JPH08163992A - εーポリーＬーリジンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】ε−ポリ−Ｌ−リジン以外の副生成物の生産を
抑制し、対炭素源収率を向上させるε−ポリ−Ｌ−リジ
ンの製造法。 【構成】ストレプトマイセス・アルブラス（Streptomyc
es albulus）種微生物を用いて、ε−ポリ−Ｌ−リジン
を発酵生産する際に、培地中のリン酸分濃度を制限し、
かつ培地中にＬ−リジン及び硫酸アンモニウムを含有さ
せることにより、対炭素源収率を向上させたε−ポリ−
Ｌ−リジンの製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、対炭素源収率を向上さ
せたε−ポリ−Ｌ−リジン（以下εＰＬと略記する）の
製造法に関する。εＰＬは、必須アミノ酸であるＬ−リ
ジンのポリマ−であるため安全性が高くかつカチオン含
量が高いので、特異な物性を有する。したがって食品添
加物として広く用いられているだけでなく、トイレタリ
−用品、化粧品、飼料添加物、医薬、農薬、電子材料等
への利用も期待できる。

【０００２】

【従来の技術】ストレプトマイセス・アルブラス（Stre
ptomyces albulus）種微生物を用いたεＰＬの製造法
が、特公昭59−20359 号公報に、ストレプトマイセス・
アルブラス・サブスピーシーズ・リジノポリメラス菌株
をＬ−リシンのアナログ物質に耐性を有する変異株に変
異処理して得られた該変異株を培地に培養し、培養液中
にεＰＬを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴
とするεＰＬの製造方法が特公平3-78998 号公報に、ス
トレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシーズ・リ
ジノポリメラス菌株をクロラムフェニコールを用いて、
εＰＬの生産に関与する遺伝子を含むプラスミドを増幅
させたεＰＬを生産する菌株をＬ−リシンを添加した培
地にて培養し、培養液中にεＰＬを生成蓄積せしめ、こ
れを採取することを特徴とするεＰＬの製造方法が特公
平3-42075 号公報に記載されている。しかし上記のεＰ
Ｌの製造方法に用いる培地には、Ｌ−リシン、硫酸アン
モニウムおよびリン酸分が含まれてはいるが、リン酸分
濃度が高く、また、培養液中のＬ−リシン濃度を制御し
た製造方法はなかった。そこで、εＰＬ以外の副生成物
の生産に培地中の炭素源が多量に消費されるため、εＰ
Ｌ生産における対炭素源収率が悪く、工業的生産を考え
た場合、生産コストが高くなるという問題点があった。

【０００３】

【発明が解決しようとしている課題】本発明者らは、対
炭素源収率のよいεＰＬの製造法について鋭意検討を重
ねた結果、ストレプトマイセス・アルブラス種微生物を
培養してεＰＬを発酵生産する際に、培地中のリン酸分
濃度を制限し、かつ培地中にＬ−リジン及び硫酸アンモ
ニウムを一定量含有させた培地を用いるか、または培養
液中のＬ−リジン濃度を制御して培養することによっ
て、副生成物の生産を抑え、εＰＬの対炭素源収率が向
上することを見いだし、この知見に基づいて本発明をな
すに至った。本発明は、εＰＬ以外の副生成物に消費さ
れる炭素源量を抑制し、εＰＬの対炭素源収率を向上さ
せることにより、安価で有利なεＰＬの製造法を提供す
ることを目的としている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は下記の構成を有
する。 （１）ストレプトマイセス・アルブラス（Streptomyces
albulus）種微生物を好気的に培地に培養し、得られた
培養液からε−ポリ−Ｌ−リジンを採取する方法におい
て、培地中のリン酸分濃度が50〜300mg/l、Ｌ−リジン
の含有量が2 〜 20g/l、硫酸アンモニウムの含有量が2
〜20g/lであることを特徴とするε−ポリ−Ｌ−リジン
の製造法。 （２）ストレプトマイセス・アルブラス（Streptomyces
albulus）種微生物を好気的に前記第（１）項記載の培
地にて培養し、得られた培養液からε−ポリ−Ｌ−リジ
ンを採取する方法において、培養液中のＬ−リジンの含
有量が1〜10g/lとなるようＬ−リジンを培養液中に逐次
添加あるいは連続添加することを特徴とするε−ポリ−
Ｌ−リジンの製造法。

【０００５】（３）ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌
株がストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ
・リジノポリメラス(Streptomyces albulus subsp.lysi
nopolymerus ）である前記第（１）項もしくは第（２）
項のいずれか１項記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造
法。 （４）ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株がストレプ
トマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリ
メラス(Streptomyces albulus subsp.lysinopolymerus
）No346-D 株のＳ−アミノエチル−Ｌシステインにグ
リシンを添加したものに耐性を持つ変異株11011A-1株
（微工研条寄第1109号）である前記第（１）項もしくは
第２項のいずれか１項記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製
造法。

【０００６】本発明に使用できる微生物は、εＰＬを発
酵液中に蓄積するストレプトマイセス・アルブラス種の
菌株であればいずれも使用可能であり、特に、ストレプ
トマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリ
メラス（Streptomyces albulus subsp. lysinopolymeru
s)11011A-1株（微工研条寄第1109号）およびストレプト
マイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメ
ラス（Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus)
No346-D株が好ましい。

【０００７】本発明に使用する培地のＬ−リジンの含有
量は、2〜20g/l、好ましくは5 〜 10g/lである。Ｌ−リ
ジンの含有量が少ないとεＰＬの生産量が少なくなる。
また、Ｌ−リジンの含有量が多過ぎると、菌の増殖が抑
制される。また、培地に用いられるＬ−リジンは、塩酸
塩あるいは他の塩の形でも差し支えない。本発明に使用
する培地の硫酸アンモニウムの含有量は2〜20g/lであ
り、好ましくは、5 〜 10g/lである。硫酸アンモニウム
を含まない培地では、εＰＬの生産量が著しく低下す
る。培養中に培養液中の硫酸アンモニウム含有量が低下
した場合は、硫酸アンモニウム含有量が2〜20g/lになる
ように追加するのが好ましい。

【０００８】培地に添加されるリン酸分は、リン酸カリ
ウム、リン酸ナトリウム、酵母中に含まれるリン酸塩等
どの形でも構わない。培地に含まれるリン酸分の含有量
は、50〜300mg/l、好ましくは、50〜150 mg/l と通常の
培地に比べ1/5 〜1/30程度に制限する。リン酸分の含有
量が多いと副生成物の生産が多くなり、含有量が少ない
と微生物の増殖に影響を及ぼす。

【０００９】本発明に使用する培地には上記のＬ−リジ
ン、硫酸アンモニウム、リン酸塩の他に、炭素源及びミ
ネラルが用いられる。炭素源としては、好ましくはグル
コ−スであるが、その他フラクト−ス、グリセリン、ス
タ−チ等の、εＰＬ生産菌が資化可能なものなら制限さ
れず、また該炭素源の培地中の含有量としては10〜50g/
lが好ましい。培養中に培養液の炭素源含有量が低下し
た場合は、炭素源含有量が10〜50g/lになるように追加
する。ミネラルとしては、カリウムイオン、マグネシウ
ムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン等が挙げられ、これら
は0.01 〜1 g/lの範囲で培地中に含有することが好まし
い。また、培地中に酵母エキスを1 〜5g/l含有させる
と、菌の生育を良くし、εＰＬの生産においても好まし
い結果を与える。

【００１０】Ｌ−リジンを逐次添加する場合は、培養液
中のＬ−リジンの含有量が、例えば1g/l以下になった時
に2〜20g/lになるように添加する。また、連続添加する
場合は、培養液中のＬ−リジンが常に2〜20g/lになるよ
うに添加する。

【００１１】培養は、好気的条件下で振とう培養、撹拌
培養等を行う。培養温度は２５〜３０℃が好ましい。培
地のｐＨは中性付近（ｐＨ６〜８）が好ましいが、培養
開始後菌の生育とともにｐＨは低下する。εＰＬの生産
には培地のｐＨが４付近が好ましいので、培養液のｐＨ
が４以下に低下した時点で、アルカリを添加してｐＨを
４に維持させる。添加するアルカリはアンモニア水が好
ましいが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムの水溶液
等でも差し支えない。通常１〜５日間でεＰＬが培養液
中に蓄積される。

【００１２】遠心分離あるいはフィルタ−で上記培養液
から菌体を除いた後、菌体除去液を精製、脱色し、これ
を濃縮する。濃縮液からアセトン、エタノ−ル等の有機
溶媒で晶析することにより、εＰＬが得られる。

【００１３】実施例 本発明を実施例より更に詳細に説明する。εＰＬ濃度、
残存グルコ−ス濃度、残存Ｌ−リジン濃度を以下の方法
により測定した。 （１）εＰＬ濃度をイツアキ（Itzhaki)（アナリティカ
ルバイオケミストリー(Analytical Biochemistry),50,
569) の方法により測定した。すなわち、０〜２００μ
ｇのεＰＬを含む溶液２ｍｌと１ｍＭメチルオレンジ水
溶液２ｍｌとを混合し、室温で３０分間放置後、生じた
εＰＬ−メチルオレンジコンプレックスを遠心分離によ
り除き、その上澄水の４６５ｎｍにおける吸光度を測定
し、εＰＬ量を求めた。

【００１４】（２）残存グルコ−ス濃度を、ムタロタ−
ゼ・グルコ−スオキシダ−ゼ法、すなわち、試料（グル
コースを０〜１００μｇ含む）２０μｌに発色試薬（ム
タローゼ0.13ユニット／ｍｌ、グルコースオキシダーゼ
9.0ユニット／ｍｌ、ペルオキシダーゼ0.65ユニット／
ｍｌ、４−アミノアンチピリン0.50ｍＭ、アスコルビン
酸オキシダーゼ2.7ユニット／ｍｌを添加したフェノー
ル５．３ｍＭを含む６０ｍｍリン酸緩衝液(ｐＨ７．
１)）３ｍｌを混合し、３７℃で５分間加温後、５０５
ｎｍにおける吸光度を測定し、求めた。 （３）残存Ｌ−リジン濃度を、Ｌ−リジン−α−オキシ
ダ−ゼ法で測定した。すなわち、１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）２００μｌに７０ｍＭフェノール１００μ
ｌ、３０ｍＭ４ーアミノアンチピリン１００μｌを加
え、さらに０〜３００μｇのＬ−リジンを含む溶液４５
０μｌを加え混合した後、１２０ユニット／ｍｌのパー
オキシダーゼ５０μｌを加え、３０℃で２０分間加温し
た後に、５００ｎｍにおける吸光度を測定して求めた。

【００１５】実施例１ グルコ−ス50g/l、酵母エキス 5g/l（リン酸濃度として
約100mg/l 含有) 、硫酸アンモニウム10g/l、Ｌ−リジ
ン10g/l、MgSO4・7H2O 0.5g/l、ZnSO4・7H2O 0.04g/l、Fe
SO4・7H2O 0.03g/l pH6.8 の培地２Ｌを調整し、３Ｌ容
ジャ−に入れ、ストレプトマイセス・アルブラス・サブ
スピ−シズ・リジノポリメラス（Streptomyces albulus
subsp. lysinopolymerus)11011A-1株（微工研条寄第11
09号）を接種し、３０℃、７００rpm で９６時間好気培
養を行った。発酵液を遠心分離によって除菌した後、上
澄水のεＰＬ濃度、残存グルコ−ス濃度、残存Ｌ−リジ
ン濃度を測定した。その結果、εＰＬの対炭素源収率は
２２％であった。また、菌体１ｇ当たりのεＰＬ生産活
性は、0.51g/g・dry cell/dayであった。

【００１６】実施例２ Ｌ−リジン含有量を 5g/lとした以外は実施例１に準拠
して培養を行った。その結果、εＰＬの対炭素源収率は
２２％であった。また、菌体１ｇ当たりのεＰＬ生産活
性は、0.50g/g・dry cell/dayであった。

【００１７】実施例３ Ｌ−リジン含有量を 2g/lとした以外は実施例１に準拠
して培養を行った。その結果、εＰＬの対炭素源収率は
１８％であった。また、菌体１ｇ当たりのεＰＬ生産活
性は、0.44g/g・dry cell/dayであった。

【００１８】実施例４ KH2PO4 0.2g/lを添加する（全リン酸濃度として240mg/l
含有）こと以外は実施例１に準拠して培養を行った。
その結果、εＰＬの対炭素源収率は１４％であった。ま
た菌体１ｇ当たりのεＰＬ生産活性は、0.40g/g・dry ce
ll/dayであった。

【００１９】実施例５ ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リ
ジノポリメラス（Streptomyces albulus subsp. lysino
polymerus)11011A-1株の代わりに、ストレプトマイセス
・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラス（St
reptomyces albulus subsp. lysinopolymerus) No346-D
株を用いた以外は実施例１に準拠して培養を行った。そ
の結果、εＰＬの対炭素源収率は１５％であった。ま
た、菌体１ｇ当たりのεＰＬ生産活性は、0.35g/g・dry
cell/dayであった。

【００２０】実施例６ 培養時間を２８８時間とし、培養液中のグルコース含有
量が10g/l以下に、硫酸アンモニウム含有量が5g/l以下
に、またＬ−リジンの含有量が1g/l以下にならないよう
に、それぞれを逐次添加した。それ以外の条件について
は実施例１に準拠して培養を行った。その結果、εＰＬ
の対炭素源収率は２６％となった。

【００２１】比較例１ グルコ−ス50g/l、酵母エキス 5g/l（リン酸濃度として
約100mg/l 含有) 、硫酸アンモニウム10g/l、K2HPO4 0.
8 g/l、KH2PO4 1.36g/l、MgSO4・7H2O 0.5g/l、ZnSO4・7H
2O 0.04g/l、FeSO4・7H2O 0.03g/l pH 6.8 の培地２Ｌを
調整し、実施例１に準拠して培養を行った。その結果、
εＰＬの対炭素源収率は８％であった。また、菌体１ｇ
当たりのεＰＬ生産活性は、0.28g/g・dry cell/dayであ
った。

【００２２】比較例２ Ｌ−リジン10g/lを添加すること以外は比較例１に準拠
して培養を行った。その結果、εＰＬの対炭素源収率は
９％であった。また、菌体１ｇ当たりのεＰＬ生産活性
は、0.31g/g・dry cell/dayであった。

【００２３】比較例３ K2HPO4 及び KH2PO4 を添加しないこと以外は比較例１
に準拠して培養を行った。その結果、εＰＬの対炭素源
収率は１０％であった。また、菌体１ｇ当たりのεＰＬ
生産活性は、0.32g/g・dry cell/dayであった。

【００２４】比較例４ Ｌ−リジン10g/lを添加し、硫酸アンモニウムを添加し
ないこと以外は実施例１に準拠して培養を行った。その
結果、εＰＬの対炭素源収率は３％であった。また、菌
体１ｇ当たりのεＰＬ生産活性は、0.04g/g・dry cell/d
ayであった。

【００２５】比較例５ ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リ
ジノポリメラス（Streptomyces albulus subsp. lysino
polymerus) 11011A-1 株の代わりに、ストレプトマイセ
ス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラス
（Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus) No3
46-D株を用いた以外は、比較例１に準拠して培養を行っ
た。その結果、εＰＬの対炭素源収率は５％であった。
また、菌体１ｇ当たりのεＰＬ生産活性は、0.22g/g・dr
y cell/dayであった。

【００２６】比較例６ Ｌ−リジンを追加しないこと以外は、実施例６に準拠し
て培養を行った結果、εＰＬの対炭素源収率は１９％で
あった。

【００２７】

【発明の効果】本発明の製造法により、副生成物の生産
を抑制し、εＰＬの対炭素源収率を従来の２〜３倍に高
めることが可能となり、収率よくεＰＬを製造すること
ができる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ストレプトマイセス・アルブラス（Strept
   omyces albulus）種微生物を好気的に培地に培養し、得
   られた培養液からε−ポリ−Ｌ−リジンを採取する方法
   において、リン酸分濃度が50〜300mg/l、Ｌ−リジンの
   含有量が2〜20g/l、硫酸アンモニウムの含有量が2〜20g
   /lである培地を用いることを特徴とするε−ポリ−Ｌ−
   リジンの製造法。
2. 【請求項２】ストレプトマイセス・アルブラス（Strept
   omyces albulus）種微生物を好気的に請求項１記載の培
   地にて培養し、得られた培養液からε−ポリ−Ｌ−リジ
   ンを採取する方法において、培養液中のＬ−リジンの含
   有量が1〜10g/lとなるようにＬ−リジンを培養液中に逐
   次添加もしくは連続添加することを特徴とするε−ポリ
   −Ｌ−リジンの製造法。
3. 【請求項３】ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株がス
   トレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジ
   ノポリメラス(Streptomyces albulus subsp.lysinopoly
   merus ）である請求項１または請求項２のいずれか１項
   記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
4. 【請求項４】ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株がス
   トレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジ
   ノポリメラス(Streptomyces albulus subsp.lysinopoly
   merus ）No346-D 株のＳ−アミノエチル−Ｌシステイン
   にグリシンを添加したものに耐性を持つ変異株11011A-1
   株（微工研条寄第1109号）である請求項１または請求項
   ２のいずれか１項記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造
   法。