CN115895937B - 一株经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌及其培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌及其培养方法和应用。所述经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌的保藏编号为GDMCC NO：61828该菌株于2021年7月23日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心；其培养方法为将经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌接种于培养基中，于30℃～37℃条件下进行培养；其降解环丙沙星和解磷解钾的性能优异，可以去除环境中的环丙沙星，成本低且能够较好的达到降解效果，是具有提高土壤有效磷和钾含量的潜能的微生物资源，对改善土壤环境、调节植物生长方面具有极其重要的意义。

Description

一株经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌及其培养方法和 应用

技术领域

本发明属于微生物、土壤污染修复及土壤地力提升的技术领域，特别涉及一株经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌及其培养方法和应用。

背景技术

喹诺酮类抗生素由于其广谱性和较强的抗菌性被广泛用于治疗人类及动物疾病，因此使用量与应用范围都极为广泛。由于喹诺酮类抗生素在生物体内的不完全代谢，大部分会以原药或代谢产物的形式随排泄物进入环境。同时该类抗生素具有难降解的特点，广泛且长期存在于环境中的喹诺酮类抗生污染会对生态系统存在长期的危害和风险。

环丙沙星是一种合成的喹诺酮抗生素，具有广谱杀菌性，杀菌效果好，对肠道菌以及金黄色葡萄球菌等具有抑菌作用，在工业处理中，可以通过电化学氧化法、高级氧化法等物理化学方法去除环丙沙星，这些方法在使用时效率较低，且这种去除方法会发生不完全降解。高能耗、低效率和二次污染毒性几个缺点使得实施难以展开，而生物修复的优点体现在可行性高、成本低且能够较好的达到降解效果，应用前景广阔。

磷元素和钾元素作为植物生长过程中的必需元素，具有不可缺少性和不可替代性。土壤供磷充足能够有效地促进农作物的生长，但大部分土壤中有效磷含量低，施用的磷肥以正磷酸盐(H₂PO₄ ^-或HPO₄ ^2-)的形式，容易与土壤中的Al³⁺、Ca²⁺和Fe³⁺的氧化物发生交换作用形成难溶性磷酸盐。土壤中钾元素多以矿物钾和固态钾的形式存在，不能被植物大量吸收，进而加剧了土壤钾元素的缺乏。

因此有必要获得新的可降解环丙沙星和解磷解钾的菌株。

发明内容

本发明发明人在对微生物改善土壤环境的研究中，发现一株肺炎克雷伯氏菌，其降解环丙沙星和解磷解钾的性能优异。从而，本发明的首要目的在于针对现有技术的不足，提供一株经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌。

本发明的另一目的在于提供所述的微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌的培养方法。

本发明的再一目的在于提供所述的经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌在污染修复及土壤地力提升领域中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌，名称为肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumonia)WC612，保藏编号为GDMCC NO：61828，该菌株于2021年7月23日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心。

所述的经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌是发明人从土壤中自主分离得到的菌株WC6作为出发菌株，通过地面微重力诱变获得环丙沙星降解能力和解磷解钾能力提升的突变菌株。

所述的经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌的培养方法，包括以下步骤：

将经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌接种于培养基中，于30℃～37℃条件下进行培养。

所述的培养基选自LB培养基、含环丙沙星(CIP)和蛋白胨的无机盐(MSM)培养基、蒙金娜(PVK)培养基和钾细菌培养基。

所述的含环丙沙星(CIP)和蛋白胨的MSM培养基中环丙沙星的浓度为10～60mg/L，蛋白胨的浓度为10g/L；优选地，环丙沙星的浓度优选为10mg/L。

所述的PVK培养基的组分如下：葡萄糖10g/L，(NH₄)₂SO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.3g/L，NaCl 0.3g/L，KCl 0.3g/L，FeSO₄·7H₂O0.045g/L，MnSO₄·4H₂O 0.03g/L，余量为水，pH为7.0；

所述的钾细菌培养基的组分如下：钾长石(K₂O·Al₂O₃·6SiO₂)2.5g/L，Na₂HPO₄0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.02g/L，NaCl 0.2g/L，CaCO₃ 5.0g/L，CaSO₄·2H₂O 0.1g/L，葡萄糖10g/L，余量为水，pH为6.8～7.0。

所述的培养的温度优选为30℃。

所述的培养的时间为18～24h；优选为20～24h。

所述的经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌具有以下分类学特征：在LB固体培养基平板上的生长形态为：菌斑呈圆形，白色，表面光滑，中间突起，有光泽，边缘呈半透明状。

所述的经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌在污染修复领域中的应用。

所述的应用可通过在环境中添加所述的经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌来降解环境中的环丙沙星。

所述环境为土壤和/或水体环境，优选为土壤环境。

所述的经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌在土壤地力提升领域中的应用。

所述的应用可通过在土壤中添加所述的经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌来溶解土壤中的难溶性磷和难溶性钾，提高土壤中的可溶性磷和可溶性钾的含量。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌降解环丙沙星的性能优异，可以去除环境中的环丙沙星，成本低且能够较好的达到降解效果。

(2)本发明提供的经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌解磷解钾的性能优异，是具有提高土壤有效磷和钾含量的潜能的微生物资源，对改善土壤环境、调节植物生长方面具有极其重要的意义。

附图说明

图1是微重力突变后各菌株与出发前菌株WC6同时培养3天后对环丙沙星降解的效果对比图。

图2是菌株WC612对环丙沙星去除的机制验证结果图；其表示接种菌株WC612、不添加菌株空白对照组(Control)以及灭活处理组(高压灭活)三种处理下培养3天后的环丙沙星的残留浓度。

图3是菌株WC612在含10g/L蛋白胨的MSM培养基中培养5天对环丙沙星的降解动力过程及菌株生长和pH变化图；Control代表不加菌的空白对照组。

图4是微重力突变后各菌株与出发前菌株WC6同时培养3天后的解磷的定量效果对比图。

图5是微重力突变后各菌株与出发前菌株WC6同时培养3天后的解钾的定量效果对比图。

图6是菌株WC612的菌落形态图。

图7是菌株WC612的系统发育树图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图说明对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

实施例1

降解环丙沙星的菌株初筛和微重力诱变筛选：

一、从土壤中初筛出耐环丙沙星的菌株

1.材料准备

菌株筛选土壤：采自广东省信宜市池洞镇石庆村的水稻农田，土样用自封袋密封装好，迅速带回实验室4℃冰箱保藏。

LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取粉5g，NaCl 10g，pH7.0～7.2，用纯水定容至1L，121℃灭菌20min。

LB固体培养基：蛋白胨10g，酵母提取粉5g，NaCl 10g，琼脂粉18g，pH7.0～7.2，用纯水定容至1L，121℃灭菌20min。

无机盐(MSM)培养基：将5mL磷酸缓冲溶液(KH₂PO₄ 8.5g/L、K₂HPO₄·H₂O 21.75g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 33.4g/L、NH₄Cl 5.0g/L)，3.0mL浓度为22.5g/L的MgSO₄ 溶液(或含有46.125g/L MgSO₄·7H₂O的水溶液)，1.0mL浓度为0.25g/L的FeCl₃溶液(或含有0.42g/LFeCl₃·6H₂O的水溶液)，1.0mL浓度为36.4g/L的CaCl₂溶液(或含有48.22g/L CaCl₂·2H₂O的水溶液)，1.0mL微量元素溶液(含39.9mg/LMnSO₄·H₂O、42.8mg/LZnSO₄·H₂O、34.7mg/L(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O)混匀，调pH至7.0～7.2，用纯水定容至1L，121℃灭菌20min。

含有10g/L蛋白胨的MSM培养基：将细菌学蛋白胨10g加入MSM培养基溶液中，调节pH至7.0～7.2，用纯水定容至1L，121℃灭菌20min。

2.实验仪器与设备

立式压力蒸汽灭菌锅(BL-50A，上海静科实业有限公司)、便携式pH计(PHB-4，上海精密科学有限公司)、离心机(Centrifuge 5810R，德国Eppendorf公司)、电热烘箱(DGG-9070A，上海森信实验仪器有限公司)、数显恒温水浴锅(HH系列，常州国宇仪器制造有限公司)、超低温冷冻冰箱(DW-HL398，中科美菱低温科技股份有限公司)、生化培养箱(PYX-208S-A，科力仪器)、超净工作台(SW-CJ-1F，苏净安泰空气技术有限公司)、涡旋混合器(XW-80A，上海精科实业有限公司)、MyCycler PCR(T100Thermal Cycler，美国BIO-RAD公司)、电泳仪(DYY-6C，北京六一仪器厂)、振荡培养箱(MQD-M1R，上海旻泉仪器有限公司)。

3.耐环丙沙星菌株的富集、分离与纯化

取10g新鲜土壤加入至90mL无菌水中，放置于30℃、150rpm的恒温摇床中避光振荡30min后静置10min，静置处理后取上清液1mL加入到20mL含有1mg/L环丙沙星的LB培养基中，放置于30℃、150rpm的恒温摇床中避光培养20h得到驯化液。再取1mL驯化液加入到20mL含有2mg/L环丙沙星的LB培养基中继续培养驯化，得到二次驯化液。依次取二次驯化液1mL逐步添加至环丙沙星含量为5、10、20、40、50mg/L的LB培养基中，得到最后的驯化液。

将最后的驯化液用无菌水稀释至10^-5倍，取稀释液0.1mL涂布于含有50mg/L环丙沙星的LB固体培养基上，放置于30℃恒温培养箱培养至菌落形成，得到能够在含有50mg/L环丙沙星的LB固体培养基上生长良好的单菌落，通过划线的方式将生长出来的菌落挑选出来转接至含有50mg/L环丙沙星的LB固体培养基上继续分离纯化，得到能够耐受环丙沙星的纯化菌株。

分离纯化得到的纯化菌株接种到LB液体培养基中进行扩大培养，测定扩培后的培养液生长至OD₆₀₀约为0.4(不超过0.5)时，将菌液按2％(v/v)的比例加至含有10mg/L环丙沙星和10g/L蛋白胨的MSM培养基中，同时添加不加菌的空白对照，置于30℃、150rpm的恒温摇床中避光培养，依次在第0、1、3天收集菌液。菌液以10000r·min^-1离心1min，收集上清过0.22μm有机滤膜，用高效液相色谱方法(HPLC)对滤液中残留的环丙沙星进行测定。筛选得到能够去除环丙沙星的菌株并命名为菌株WC6，将其保存至-80℃冰箱中。

所述的高效液相色谱(HPLC)的条件：液相色谱柱为CNW C18-WP(4.6×250mm，5μm)，B相为乙腈(纯度为99.9％)，D相为磷酸水溶液(pH＝2.4)，V(B):V(D)＝18:82，流速为0.8mL·min^-1，柱温30℃；进样量20μL；紫外检测器检测波长280nm。

二、菌株诱变筛选

1.微重力模拟实验

将筛选得到的菌株WC6在LB固体培养基上于30℃活化，使其生长出菌苔；然后取1mL未凝固的LB固体培养基加入到2mL康宁管中，待LB固体培养基凝固后，使用打孔器在康宁管中心位置打一个深度约为0.3cm，直径约为0.5cm的圆柱小孔，然后用打孔器在菌株培养24h后的平板中取一块厚度为0.3cm，直径约为0.5cm的菌苔，放入康宁管中的小孔处，制备成菌苔样品。

通过微重力生物学实验将菌苔进行突变实验，振动条件为：温度：20℃；转速：9转/分钟；旋转方式：三维旋转；实验时长：72小时。

将进行微重力生物学实验结束后的菌株用无菌水清洗，得到菌液悬浊液，稀释至10^-7后取0.1mL菌液涂布至含10mg/L的环丙沙星的LB固体培养基上，于30℃恒温培养20h后得到突变后依然能够耐受环丙沙星的几种菌的单菌落。随即将挑选出单菌落继续通过划线的方式接种至环丙沙星含量为20、40、50mg/L的LB固体培养基上培养，得到能够耐受高浓度环丙沙星的菌株若干(WC601～WC620)。

2.诱变菌株的效果验证

将所有菌株同时于LB平板上划线活化培养后，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，30℃、150rpm的摇床中培养至测定到菌液OD₆₀₀约为0.4后，按2％(v/v)的比例接种至含有10mg/L环丙沙星和10g/L蛋白胨的MSM培养基中避光培养，并在第0和3天收集培养后的菌液。菌液以10000rpm的转速离心1min，收集上清液过0.22μm有机滤膜，用高效液相色谱方法(HPLC)对滤液中的环丙沙星残留浓度进行测定。将这些菌株去除的环丙沙星与出发菌株WC6比较(图1)，得到去除环丙沙星效果明显提高的且效果最好的菌株，并命名为菌株WC612。

实施例2

优势菌株的WC612的去除机制及菌种鉴定

一、菌株WC612的去除机制验证

将菌株WC612划线于LB平板上30℃活化培养20h后，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，30℃、150rpm的摇床中培养20h后，按2％(v/v)的比例接种至含有10mg/L环丙沙星和10g/L蛋白胨的MSM培养基中培养。实验设置空白对照组、生物降解组、灭活处理组3个处理组，每个处理设置3个重复。

其中空白对照组为添加环丙沙星但不接种菌液；生物降解组为添加环丙沙星并接种菌液；灭活处理组为添加环丙沙星并接种菌液至培养基中培养24h后再进行高温灭活(121℃，20min)。将以上处理组置于30℃、150rpm的摇床中避光培养3天，并于培养的第1、2和3天后收获菌液。菌液以10000rpm的转速离心1min，收集上清液过0.22μm有机滤膜，用高效液相色谱方法(HPLC)对滤液中的环丙沙星残留浓度进行测定。HPLC的条件同实施例1。

结果表明，灭活处理组的环丙沙星残留浓度没有降低，并且生物降解组的环丙沙星有很强的去除效果，因此可知菌株WC612是通过生物降解去除培养基中的环丙沙星(图2)。对照组和高温灭活组中液体培养基由于在培养过程中存在蒸发，测定的环丙沙星浓度呈现升高的结果(高压灭活损失的液体稍多，浓度升高较多)。

二、突变后菌株WC612对环丙沙星降解的能力

将菌株WC612划线于LB平板上30℃培养20h后，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，30℃、150rpm的摇床中培养20h后，按2％(v/v)的比例接种至含10mg/L环丙沙星和10g/L蛋白胨的MSM培养基中培养，并在5天不同时间取样，滤液用高效液相色谱方法(HPLC)对环丙沙星残留浓度进行测定(测定方法同实施例1)。

结果表明，培养4天后WC612达到降解平衡，环丙沙星的残留浓度小于1mg/L，加入WC612培养1天后环丙沙星降解速率极强，降解结束后培养液中的pH约为8.65(图3)。

三、突变前后菌株的解磷解钾能力的对比

1.材料准备

蒙金娜(PVK)培养基的配方如下：葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O0.3g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO₄·7H₂O0.045g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，用纯水定容至1L，pH7.0。

钾细菌培养基的配方如下：钾长石(K₂O·Al₂O₃·6SiO₂)2.5g，Na₂HPO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.02g，NaCl 0.2g，CaCO₃ 5.0g，CaSO₄·2H₂O 0.1g，葡萄糖10g，用纯水定容至1L，pH6.8～7.0。

2.解磷解钾能力测定实验

将所有菌株同时划线于LB平板上30℃培养20h后，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，30℃、150rpm的摇床中培养20h后按1％(v/v)的比例接种至30mL的含有10g/L Ca₃(PO₄)₂的蒙金娜(PVK)液体培养基和钾细菌培养基中，设3个重复试验，置于30℃、150rpm培养3天。同时设置空白对照组：不加菌液(Control)。取培养后菌液，并以10000r/min离心1min后取上清液，采用钼锑抗比色法测定上清液磷含量、火焰分光光度计上机测定上清液钾含量。

结果如图4和图5所示：

可以看到，突变后所有菌株的解磷能力均高于出发前菌株WC6，其中添加菌株WC609、WC612和WC620培养的的菌液中可溶性磷含量分别为469.756、454.628和469.126mg/L；这些菌株突变后解钾能力与出发菌株相较，既存在降低也存在升高，其中添加菌株WC606、WC608和WC612培养的菌液可溶性钾含量分别为10.7、10.5和10.7mg/L。

在突变菌株中，WC612的解磷解钾能力显著提高，具有较高的提高土壤有效磷和钾含量的潜能。

可见，本发明通过地面微重力实验模拟航天诱变获得一株肺炎克雷伯氏突变菌WC612，在相同培养条件下，其对环丙沙星的降解能力大大提高且效果最好，解磷解钾的综合能力也最佳，能够用于土壤改良植物促生，具有较大的应用潜力。

四、菌落的形态特征及鉴定

1.菌落形态观察

该菌株WC612在LB固体平板上生长较快，可在30～37℃生长。菌斑呈淡黄色、圆形、菌落边缘呈透明状，中心向上凸起、光滑、有光泽，在37℃培养36h后，菌落直径约1～2mm。可在含10mg/L环丙沙星和10g/L蛋白胨的LB固体培养基中生长良好(图6)。

2.菌种的分子生物学鉴定

(1)16S rDNA扩增

以提取的细菌总DNA为模板，采用细菌16S rDNA通用引物扩增16S rDNA基因序列。

正向引物为27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；

反向引物为1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

PCR反应总体系为25μL：正向、反向引物各2μL，模板DNA 0.5μL，2×Taq PCRMaster Mix 12.5μL，加灭菌超纯水至总体积25μL。

PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性50s、56℃退火50s、72℃延伸50s，35个循环；最后72℃延伸5min。

(2)16S rDNA序列的测定

将PCR扩增后产物送武汉天一辉远生物科技有限公司(广州分公司)测序。得到菌株的16S rDNA基因序列如下：

GGCTACCATGCAAGTCGAGCGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAATGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCATGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGGTGAGGTTAATAACCTTGTCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTACCACTTGTATCATTGCC。

上述序列由1432碱基(bp)组成。

将获得的16S rDNA基因序列提交至NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)上进行BLAST对比，与LPSN数据库(http://www.bacterio.net/index.html)中相关模式菌株的16S rDNA基因进行同源性比对分析，下载同源性较高的模式菌株序列在NCBI网站上对扩增产物序列进行BLAST比对和同源性分析，采用Mega 7.0软件，以Neighbour-Joining法构建系统发育树。经16S rDNA序列进行比较发现，菌株WC612与肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumonia sp.)有99.93％的同源性(图7)。

根据菌株WC612菌落形态特征和分子生物学鉴定结果，将菌株WC612鉴定为肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumonia sp.)，并命名为肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumonia sp.)WC612。该菌株已于2021年7月23日保存于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为GDMCC NO：61828，保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一株经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌，其特征在于：所述的经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌的名称为肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia）WC612，保藏编号为GDMCC NO：61828，于2021年7月23日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心广东省微生物研究所。

2.权利要求1所述的经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

将经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌接种于培养基中，于30℃～37℃条件下进行培养；

所述的培养基为LB培养基、含环丙沙星和蛋白胨的MSM培养基、PVK培养基或钾细菌培养基。

3.权利要求2所述的经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌的培养方法，其特征在于：

所述的含环丙沙星和蛋白胨的MSM培养基中环丙沙星的浓度为10～60mg/L，蛋白胨的浓度为10g/L；

所述的PVK培养基的组分如下：葡萄糖10g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，NaCl 0.3g/L，KCl 0.3g/L，FeSO₄·7H₂O 0.045g/L，MnSO₄·4H₂O 0.03g/L，余量为水，pH为7.0；

所述的钾细菌培养基的组分如下：钾长石2.5g/L，Na₂HPO₄ 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.02g/L，NaCl 0.2g/L，CaCO₃ 5.0g/L，CaSO₄·2H₂O 0.1g/L，葡萄糖 10g/L，余量为水，pH为6.8～7.0。

4.权利要求3所述的经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌的培养方法，其特征在于：

所述的含环丙沙星和蛋白胨的MSM培养基中环丙沙星的浓度为10mg/L，蛋白胨的浓度为10g/L。

5.权利要求2所述的经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌的培养方法，其特征在于：

所述的培养的温度为30℃；

所述的培养的时间为18～24h。

6.权利要求5所述的经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌的培养方法，其特征在于：

所述的培养的时间为20～24h。

7.权利要求1所述的经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌在污染修复领域中的应用，其特征在于：

通过在环境中添加权利要求1所述的经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌来降解环境中的环丙沙星。

8.权利要求1所述的经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌在土壤地力提升领域中的应用，其特征在于：

通过在土壤中添加权利要求1所述的经微重力诱变选育的肺炎克雷伯氏菌来溶解土壤中的难溶性磷和难溶性钾，提高土壤中的可溶性磷和可溶性钾的含量。