CN114134184B - 一种添加维生素b6提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法 - Google Patents
一种添加维生素b6提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114134184B CN114134184B CN202111407948.5A CN202111407948A CN114134184B CN 114134184 B CN114134184 B CN 114134184B CN 202111407948 A CN202111407948 A CN 202111407948A CN 114134184 B CN114134184 B CN 114134184B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- engineering bacteria
- hema
- aminolevulinic acid
- culturing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 110
- ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 88755TAZ87 Chemical compound NCC(=O)CCC(O)=O ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 60
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 55
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Natural products CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 55
- 235000019158 vitamin B6 Nutrition 0.000 title claims abstract description 55
- 239000011726 vitamin B6 Substances 0.000 title claims abstract description 55
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 title claims abstract description 55
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 52
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 44
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 229960002749 aminolevulinic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 112
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 112
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 33
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims abstract description 31
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims abstract description 31
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 18
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 36
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 30
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 21
- 101150112623 hemA gene Proteins 0.000 claims description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 12
- 101150117659 rhtA gene Proteins 0.000 claims description 12
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims description 9
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 9
- 101710084741 5-aminolevulinate synthase Proteins 0.000 claims description 6
- 101710188223 5-aminolevulinate synthase, mitochondrial Proteins 0.000 claims description 6
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims description 6
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 6
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 claims description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 6
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000191043 Rhodobacter sphaeroides Species 0.000 claims description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 3
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 33
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 6
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 6
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 4
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 4
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 2
- YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N acetylacetone Chemical compound CC(=O)CC(C)=O YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+3].N#[C-].N([C@@H]([C@]1(C)[N-]\C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C(\C)/C1=N/C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C\C1=N\C([C@H](C1(C)C)CCC(N)=O)=C/1C)[C@@H]2CC(N)=O)=C\1[C@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](N2C3=CC(C)=C(C)C=C3N=C2)O[C@@H]1CO FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 2
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 2
- DGPBVJWCIDNDPN-UHFFFAOYSA-N 2-(dimethylamino)benzaldehyde Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=C1C=O DGPBVJWCIDNDPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWYNPYYXRKHZHX-UHFFFAOYSA-N 5-azanyl-4-oxidanylidene-pentanoic acid Chemical compound NCC(=O)CCC(O)=O.NCC(=O)CCC(O)=O QWYNPYYXRKHZHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000190950 Rhodopseudomonas palustris Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 1
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000008558 metabolic pathway by substance Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000002428 photodynamic therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000005648 plant growth regulator Substances 0.000 description 1
- 230000001863 plant nutrition Effects 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 description 1
- 229960001327 pyridoxal phosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N succinyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/005—Amino acids other than alpha- or beta amino acids, e.g. gamma amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于代谢工程和微生物发酵技术领域，具体涉及一种添加维生素B6提高大肠杆菌工程菌合成5‑氨基乙酰丙酸的方法，包括以下步骤：（1）将保藏的发酵工程菌活化、培养得到发酵种子；其中，所述发酵工程菌为E.coli MG1655/pTrc‑hemA‑rhtA；（2）往发酵培养基中添加维生素B6和氨苄青霉素至终浓度分别为5‑80mg/L和100mg/L，并将发酵种子接种于发酵培养基中，得到发酵物料；（3）将发酵物料进行发酵培养至3h时，往其中加入IPTG至所述发酵物料中IPTG的终浓度为0.05mM，继续发酵培养至24h时，停止发酵。本发明通过维生素B6的添加，实现了5‑ALA产量的提高。
Description
【技术领域】
本发明属于代谢工程和微生物发酵技术领域，具体涉及一种添加维生素B6提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法。
【背景技术】
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid)简称5-ALA，是一种非蛋白质氨基酸，在生命体中广泛存在，是血红素、叶绿素、维生素B12等四吡咯化合物生物合成的必需前体。由于在生物体内所处的关键代谢节点及其下游代谢物的重要生理功能，5-ALA在医药、保健、动物健康和植物营养等方面具有重要的应用价值和广阔的应用前景。作为第二代光敏剂，5-ALA从上世纪90年代就开始用于皮肤类疾病的光动力学治疗以及癌症的光动力学诊断和辅助切除。基于血红素和维生素B12在动物能量和物质代谢中的重要作用，外源补充5-ALA可以促进人体和畜禽的新陈代谢，增强机体活力和免疫力。另外，由于具有生物可降解和无毒无残留的特性，5-ALA还被应用于农业领域，如：用作绿色安全的植物生长调节剂、用于促进作物在逆境条件下的生长以及果实着色等。
目前，5-ALA主要通过化学合成法生产，然而化学合成工艺的高复杂性和高污染限制了其工业化生产的规模；同时，因合成的多步催化反应以及低产物收率，也进一步推高了产品的生产成本，从而限制了其在各领域中的大规模应用推广。尽管5-ALA生物合成技术的研究几乎与化学合成技术同时开始，但早期生物合成技术的水平很低，无法满足产业化生产的要求。伴随着生物技术的多轮重大变革，5-ALA生物合成技术也不断发展，技术水平得到了显著的提升。5-ALA生物合成技术替代传统化学合成技术，降低生产成本，并在农业和畜牧等领域大规模推广应用已经是大势所趋。
生物体内有两条5-ALA生物合成途径，即C5途径和C4途径，C5途径主要存在于高等植物、藻类和细菌中，该途径以谷氨酸为底物，通过三步酶促反应合成5-ALA，代谢调控复杂,且产量提高有难度，因而不被广泛研究；而C4途径主要存在于动物、真菌、原生动物和一些光合细菌中，如沼泽红假单胞菌，途径以琥珀酰辅酶A和甘氨酸为底物，通过一步酶促反应合成5-ALA，生成的5-ALA经过多步酶促反应生产血红素等终产物，该途径由于途径较短,调控简单而被广泛研究。但目前由于采用C4途径合成5-ALA的方法，由于生产成本高，且其合成量仍远远不能满足各领域的需求，5-ALA仍属于稀缺资源，因此有必要探索5-ALA合成量高且低成本的方案。
【发明内容】
鉴于上述内容，有必要提供一种添加维生素B6提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法，本发明通过在发酵工程菌发酵起始阶段添加维生素B6，达到了5-氨基乙酰丙酸合成量提高的效果。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种添加维生素B6提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法，包括以下步骤：
(1)将保藏状态的发酵工程菌活化后，转接至备好的摇瓶发酵培养基中，并于温度为37℃的条件下培养12h，得到发酵种子；其中，所述发酵工程菌以大肠杆菌为宿主，以pTrc-99a为载体过量表达外向转运蛋白基因rhtA和来自类球红细菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因hemA；
(2)备好发酵培养基，往其中添加维生素B6和氨苄青霉素并搅匀，直至所述发酵培养基中维生素B6的终浓度为5-80mg/L、所述氨苄青霉素的终浓度为100mg/L；接着，将步骤(1)得到的发酵种子以1-5％的接种量接种于所述发酵培养基中，得到发酵物料；
(3)将上述得到的发酵物料置于温度为37℃、转速为220rpm的条件下进行发酵培养；发酵培养至3h时，往其中加入IPTG至所述发酵物料中IPTG的终浓度为0.05mM，并调节温度为30℃的条件进行诱导基因表达，继续发酵培养至24h时，停止发酵。
在本发明中，进一步的说明，上述步骤(1)所述活化的方法为：将甘油管中的发酵工程菌划线接种到LB固体培养基培养，并于37℃的条件下倒置培养16-20h。
在本发明中，进一步的说明，上述步骤(2)中，所述发酵培养基中维生素B6的终浓度为10-40mg/L。
在本发明中，进一步的说明,上述步骤(2)中，所述发酵培养基中维生素B6的终浓度为20mg/L。
在本发明中，进一步的说明，步骤(1)中所述大肠杆菌为E.coli MG1655。
在本发明中，进一步的说明，步骤(1)所述发酵工程菌的构建方法如下：
I.合成hemA基因片段后，在其5'端和3'端分别引入EcoR I和Kpn I酶切位点，得到第一目的片段；将第一目的片段和pTrc-99a载体分别用EcoR I和Kpn I进行酶切处理，回收酶切产物并纯化，将两者纯化后的酶切产物在DNA连接酶的作用下连接，连接条件为16℃、30min，得到第一连接产物；
II.将第一连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含100ug/mL的氨苄青霉素LB固体平板，并于37℃的条件下倒置培养16-20h；挑取平板的单菌落接种于5mL含100ug/mL的氨苄青霉素的LB培养基，于37℃、220rpm的条件下过夜培养，再收集菌体并提取DNA质粒，经测序验证，插入hemA片段的质粒命名为pTrc-hemA质粒；
III.以E.coli MG1655的基因组序列为参照，设计引物F-rhtA：GCTCTAGACCGCCAGTTACAGTAGAAG，及R-rhtA：GCCAAGCTTATTCTTATTTATCTGCTCGC；以E.coliMG1655的基因组为模板扩增带有自身启动子的rhtA基因片段，并分别在5'端和3'端引入Xba I和Hind III酶切位点，使用高保真Taq酶进行PCR扩增，得到扩增产物；将扩增产物和pTrc-hemA质粒分别用Xba I和Hind III酶切，并回收酶切产物，将两者纯化后的酶切产物在DNA连接酶的作用下连接，连接条件为16℃、30min，得到第二连接产物；
IV.将第二连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含100ug/mL的氨苄青霉素LB固体平板，于37℃的条件下倒置培养16-20h；挑取平板的单菌落接种于5mL含100ug/mL的氨苄青霉素的LB培养基，并于37℃、220rpm的条件过夜培养后，收集菌体并提取DNA质粒；经测序验证，插入rhtA片段的质粒命名为pTrc-hemA-rhtA质粒；再将pTrc-hemA-rhtA质粒转化E.coli MG1655感受态细胞，转化产物涂布于含100ug/mL的氨苄青霉素LB固体平板，于37℃的条件倒置培养16-20h后；挑取平板的单菌落接种于5mL含100ug/mL的氨苄青霉素的LB培养基，并于37℃、220rpm的条件下过夜培养，再收集菌体并提取DNA质粒；经测序验证正确的菌株命名为E.coli MG1655/pTrc-hemA-rhtA，即为发酵工程菌。
在本发明中，进一步的说明，上述发酵工程菌的构建方法中，步骤III所述PCR扩增的参数为：98℃预变性30s；98℃变性10s；55℃退火5s；72℃延伸30s，循环30次；72℃延伸3min。
在本发明中，进一步的说明，步骤(1)中所述5-氨基乙酰丙酸合成酶基因hemA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明中，进一步的说明，步骤(1)中所述外向转运蛋白基因rhtA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明涉及的培养基配方及制备方法如下：
(1)摇瓶发酵培养基：
其包含的原料及各原料的质量浓度为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L、磷酸氢二钾8.3g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁0.3g/L、琥珀酸12g/L、甘氨酸4g/L、葡萄糖15g/L和无菌水。
制备方法为：按量称取上述各原料，除无菌水外，将葡萄糖和其余原料分别置于两个不同的容器，将无菌水分装于两个容器中，搅拌至各容器内原料溶解，分别得到葡萄糖溶液和混合原料溶液；接着，将葡萄糖溶液置于115℃的温度条件下进行灭菌20min，将混合原料溶液置于121℃的温度条件下进行灭菌20min，再将灭菌后的葡萄糖溶液和混合原料溶液混合均匀，并调节pH值至6.5。
(2)发酵培养基
其包含的原料及各原料的质量浓度为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L、磷酸氢二钾8.3g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁0.25g/L、琥珀酸12g/L、甘氨酸4g/L、葡萄糖15g/L和无菌水。
制备方法为：按量称取上述材料，并混合搅拌均匀后调节pH至6.5，接着，置于121℃的条件下灭菌20min。
(3)LB固体培养基
其包含的原料及各原料的质量浓度为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L。
制备方法为：按比例添加各原料及水，搅拌均匀后置于121℃灭菌20min。
本发明以生物体内合成5-氨基乙酰丙酸的途径之一C4途径为理论依据，通过大量研究探索C4途径中制约5-氨基乙酰丙酸合成量的因素，并以此为出发点，探索出有效解决方案，成功达到提高5-氨基乙酰丙酸合成量的效果。
首先，本发明以含有插入外向转运蛋白基因rhtA和5-氨基乙酰丙酸合成酶基因hemA的重质粒为发酵工程菌，通过发酵产生分别催化5-氨基乙酰丙酸合成的5-氨基乙酰丙酸合成酶以及影响5-氨基乙酰丙酸胞外积累的外向转运蛋白，而本发明在证实维生素B6对发酵工程菌的生长活性无影响的前提下(参阅图1)，往发酵起始阶段往发酵培养基中添加的维生素B6，发酵工程菌通过摄取、吸收、消化，并转化为5-氨基乙酰丙酸合成酶的依赖性物质磷酸吡哆醛，因而达到提高5-氨基乙酰丙酸合成量的作用；另外，本发明维生素B6的添加量科学合理，恰到好处的促进5-氨基乙酰丙酸的合成，又避免添加过量导致原材料的浪费，发酵结果表明，通过在发酵起始阶段添加维生素B6，5-氨基乙酰丙酸合成量可高达3.1g/L，相对于不添加维生素B6的对照组增多了0.96g/L，实现了5-氨基乙酰丙酸合成研究领域的又一突破，且维生素B6成本低廉，本发明实现了5-氨基乙酰丙酸合成的低成本高产量。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1.本发明通过发酵初试阶段向发酵培养基中添加维生素B6，并通过科学合理控制维生素B6的添加量，实现了5-氨基乙酰丙酸合成量的提高。
2.本发明的添加物添加维生素B6来源广，价格低廉，为实现5-氨基乙酰丙酸合成的低成本高产量提供有效可行的方案。
【附图说明】
图1是添加维生素B6对细胞生长的影响图。
图2是添加不同浓度的维生素B6对大肠杆菌工程菌积累5-ALA的影响图。
【具体实施方式】
本发明提供了提供一种添加维生素B6提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下所有实施方式及对比例中，涉及的培养基配方及制备方法如下：
(1)摇瓶发酵培养基：
其包含的原料及各原料的质量浓度为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L、磷酸氢二钾8.3g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁0.3g/L、琥珀酸12g/L、甘氨酸4g/L、葡萄糖15g/L和无菌水。
制备方法为：按量称取上述各原料，除无菌水外，将葡萄糖和其余原料分别置于两个不同的容器，将无菌水分装于两个容器中，搅拌至各容器内原料溶解，分别得到葡萄糖溶液和混合原料溶液；接着，将葡萄糖溶液置于115℃的温度条件下进行灭菌20min，将混合原料溶液置于121℃的温度条件下进行灭菌20min，再将灭菌后的葡萄糖溶液和混合原料溶液混合均匀，并调节pH值至6.5。
(2)发酵培养基
其包含的原料及各原料的质量浓度为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L、磷酸氢二钾8.3g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁0.25g/L、琥珀酸12g/L、甘氨酸4g/L、葡萄糖15g/L和无菌水。
制备方法为：按量称取上述材料，并混合搅拌均匀后调节pH至6.5，接着，置于121℃的条件下灭菌20min。
(3)LB固体培养基
其包含的原料及各原料的质量浓度为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L。
制备方法为：按比例添加各原料及水，搅拌均匀后置于121℃灭菌20min。
实施例1
一种添加维生素B6提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法，包括以下步骤：
(1)将保藏状态的发酵工程菌活化后，转接至备好的摇瓶发酵培养基中，并于温度为37℃的条件下培养12h，得到发酵种子；其中，所述发酵工程菌以大肠杆菌E.coli MG1655为宿主，以pTrc-99a为载体过量表达外向转运蛋白基因rhtA和来自类球红细菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因hemA；所述5-氨基乙酰丙酸合成酶基因hemA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述外向转运蛋白基因rhtA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
其中，发酵工程菌按以下方法进行活化：将甘油管中的发酵工程菌划线接种到LB固体培养基培养，并于37℃的条件下倒置培养16h；
(2)备好发酵培养基，往其中添加维生素B6和氨苄青霉素并搅匀，直至所述发酵培养基中维生素B6的终浓度为5mg/L、所述氨苄青霉素的终浓度为100mg/L；接着，将步骤(1)得到的发酵种子以1-5％的接种量接种于所述发酵培养基中，得到发酵物料；
(3)将上述得到的发酵物料置于温度为37℃、转速为220rpm的条件下进行发酵培养；发酵培养至3h时，往其中加入IPTG至所述发酵物料中IPTG的终浓度为0.05mM，并调节温度为30℃的条件进行诱导基因表达，继续发酵培养至24h时，停止发酵。
其中，上述发酵所用的发酵工程菌的构建方法如下：
I.合成hemA基因片段后，在其5'端和3'端分别引入EcoR I和Kpn I酶切位点，得到第一目的片段；将第一目的片段和pTrc-99a载体分别用EcoR I和Kpn I进行酶切处理，回收酶切产物并纯化，将两者纯化后的酶切产物在DNA连接酶的作用下连接，连接条件为16℃、30min，得到第一连接产物；
II.将第一连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含100ug/mL的氨苄青霉素LB固体平板，并于37℃的条件下倒置培养16h；挑取平板的单菌落接种于5mL含100ug/mL的氨苄青霉素的LB培养基，于37℃、220rpm的条件下过夜培养，再收集菌体并提取DNA质粒，经测序验证，插入hemA片段的质粒命名为pTrc-hemA质粒；
III.以E.coli MG1655的基因组序列为参照，设计引物F-rhtA：GCTCTAGACCGCCAGTTACAGTAGAAG，及R-rhtA：GCCAAGCTTATTCTTATTTATCTGCTCGC；以E.coliMG1655的基因组为模板扩增带有自身启动子的rhtA基因片段，并分别在5'端和3'端引入Xba I和Hind III酶切位点，使用高保真Taq酶进行PCR扩增，PCR扩增的参数为：98℃预变性30s；98℃变性10s；55℃退火5s；72℃延伸30s，循环30次；72℃延伸3min，得到扩增产物；将扩增产物和pTrc-hemA质粒分别用Xba I和Hind III酶切，并回收酶切产物，将两者纯化后的酶切产物在DNA连接酶的作用下连接，连接条件为16℃、30min，得到第二连接产物；
IV.将第二连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含100ug/mL的氨苄青霉素LB固体平板，于37℃的条件下倒置培养16h；挑取平板的单菌落接种于5mL含100ug/mL的氨苄青霉素的LB培养基，并于37℃、220rpm的条件过夜培养后，收集菌体并提取DNA质粒；经测序验证，插入rhtA片段的质粒命名为pTrc-hemA-rhtA质粒；再将pTrc-hemA-rhtA质粒转化E.coli MG1655感受态细胞，转化产物涂布于含100ug/mL的氨苄青霉素LB固体平板，于37℃的条件倒置培养16h后；挑取平板的单菌落接种于5mL含100ug/mL的氨苄青霉素的LB培养基，并于37℃、220rpm的条件下过夜培养，再收集菌体并提取DNA质粒；经测序验证正确的菌株命名为E.coli MG1655/pTrc-hemA-rhtA，即为发酵工程菌。
实施例2
一种添加维生素B6提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法，其与实施例1的区别在于：
步骤(1)中，发酵工程菌按以下方法进行活化：将甘油管中的发酵工程菌划线接种到LB固体培养基培养，并于37℃的条件下倒置培养18h；
步骤(2)中所述发酵培养基中维生素B6的终浓度为10mg/L；
发酵工程菌的构建过程中：
步骤II中，将第一连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含100ug/mL的氨苄青霉素LB固体平板，于37℃的条件下倒置培养时间为18h。
步骤IV中，将第二连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含100ug/mL的氨苄青霉素LB固体平板，于37℃的条件下倒置培养时间为18h；将pTrc-hemA-rhtA质粒转化E.coli MG1655感受态细胞，转化产物涂布于含100ug/mL的氨苄青霉素LB固体平板，于37℃的条件倒置培养时间为18h；
其余与实施例1相同。
实施例3
一种添加维生素B6提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法，其步骤(2)中所述发酵培养基中维生素B6的终浓度为20mg/L，其余与实施例1相同。
一种添加维生素B6提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法，其与实施例1的区别在于：
步骤(1)中，发酵工程菌按以下方法进行活化：将甘油管中的发酵工程菌划线接种到LB固体培养基培养，并于37℃的条件下倒置培养20h；
步骤(2)中所述发酵培养基中维生素B6的终浓度为20mg/L；
发酵工程菌的构建过程中：
步骤II中，将第一连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含100ug/mL的氨苄青霉素LB固体平板，于37℃的条件下倒置培养时间为20h。
步骤IV中，将第二连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含100ug/mL的氨苄青霉素LB固体平板，于37℃的条件下倒置培养时间为20h；将pTrc-hemA-rhtA质粒转化E.coli MG1655感受态细胞，转化产物涂布于含100ug/mL的氨苄青霉素LB固体平板，于37℃的条件倒置培养时间为20h；
其余与实施例1相同。
实施例4
一种添加维生素B6提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法，其与实施例1的区别在于：步骤(2)中所述发酵培养基中维生素B6的终浓度为40mg/L，其余与实施例1相同。
实施例5
一种添加维生素B6提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法，其与实施例1的区别在于：其步骤(2)中所述发酵培养基中维生素B6的终浓度为80mg/L，其余与实施例1相同。
对比例
一种添加维生素B6提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法，与实施例1的区别在于：其步骤(2)中所述发酵培养基中不添加维生素B6，其余与实施例1相同。
实验结果：
按上述实施例以及对比例对发酵工程菌进行发酵24小时，分别检测发酵液中5-氨基乙酰丙酸的积累量，5-氨基乙酰丙酸的检测方法如下：
取200μL稀释的发酵液，往其中加入pH值为4.6乙酸钠缓冲液100μL，并加入5μL乙酰丙酮，接着，于100℃的条件下进行水浴温浴15min后，冷却至室温，并加入等体积的Ehrlish’s试剂混匀，显色10min后测定553nm下的吸光度，其中Ehrlish’s试剂的成分为42mL冰醋酸、8mL 70％高氯酸和1g二甲氨基苯甲醛。
按上述检测方法对实施例1-5以及对比例发酵24h后的发酵液进行检测，根据检测结果，以维生素B6的添加量为横坐标，以5-氨基乙酰丙酸的合成量为纵坐标，绘制两者的关系柱状图，结果如图2所述，结果表明，本发明经添加维生素B6，相对于对比例，5-氨基乙酰丙酸的合成量均有不同程度的提高，其中维生素B6的添加量为20mg/L时，5-氨基乙酰丙酸的合成量最多，达3.10g/L，表现出良好的5-氨基乙酰丙酸合成提高效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 南宁汉和生物科技股份有限公司
<120> 一种添加维生素B6提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1224
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggactaca atctggcact cgataccgct ctgaaccggc tccataccga gggccggtac 60
cggaccttca tcgacatcga gcggcgcaag ggtgccttcc cgaaagccat gtggcgcaag 120
cccgacggga gcgagaagga aatcaccgtc tggtgcggca acgactatct cggcatgggc 180
cagcatccgg tggtgctggg ggccatgcac gaggcgctgg attcgaccgg cgccgggtcg 240
ggcggcacgc gcaacatctc gggcaccacg ctctatcaca agcgcctcga ggccgagctc 300
gccgacctgc acggcaagga agcggcgctg gtcttctcgt cggcctatat cgccaacgac 360
gcgaccctct cgacgctgcc gcagctgatc ccgggcctcg tcatcgtctc ggacaagttg 420
aaccacgctt cgatgatcga gggcatccgc cgctcgggca ccgagaagca catcttcaag 480
cacaatgacc tcgacgacct gcgccggatc ctgacctcga tcggcaagga ccgtccgatc 540
ctcgtggcct tcgaatccgt ctattcgatg gatggcgact tcggccgcat cgaggagatc 600
tgcgacatcg ccgacgagtt cggcgcgctg aaatacatcg acgaggtcca tgccgtcggc 660
atgtacggcc cccgcggcgg cggcgtggcc gagcgggacg ggctgatgga ccggatcgac 720
atcatcaacg ggacgctggg caaggcctat ggcgtgttcg gcggctatat cgcggcctcg 780
tcaaagatgt gcgacgcggt gcgctcctac gcgccgggct tcatcttctc gacctcgctg 840
ccgcccgtcg tggcggccgg tgcggcggcc tcggtgcgcc acctcaaggg cgatgtggag 900
ctgcgcgaga agcaccagac ccaggcccgc atcctgaaga tgcgcctcaa ggggctcggc 960
ctgccgatca tcgaccacgg ctcgcacatc gtgccggtcc atgtgggcga ccccgtgcac 1020
tgcaagatga tctcggacat gctgctcgag catttcggca tctatgtcca gccgatcaac 1080
ttcccgaccg tgccgcgcgg gaccgagcgg ctgcgcttca ccccgtcgcc cgtgcatgat 1140
tccggcatga tcgatcacct cgtgaaggcc atggacgtgc tctggcagca ctgtgcgctg 1200
aatcgcgccg aggtcgttgc ctga 1224
<210> 2
<211> 888
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 2
atgcctggtt cattacgtaa aatgccggtc tggttaccaa tagtcatatt gctcgttgcc 60
atggcgtcta ttcagggtgg agcctcgtta gctaagtcac tttttcctct ggtgggcgca 120
ccgggtgtca ctgcgctgcg tctggcatta ggaacgctga tcctcatcgc gttctttaag 180
ccatggcgac tgcgctttgc caaagagcaa cggttaccgc tgttgtttta cggcgtttcg 240
ctgggtggga tgaattatct tttttatctt tctattcaga cagtaccgct gggtattgcg 300
gtggcgctgg agttcaccgg accactggcg gtggcgctgt tctcttctcg tcgcccggta 360
gatttcgtct gggttgtgct ggcggttctt ggtctgtggt tcctgctacc gctggggcaa 420
gacgtttccc atgtcgattt aaccggctgt gcgctggcac tgggggccgg ggcttgttgg 480
gctatttaca ttttaagtgg gcaacgcgca ggagcggaac atggccctgc gacggtggca 540
attggttcgt tgattgcagc gttaattttc gtgccaattg gagcgcttca ggctggtgaa 600
gcactctggc actggtcggt tattccattg ggtctggctg tcgctattct ctcgaccgct 660
ctgccttatt cgctggaaat gattgccctc acccgtttgc caacacggac atttggtacg 720
ctgatgagca tggaaccggc gctggctgcc gtttccggga tgattttcct cggagaaaca 780
ctgacaccca tacagctact ggcgctcggc gctatcatcg ccgcttcaat ggggtctacg 840
ctgacagtac gcaaagagag caaaataaaa gaattagaca ttaattaa 888
Claims (6)
1.一种添加维生素B6提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将保藏状态的发酵工程菌活化后，转接至备好的摇瓶发酵培养基中，并于温度为37℃的条件下培养12h，得到发酵种子；其中，所述发酵工程菌以大肠杆菌E.coliMG1655为宿主，以pTrc-99a为载体过量表达来自类球红细菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因hemA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示和外向转运蛋白基因rhtA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)备好发酵培养基，往其中添加维生素B6和氨苄青霉素并搅匀，直至所述发酵培养基中维生素B6的终浓度为5-80mg/L、所述氨苄青霉素的终浓度为100mg/L；接着，将步骤(1)得到的发酵种子以1-5％的接种量接种于所述发酵培养基中，得到发酵物料；
(3)将上述得到的发酵物料置于温度为37℃、转速为220rpm的条件下进行发酵培养；发酵培养至3h时，往其中加入IPTG至所述发酵物料中IPTG的终浓度为0.05mM，并调节温度为30℃的条件进行诱导基因表达，继续发酵培养至24h时，停止发酵。
2.根据权利要求1所述的一种添加维生素B6提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述发酵培养基中维生素B6的终浓度为10-40mg/L。
3.根据权利要求1所述的一种添加维生素B6提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述发酵培养基中维生素B6的终浓度为20mg/L。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种添加维生素B6提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，步骤(1)中所述发酵工程菌的构建方法如下：
I.合成hemA基因片段后，在其5'端和3'端分别引入EcoR I和Kpn I酶切位点，得到第一目的片段；将第一目的片段和pTrc-99a载体分别用EcoR I和Kpn I进行酶切处理，回收酶切产物并纯化，将两者纯化后的酶切产物在DNA连接酶的作用下连接，连接条件为16℃、30min，得到第一连接产物；
II.将第一连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，涂布于含100ug/mL的氨苄青霉素LB固体平板，并于37℃的条件下倒置培养16-20h；挑取平板的单菌落接种于5mL含100ug/mL的氨苄青霉素的LB培养基，于37℃、220rpm的条件下过夜培养，再收集菌体并提取DNA质粒，经测序验证，插入hemA片段的质粒命名为pTrc-hemA质粒；
III.以E.coli MG1655的基因组序列为参照，设计引物F-rhtA：GCTCTAGACCGCCAGTTACAGTAGAAG，及R-rhtA：GCCAAGCTTATTCTTATTTATCTGCTCGC；以E.coliMG1655的基因组为模板扩增带有自身启动子的rhtA基因片段，并分别在5'端和3'端引入Xba I和Hind III酶切位点，使用高保真Taq酶进行PCR扩增，得到扩增产物；将扩增产物和pTrc-hemA质粒分别用Xba I和Hind III酶切，并回收酶切产物，将两者纯化后的酶切产物在DNA连接酶的作用下连接，连接条件为16℃、30min，得到第二连接产物；
IV.将第二连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含100ug/mL的氨苄青霉素LB固体平板，于37℃的条件下倒置培养16-20h；挑取平板的单菌落接种于5mL含100ug/mL的氨苄青霉素的LB培养基，并于37℃、220rpm的条件过夜培养后，收集菌体并提取DNA质粒；经测序验证，插入rhtA片段的质粒命名为pTrc-hemA-rhtA质粒；再将pTrc-hemA-rhtA质粒转化E.coli MG1655感受态细胞，转化产物涂布于含100ug/mL的氨苄青霉素LB固体平板，于37℃的条件倒置培养16-20h后；挑取平板的单菌落接种于5mL含100ug/mL的氨苄青霉素的LB培养基，并于37℃、220rpm的条件下过夜培养，再收集菌体并提取DNA质粒；经测序验证正确的菌株命名为E.coli MG1655/pTrc-hemA-rhtA，即为发酵工程菌。
5.根据权利要求4所述的一种添加维生素B6提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，所述发酵工程菌的构建方法中，步骤III所述PCR扩增的参数为：98℃预变性30s；98℃变性10s；55℃退火5s；72℃延伸30s，循环30次；72℃延伸3min。
6.根据权利要求1-3任一项所述的一种添加维生素B6提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，步骤(1)中所述活化的方法为：将甘油管中的发酵工程菌划线接种到LB固体培养，并于37℃的条件下倒置培养16-20h。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111407948.5A CN114134184B (zh) | 2021-11-25 | 2021-11-25 | 一种添加维生素b6提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111407948.5A CN114134184B (zh) | 2021-11-25 | 2021-11-25 | 一种添加维生素b6提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114134184A CN114134184A (zh) | 2022-03-04 |
| CN114134184B true CN114134184B (zh) | 2023-11-28 |
Family
ID=80391450
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111407948.5A Active CN114134184B (zh) | 2021-11-25 | 2021-11-25 | 一种添加维生素b6提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114134184B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102206606A (zh) * | 2011-03-31 | 2011-10-05 | 山东大学 | 一株重组大肠杆菌及其在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用 |
| CN104561158A (zh) * | 2015-01-13 | 2015-04-29 | 江南大学 | 一种添加Fe2+提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法 |
| CN109879775A (zh) * | 2019-04-01 | 2019-06-14 | 苏州纳美特生物科技有限公司 | 一种5-氨基乙酰丙酸盐酸盐中间体的环保制备方法 |
| CN110004164A (zh) * | 2019-03-28 | 2019-07-12 | 四川师范大学 | 一种5-氨基乙酰丙酸高产重组菌株及其用途 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103981203B (zh) * | 2013-02-07 | 2018-01-12 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 5‑氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法和应用 |
-
2021
- 2021-11-25 CN CN202111407948.5A patent/CN114134184B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102206606A (zh) * | 2011-03-31 | 2011-10-05 | 山东大学 | 一株重组大肠杆菌及其在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用 |
| CN104561158A (zh) * | 2015-01-13 | 2015-04-29 | 江南大学 | 一种添加Fe2+提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法 |
| CN110004164A (zh) * | 2019-03-28 | 2019-07-12 | 四川师范大学 | 一种5-氨基乙酰丙酸高产重组菌株及其用途 |
| CN109879775A (zh) * | 2019-04-01 | 2019-06-14 | 苏州纳美特生物科技有限公司 | 一种5-氨基乙酰丙酸盐酸盐中间体的环保制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ·Nutritional Factors That Affect the Formation of 5-Aminolevulinic Acid, a Key Intermediate of Heme Biosynthesis;Yukiko IMI;Journal of Nutritional Science and vitaminology;第67卷(第5期);339-350 * |
| A New Strategy for Production of 5-Aminolevulinic Acid in Recombinant Corynebacterium glutamicum with High Yield;Peng Yang;Applied and Environmental Microbiology;第82卷(第9期);2709-2717 * |
| 大肠杆菌产5-氨基乙酰丙酸(ALA)条件优化;宫恺;中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑(第2期);B018-90 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114134184A (zh) | 2022-03-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107916283B (zh) | 一种烟酰胺的生产工艺 | |
| CN105368766B (zh) | 一株生产戊二胺的基因工程菌及其制备戊二胺的方法 | |
| CN106566795A (zh) | 用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒dna的培养基及培养方法 | |
| CN108277190A (zh) | 一种全细胞转化苯丙氨酸生产苯乳酸的方法 | |
| CN112779175A (zh) | 一种制备人工熊胆粉的工程酿酒酵母及方法 | |
| CN104195190A (zh) | 一种利用重组大肠杆菌厌氧生产5-氨基乙酰丙酸的方法 | |
| CN110229774B (zh) | 一种精氨酸脱羧酶基因工程菌及其高密度发酵培养方法 | |
| CN113073074B (zh) | 一种高效合成核黄素的基因工程菌及其应用 | |
| CN101712944B (zh) | 一株枯草芽孢杆菌及其在生物催化生产烟酰胺中的应用 | |
| CN116333948B (zh) | 一种食气梭菌增菌培养基及其制备方法 | |
| CN114134184B (zh) | 一种添加维生素b6提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法 | |
| CN112980758A (zh) | 一种提高谷氨酸棒杆菌合成5-氨基乙酰丙酸产量的方法 | |
| CN105255934A (zh) | 一种高效联产α-氨基丁酸及葡萄糖酸的策略 | |
| CN1757737A (zh) | 一种生产l－苯丙氨酸基因工程菌及构建方法和其应用 | |
| CN104593306A (zh) | 一种大肠埃希氏菌株hy-05c高密度培养方法 | |
| CN114921502A (zh) | 一种基于微生物生理参数进行反馈调控氮源流加的戊二酸生产方法 | |
| CN110452838B (zh) | 一种crm197菌种培养基、配制方法及发酵培养方法 | |
| CN1148454C (zh) | 采用重组大肠杆菌生产手性β-(R)-羟基丁酸的方法 | |
| CN110004164B (zh) | 一种5-氨基乙酰丙酸高产重组菌株及其用途 | |
| CN114250207B (zh) | 一种高活性的蔗糖磷酸化酶及应用 | |
| CN114231509B (zh) | 一种蔗糖磷酸化酶及葡萄糖基甘油生产工艺 | |
| CN114395542B (zh) | 一种蔗糖磷酸化酶及其应用 | |
| CN114058610B (zh) | 一种高活性的蔗糖异构酶及其应用 | |
| CN105861596B (zh) | 透明质酸的制备方法 | |
| CN114574534B (zh) | 一种基于离子液体的生物催化体系生产α-熊果苷的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |