酸钙0.1 g，无水硫酸镁0.5 g，硫酸铵0.5 g，氯化高铁0.005 g，琼脂20 g，水1 L；有机磷液体培养基成分为葡萄糖10 g，卵磷脂2 g，碳酸钙5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸铵0.5 g，硫酸钙0.1 g，氯化高铁0.005 g，氯化钾 1.7 g，水1 L（注：碳酸钙溶液需单独灭菌冷却后与培养基其它成分混匀后制平板培养基）。
2）有机磷降解能力定性实验
用接种环挑取适量嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6菌种于有机磷固体平板上，将平板置于30℃下恒温培养，观察菌落是否能够正常生长，菌落周围是否出现解磷圈。经实验可知，菌株嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6在有机磷固体平板上形成菌落，能够正常生长，显示出一定的有机磷降解能力（图7B）。
实施例6 嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6固氮生长实验
1）培养基的配置
配置不含任何氮源成分的Ashby固氮平板培养基，成分为葡萄糖10 g，磷酸二氢钾0.2 g，七水硫酸镁0.2 g，氯化钠0.2 g，二水硫酸钙0.1 g，碳酸钙5 g，琼脂20 g，加水至1L。
2）固氮生长实验
挑取嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6单菌落接种在Ashby无氮固体培养基上，30℃恒温静置培养48 h，观察平板上的生长状况，将长出的菌落划线转接至新鲜培养基上，连续三次以上划线转接都能正常生长方可确定该菌固氮生长能力。经验证，菌株嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6能够连续在Ashby固氮平板上正常生长，显示其具有良好的生物固氮能力（图8）。
实施例7 嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6对植物病原体的抑制作用
1）培养基的配置
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯浸出粉12 g，葡萄糖15 g，琼脂20 g，水1000 mL。
2）植物病原体拮抗实验
将含有致病性水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani Kühn）、油菜菌核病菌（核盘菌，Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary）的PDA琼脂圆盘（直径5毫米）放置在琼脂平板的中央，在距圆盘2.5cm的左右及上方3处地方分别接种5 µl嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6活性菌液（约5*108/µl个细胞），在圆盘下方第四点使用新鲜培养基作为阴性对照。在25℃条件下培养4-5天后观察嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6对病原菌的拮抗活性。结果表明，嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6对水稻纹枯病菌及油菜菌核病菌都有一定程度的抑制程度（图9）。
实施例8 嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6吲哚乙酸（IAA）定量分泌实验
将5ml嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6菌株在液体营养培养基中于30℃下振荡培养48小时（约5*108/µl个细胞），然后在室温下以10000 rpm转速离心10分钟。获得的细胞沉淀物用1 ml无菌PBS缓冲液洗涤两次之后悬浮在650μl PBS缓冲液中。将150μl悬浮液接种在3ml分别添加有0、2和4%NaCl和1 mg/ml L-色氨酸的营养培养基中。样品在30℃下培养3天，之后将细菌培养物以10000 rpm转速离心10分钟，上清液通过膜滤器（孔径为0.22μm，Millipore）过滤。将0.5 ml的上清液与1 ml的Salkowski试剂（2 ml的0.5 M FeCl3溶于98ml的35% H2SO4中）混合。在室温下于黑暗中反应30分钟后，使用分光光度计测量530 nm波长下吸光值。对于校准曲线，将IAA以1 mg/ml的浓度悬浮在100%乙腈中，并用营养培养基分别稀释至0、5、10、20、50和100μg/ml的浓度。使用未接种的新鲜培养基用作阴性对照，三份重复。结果显示，嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6菌液中吲哚乙酸含量均值高达5.27 μg/ml。
实施例9 嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6促进小白菜及番茄种子发芽及促生试验
1）实验设置
用于测试的小白菜（Brassica rapa subsp. chinensis）和番茄种子均购自江苏省农业科学院。种子先用95％的酒精处理5 s，然后用75％的酒精处理5 min，对种子表面进行灭菌。灭菌后的种子在无菌水中彻底清洗5次。
实验设计涉及9种处理条件：将嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6按5%比率接种于NB液体培养基中，30℃下培养过夜，取一半细菌培养物用分别含0.5%，1%和2% NaCl的无菌水稀释至107个细胞每ml，制成细胞悬液；将另一半过夜培养物以10000 rpm转速离心10分钟，然后将上清液通过膜过滤器（孔径为0.22μm，Millipore）去除细胞，滤液用分别含0.5%，1%和2%NaCl的无菌水以相同比例进行稀释，制成无细胞发酵液；用分别含0.5%，1%和2%NaCl的无菌水代替细菌培养物来处理经表面灭菌的种子作为对照组。
为了测试培养物对小白菜及番茄种子促发芽的影响，将两张无菌滤纸铺在培养皿中，同时加入每种处理液3 ml，之后将经过表面灭菌的种子均匀放在滤纸上。种子在25-30℃条件下预萌发5天。每天统计发芽种子的数量，并测量新鲜重量。每个处理设置33个重复样本，设置三组重复。
为了测试培养物对作物幼苗生长的影响，如上所述将种子灭菌后放置在铺有潮湿毛巾的托盘中萌发，同时用保鲜膜将其密封。每个处理随机选择10个重复样本，于25-30℃下，在放置浸有3 ml每种处理的滤纸的培养皿中生长。在3天（小白菜）或4天（番茄）的生长时间后，测量根/茎长和鲜重。实验重复三次。
2）实验结果
结果表明，盐胁迫下番茄第一粒和最后一粒种子的发芽的时间延迟了约2天。在含0.5%和1%NaCl的条件下，小白菜种子播种后24 h的发芽率分别降低了19.4%和55.7%。在盐度为1%NaCl时番茄种子均没有发芽。盐胁迫对作物幼苗根长影响显著，在含0.5%和1%NaCl的条件下，小白菜幼苗根长分别减少了79.3%和85.3%，番茄幼苗根长则减少了73.7%和94.3%。番茄幼苗的茎长和鲜重在1%NaCl条件下分别显着降低了63.1%和49.6%。小白菜幼苗的茎长在含0.5%和1%NaCl的条件下下降了17.9%和28.3%。
在不含盐的条件下，嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6细胞悬液和无细胞发酵液对于番茄种子的发芽时间与对照组没有差别，但是分别可以提高17.9%和10.7%的种子发芽率。在含有0.5%NaCl条件下，嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6细胞悬液和无细胞发酵液分别使番茄种子胚根的出现提前了2天和1天，且细胞悬液处理组显著提高了种子的发芽率，提高率达到78.1%和75.1%，同时幼苗鲜重分别提高了48.0%和36.0%。在含盐1%条件下，嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6细胞悬液和无细胞发酵液对小白菜种子的发芽率分别提高了36.4%和27.3%，细胞悬液处理组的鲜重提高了20.4%。
相对于对照组，在盐胁迫下，嗜根寡氧单胞菌CNBG-PGPR-6接种物对作物幼苗根长的促进作用非常显著。细胞悬液处理组使小白菜幼苗根长分别增加了92.5%（含盐0.5%）和77.7%（含盐1%）；使番茄幼苗根长分别增加了45.4%（含盐0.5%）和33.0%（含盐1%）。无细胞发酵液处理组的小白菜幼苗根长增加了97.8%（含盐0.5%）和52.0%（含盐1%）；番茄幼苗根长增加了32.2%（含盐0.5%）和46.6%（含盐1%）。
序列表
<110> 江苏省中国科学院植物研究所
<120> 一株嗜根寡氧单胞菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1390
<212> DNA
<213> 嗜根寡氧单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)
<400> 1
gctacctgct tctggtgcac aaactcccat ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg 60
gaacgtattc accgcagcaa tgctgatctg cgattactag cgattccgac ttcatggagt 120
cgagttgcag actccaatcc ggactgagat agggtttctg ggattggctt gccctcgcgg 180
gtttgcagcc ctctgtccct accattgtag tacgtgtgta gccctggtcg taagggccat 240
gatgacttga cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac cggcggtctc cttagagttc 300
ccaccattac gtgctggcaa ctaaggacaa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa 360
catctcacga cacgagctga cgacagccat gcagcacctg tgttcgagtt cccgaaggca 420
ccaatccatc tctggaaagt tctcgacatg tcaagaccag gtaaggttct tcgcgttgca 480
tcgaattaaa ccacatactc caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca 540
gtcttgcgac cgtactcccc aggcggcgaa cttaacgcgt tagcttcgat actgcgtgcc 600
aaattgcacc caacatccag ttcgcatcgt ttagggcgtg gactaccagg gtatctaatc 660
ctgtttgctc cccacgcttt cgtgcctcag tgtcagtgtt ggtccaggta gctgccttcg 720
ccatggatgt tcctcccgat ctctacgcat ttcactgcta caccgggaat tccactaccc 780
tctaccacac tctagtcgcc cagtatccac tgcaattccc aggttgagcc cagggctttc 840
acaacagact taaacaacca cctacgcacg ctttacgccc agtaattccg agtaacgctt 900
gcacccttcg tattaccgcg gctgctggca cgaagttagc cggtgcttat tctttgggta 960
ccgtcagaac aaccgggtat tagccgactg cttttctttc ccaacaaaag ggctttacaa 1020
cccgaaggcc ttcttcaccc acgcggtatg gctggatcag gcttgcgccc attgtccaat 1080
attccccact gctgcctccc gtaggagtct ggaccgtgtc tcagttccag tgtggctgat 1140
catcctctca gaccagctac ggatcgtcgc cttggtgggc ctttaccccg ccaactagct 1200
aatccgacat cggctcatct atccgcgcaa ggcccgaagg tcccctgctt tcacccgaag 1260
gtcgtatgcg gtattagcgt aagtttccct acgttatccc ccacgaaaag gtagattccg 1320
atgtattcct cacccgtccg ccactcgcca cccataagag caagctctta ctgtgctgcc 1380
gtcgactgca 1390
Claims (10)
1.一株嗜根寡氧单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）CNBG-PGPR-6，其特征在于，所述嗜根寡氧单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）CNBG-PGPR-6于2020年06月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20011。
2.权利要求1所述的嗜根寡氧单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）CNBG-PGPR-6在提高植物耐盐性中的应用。
3.权利要求1所述的嗜根寡氧单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）CNBG-PGPR-6在降解聚乙烯醇中的应用。
4.权利要求1所述的嗜根寡氧单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）CNBG-PGPR-6在溶解无机磷和/或有机磷中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述无机磷来源于磷酸三钙，所述有机磷来源于卵磷脂。
6.权利要求1所述的嗜根寡氧单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）CNBG-PGPR-6在固氮方面的应用。
7.权利要求1所述的嗜根寡氧单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）CNBG-PGPR-6在植物种植方面的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物为小白菜或番茄。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述嗜根寡氧单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）CNBG-PGPR-6在促进植物种子发芽和幼苗生长方面的应用。
10.权利要求1所述的嗜根寡氧单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）CNBG-PGPR-6在对植物病原菌抑制中的应用，所述植物病原菌为水稻纹枯病菌或油菜菌核病菌。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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