CN106754564A

CN106754564A - 一种红椒根际促生菌液体发酵的方法

Info

Publication number: CN106754564A
Application number: CN201710081107.7A
Authority: CN
Inventors: 翟玮玮; 孙兆远; 侯会绒
Original assignee: Jiangsu Food and Pharmaceutical Science College
Current assignee: Jiangsu Food and Pharmaceutical Science College
Priority date: 2017-02-15
Filing date: 2017-02-15
Publication date: 2017-05-31

Abstract

本发明公开了一种红椒根际促生菌液体发酵的方法，包含以下步骤：取红椒根际促生菌菌株接种至种子培养基中，制成种子液；将发酵培养液灭菌后装入三角瓶中，装样量为25‑75ml，发酵培养液中加入1%‑10%的种子液，在30‑40℃恒温振荡箱中培养24‑72h后即得；所述发酵培养液包括碳源和氮源，pH值调节至5‑7，所述碳源包括葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、甘露醇和乳糖中的一种或几种，所述氮源包括蛋白胨、酵母粉、硝酸钾、谷氨酸、硫酸铵、硝酸铵中的一种或几种。本发明所提供的一种红椒根际促生菌液体发酵的方法，能够使PGPR菌株达到较高的生长量和较高的IAA产量，可用于PGPR生物菌肥的大规模开发。

Description

一种红椒根际促生菌液体发酵的方法

技术领域

本发明涉及一种红椒根际促生菌液体发酵的方法，属于生物发酵技术领域。

背景技术

植物根际促生细菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)是指自由生活在土壤或附生于植物根际的一类可促进植物生长、增加作物产量、防治病害的有益菌类。PGPR能够通过解磷、自生固氮和螯合三价铁离子等方法给植物提供更多的营养物质以达到促进植物根茎生长、改变根形态，增加根毛度、根毛数、侧根数、根重量及根表面积的作用。PGPR还可以分泌IAA(吲哚乙酸)等植物激素，提升细胞壁的疏松度和可塑性，促进RNA和蛋白质的合成，溶解细胞壁糖，改变细胞内环境，进而起到促进细胞生长，增加细胞体积和质量的作用。

我国生物学家早在1953年就从陕西径阳县老苜蓿根系土壤中分离出“5406”PGPR菌株(细黄链霉菌乳糖变种)，经诱变处理制成生物菌肥，结果显示该菌肥具有防病保苗、促进生长和肥地松土的作用。但由于当时发酵设备和技术较为落后，所产生物菌肥肥效稳定性差，特效菌株繁殖性能弱，杂菌污染严重，大大限制了该生物菌肥的大规模应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种红椒根际促生菌液体发酵的方法，对PGPR菌株液态发酵条件进行优化，提高产物中PGPR菌株的数量和活性物质的产量；更进一步地，提供一种红椒根际促生菌液体发酵的方法，得到其最适培养基和最适培养条件，能够用于PGPR生物菌肥的大规模开发。

为解决上述技术问题，本发明提供一种红椒根际促生菌液体发酵的方法，包含以下步骤：

取红椒根际促生菌菌株接种至种子培养基中，制成种子液；将发酵培养液灭菌后装入三角瓶中，装样量为25-75ml，发酵培养液中加入1％-10％的种子液，在30-40℃恒温振荡箱中培养24-72h后即得；

所述发酵培养液包括碳源和氮源，pH值调节至5-7，所述碳源包括葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、甘露醇和乳糖中的一种或几种，所述氮源包括蛋白胨、酵母粉、硝酸钾、谷氨酸、硫酸铵、硝酸铵中的一种或几种。

所述红椒根际促生菌分离自淮安红椒根际。

所述碳源为1％(W/V)的蔗糖。

所述氮源为1％(W/V)的酵母粉。

所述发酵培养液中加入的种子液中活菌含量大于10⁸CFU/mL，接种浓度为5％。

所述发酵培养液pH值为6，装液量50ml，接种后培养时间60h，培养温度35℃。

所述种子液的制备方法为：将接种了红椒根际促生菌菌株的种子培养基在温度30℃，转速150r/min的恒温振荡箱中培养60h。

所述种子培养基包括蛋白胨l0g，酵母提取物5g，氯化钠l0g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min。

所述发酵培养液包括L-色氨酸100mg、(NH₄)₂SO₄2g、NaH₂PO₄0.50g、K₂HPO₄0.50g、MgSO₄0.20g、CaCl₂0.10g、蒸馏水1000mL。

本发明所达到的有益效果：

PGPR菌株培养过程中，影响菌株生长和IAA代谢的主要因素有碳源、氮源、发酵时间、发酵温度、pH值和通气量等，本发明所提供的方法对碳源、氮源、发酵时间、发酵温度、pH值和装液量进行了优化，使PGPR菌株达到较高的生长量(OD600检测)，和较高的IAA产量。

进一步地，对培养基和培养条件进行正交试验优化，获得最适培养基和最适培养基和最适培养条件，使IAA产量达到最高，以应用于PGPR生物菌肥的大规模开发。

因此，本发明所提供的一种红椒根际促生菌液体发酵的方法，能够使PGPR菌株达到较高的生长量和较高的IAA产量，可用于PGPR生物菌肥的大规模开发。

附图说明

图1不同碳源种类对菌株L-4生长和IAA产量的影响

图2不同氮源种类对PGPR菌株生长和IAA产量的影响

图3不同培养时间对菌株L-4生长和产LAA的影响

图4不同培养温度对菌株生长和产LAA的影响

图5不同初始pH对菌株生长和IAA产量的影响

图6不同装液量对菌株L-4生长和IAA产量的影响

具体实施方式

下面对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例一

1.实验材料

红椒根际PGPR促生菌：分离自淮安红椒根际，江苏食品药品职业技术学院微生物实验室分离、筛选、鉴定和保存；3-吲哚乙酸：sigma公司，其余化学试剂均为分析纯。

种子培养基：蛋白胨l0g，酵母提取物5g，氯化钠l0g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min；发酵培养液基础配方：L-色氨酸100mg、(NH₄)2SO₄2g、NaH₂PO₄0.50g、K₂HPO₄0.50g、MgSO₄0.20g、CaCl₂0.10g、蒸馏水1000mL。

2实验方法

2.1种子液制备

将斜面保存的红椒根际PGPR促生菌菌株接种到种子培养基中，在温度30℃，转速150r/min的恒温振荡箱中培养60h，制成活菌含量大于10⁸CFU/mL的种子液，按5％的接种量接入不同条件下的发酵培养液中。

2.2液体发酵

在基础发酵培养液的基础上分别以1％(W/V)的蔗糖替代培养基中的碳源，其他成分固定不变配制发酵培养液，灭菌后将发酵培养液装入250mL三角瓶中(装液量100mL)，加入5％的种子液，在温度30℃、转速150r/min的恒温振荡箱中培养60h。

实施例二

按与实施例一相同的方法进行红椒根际促生菌液体发酵，不同之处在于发酵培养液的配制方法为：在基础发酵培养液的基础上采用1％(W/V)的酵母粉替代培养基中的氮源。

实施例三

1.实验材料

同实施例一

2实验方法

2.1种子液制备

同实施例一

2.2液体发酵

在基础发酵培养液的基础上分别以1％(W/V)的蔗糖替代培养基中的碳源，1％(W/V)的酵母粉替代培养基中的氮源，其他成分固定不变配制pH值＝5的发酵培养液，灭菌后将发酵培养液装入250mL三角瓶中(装液量25mL)，加入1％的种子液，在温度30℃、转速150r/min的恒温振荡箱中培养24h。

实施例四

1.实验材料

同实施例一

2实验方法

2.1种子液制备

同实施例一

2.2液体发酵

在基础发酵培养液的基础上分别以1％(W/V)的蔗糖替代培养基中的碳源，1％(W/V)的酵母粉替代培养基中的氮源，其他成分固定不变配制pH值＝6的发酵培养液，灭菌后将发酵培养液装入250mL三角瓶中(装液量50mL)，加入5％的种子液，在温度35℃、转速150r/min的恒温振荡箱中培养60h。

实施例五

1.实验材料

同实施例一

2实验方法

2.1种子液制备

同实施例一

2.2液体发酵

在基础发酵培养液的基础上分别以1％(W/V)的蔗糖替代培养基中的碳源，10％(W/V)的酵母粉替代培养基中的氮源，其他成分固定不变配制pH值＝7的发酵培养液，灭菌后将发酵培养液装入250mL三角瓶中(装液量75mL)，加入10％的种子液，在温度40℃、转速150r/min的恒温振荡箱中培养72h。

指标测定：

PGPR菌株生长状况用OD₆₀₀表示；IAA产量测定采用Salkowski比色法。具体方法如下：菌悬液10000转/min离心l0min，取上清液，加入等体积Salkowski比色液，避光静置30min，取出立即在530nm处测定吸光度，根据IAA标准曲线计算IAA产量，标准曲线采用3-IAA(3-吲哚乙酸)标准品绘制。

指标测定结果：

1.碳源种类对PGPR菌株生长和IAA产量的影响

在基础发酵培养液的基础上分别加入1％(W/V)的碳源(葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、甘露醇、乳糖)，加入5％种子液在温度35℃、转速150r/min的恒温振荡箱中培养60h后进行OD₆₀₀检测和IAA产量计算，考察不同碳源对PGPR菌株生长和IAA产量的影响，实验结果见图1。

如图1所示，除木糖外，其他5种C源均对PGPR菌体生长有促进作用，效果最为明显的是葡萄糖、蔗糖和甘露醇，果糖和乳糖对PGPR菌体生长有一定作用，但效果不是非常明显，而木糖的添加基本对OD₆₀₀无影响，这说明PGPR促生菌对葡萄糖、蔗糖和甘露醇的吸收利用效果最好，但基本不吸收木糖。由图还可知，蔗糖可以大大提高植物生长激素IAA的产量，果糖和甘露醇次之，木糖仍然效果不明显，值得注意的是葡萄糖并没有大幅度提升IAA产量，这可能是因为高浓度的葡萄糖在反应终止时仍会大量残留，而残留的葡萄糖则与IAA形成无活性的糖基-IAA复合体，降低了游离态IAA的产量。综合考虑选择蔗糖为C源。

2.氮源种类对PGPR菌株生长和IAA产量的影响

在基础发酵培养液的基础上分别加入1％(W/V)的氮源(蛋白胨、酵母粉、硝酸钾、谷氨酸、硫酸铵、硝酸铵)，加入5％种子液在温度35℃、转速150r/min的恒温振荡箱中培养60h后进行OD₆₀₀检测和IAA产量计算，考察不同N源对PGPR菌株生长和IAA产量的影响，实验结果见图2。

如图2所示，蛋白胨、酵母粉两种有机N源对PGPR菌体生长和植物生长激素IAA的产生均有明显地促进作用；硝酸钾同样能显著促进PGPR菌体的生长，但却降低了IAA产量；谷氨酸、硫酸铵对PGPR菌体生长增效不明显，但硫酸铵增加了IAA产量，而谷氨酸则降低了IAA产量；硝酸铵能较大幅度的提高IAA产量，但却阻碍了PGPR菌体的生长。综合考虑选择酵母粉作为N源。

3.培养时间对PGPR菌株生长和IAA产量的影响

磷酸调节发酵培养液pH值为7，灭菌后装入250mL三角瓶中(装液量100mL)，加入5％的种子液，在温度30℃、转速150r/min的恒温振荡箱中培养，分别在12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h取样进行OD₆₀₀检测和IAA产量计算，考察培养时间对PGPR菌株生长和IAA产量的影响，实验结果见图3。

如图3所示，在0-24h内，PGPR细菌快速进入对数生长期，24h后逐渐进入稳定期，并在48h后达到最高点，当发酵时间超过60h时，OD₆₀₀略有下降，这说明PGPR细菌开始出现死亡；由图还可以看出，在12-24h内有少量IAA产生，且IAA产量变化不大，当发酵时间超过24h后，IAA产量快速增加，这主要是因为IAA是PGPR的次级代谢产物，只有在PGPR成熟稳定后才能大量产生并积累；当发酵时间超过60h后，IAA产量反而略有下降，这主要是因为细胞死亡导致的次生代谢产物降低和IAA降解酶将IAA分解产生的。

4.培养温度对PGPR菌株生长和IAA产量的影响

磷酸调节发酵培养液pH值为7，灭菌后装入250mL三角瓶中(装液量100mL)，加入5％的种子液，在转速150r/min，温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃的恒温振荡箱中培养24h后，取样进行OD₆₀₀检测和IAA产量计算，考察培养温度对PGPR菌株生长和IAA产量的影响，实验结果见图4。

如图4所示，随着温度的不断增加，OD₆₀₀值和IAA产量均先快速增大，后快速降低，变化趋势基本一致，并在35℃到达最大值。这说明PGPR菌株的最适生长温度和最适次生代谢温度均为30℃。

5.pH值对PGPR菌株生长和IAA产量的影响

磷酸调节发酵培养液pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，灭菌后装入250mL三角瓶中(装液量100mL)，加入5％的种子液，在温度35℃、转速150r/min的恒温振荡箱中培养24h后，取样进行OD₆₀₀检测和IAA产量计算，考察pH值对PGPR菌株生长和IAA产量的影响，实验结果见图5。

如图5所示，在pH值为4和10时，PGPR菌体均不生长也不产生IAA，这是因为PGPR为中性微生物，在强酸和强碱环境下均不能生长；当溶液脱离强酸强碱环境后(pH在5-9范围内)，PGPR菌体均能较好的生长，这说明PGPR生长具有较宽的pH适应范围；但pH值大于6以后，IAA分泌量有所降低，这说明PGPR积累IAA的最适pH值为5左右。

6.装液量对PGPR菌株生长和IAA产量的影响

磷酸调节发酵培养液pH值为5.0，灭菌后分别取25ml、50ml、75ml、100ml、150ml装入三角瓶中，加入5％的种子液，在温度35℃、转速150r/min的恒温振荡箱中培养24h后，取样进行OD₆₀₀检测和IAA产量计算，考察装液量对PGPR菌株生长和IAA产量的影响，实验结果见图6。

如图6所示，在氧气最为充足的三角瓶中(装液量25ml)，PGPR菌株生长量和IAA产量并不是最大，这说明过多的氧气并不适合PGPR菌株的生长量和IAA的产生，这可能是因为高浓度的氧气会对PGPR菌株产生抑制作用，影响了菌体的分裂和次生产物的代谢；当装液量为50ml时，菌体生长量和IAA产量最大；当装液量大于50ml以后，随着装液量的增多，三角瓶中PGPR细菌数不断增加，而振荡培养过程中溶解氧气量逐渐减少，菌体生长变慢和IAA产量下降，这可能是因为PGPR为严格好氧菌，IAA的合成是好氧代谢，培养基中溶氧量的减少将会影响菌株的生长和IAA产量能力^[13]。

7.最佳发酵条件的确定

在前期单因素实验的基础上，选取培养时间、培养温度、培养液pH值和装液量为因素，进行L₉(4³)正交试验，以IAA产量为指标，考察四因素对PGPR发酵效果的影响，因素水平见表1，实验结果见表2。

表1正交实验因素水平表

表2正交实验结果与分析

由表2中R值可知，各因素对PGPR发酵效果的影响次序为：D＞A＞C＞B，即装液量对PGPR发酵效果的影响最大，培养时间次之，培养温度对PGPR发酵效果的影响最小。由表2中各水平对应的k值可知，本实验的最佳组合A₂B₂C₂D₂，即IAA产量最高时，最佳发酵条件为条件为：培养时间60h、培养温度35℃、发酵液pH值6、装液量50ml。

结论

1)在PGPR菌株培养过程中，影响菌株生长和IAA代谢的主要因素有碳源、氮源、发酵时间、发酵温度、pH值和通气量等，可以通过改变发酵液的成份及培养条件来提高产物中PGPR菌株的数量和活性物质的产量；

2)以IAA产量为评价指标，对红椒根际PGPR促生菌的发酵条件进行了优化，结果表明最佳发酵条件为：培养时间60h、培养温度35℃、发酵液pH值6、装液量50ml；

3)各因素对IAA产量的影响顺序为：装液量>培养时间>溶液pH>培养温度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种红椒根际促生菌液体发酵的方法，其特征在于，包含以下步骤：

取红椒根际促生菌菌株接种至种子培养基中，制成种子液；将发酵培养液灭菌后装入三角瓶中，装样量为25-75ml，发酵培养液中加入1%-10%的种子液，在30-40℃恒温振荡箱中培养24-72h后即得；

2.根据权利要求1所述的一种红椒根际促生菌液体发酵的方法，其特征在于，所述红椒根际促生菌分离自淮安红椒根际。

3.根据权利要求1所述的一种红椒根际促生菌液体发酵的方法，其特征在于，所述碳源为1%（W/V）的蔗糖。

4.根据权利要求1所述的一种红椒根际促生菌液体发酵的方法，其特征在于，所述氮源为1%（W/V）的酵母粉。

5.根据权利要求1所述的一种红椒根际促生菌液体发酵的方法，其特征在于，所述发酵培养液中加入的种子液中活菌含量大于10⁸CFU/mL，接种浓度为5%。

6.根据权利要求1所述的一种红椒根际促生菌液体发酵的方法，其特征在于，所述发酵培养液pH值为6，装液量50 ml，接种后培养时间60 h，培养温度35℃。

7.根据权利要求1所述的一种红椒根际促生菌液体发酵的方法，其特征在于，所述种子液的制备方法为：将接种了红椒根际促生菌菌株的种子培养基在温度30℃，转速150r/min的恒温振荡箱中培养60h。

8.根据权利要求1所述的一种红椒根际促生菌液体发酵的方法，其特征在于，所述种子培养基包括蛋白胨l0g，酵母提取物5g，氯化钠l0g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min。

9.根据权利要求1所述的一种红椒根际促生菌液体发酵的方法，其特征在于，所述发酵培养液包括L-色氨酸100mg、(NH₄)₂SO₄2g、NaH₂PO₄0.50g、K₂HPO₄0.50g、MgSO₄0.20g、CaCl₂0.10g、蒸馏水1000mL。