CN1148454C - 采用重组大肠杆菌生产手性β-(R)-羟基丁酸的方法 - Google Patents
采用重组大肠杆菌生产手性β-(R)-羟基丁酸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于工业微生物，发酵工程技术领域。包括以下步骤：(1)将合成聚-β-(R)-羟基丁酸(PHB)的前体基因phbA和phbB克隆到质粒载体中构建出重组质粒；(2)将含phbA和phbB基因的重组质粒转到大肠杆菌中获得重组大肠杆菌；(3)对该重组大肠杆菌发酵获取β-(R)-羟基丁酸。本发明生产工艺简单，容易操作，开创了一种新型生物法生产β-(R)-羟基丁酸的道路。
Description
技术领域 本发明属于工业微生物，发酵工程技术领域，特别涉及一种采用生物发酵法直接生产β-(R)-羟基丁酸的方法。
背景技术 β-(R)-羟基丁酸可用化学合成并拆分或降解聚-β-(R)-羟基丁酸(PHB)得到。这两种方法工艺复杂，生产成本较高。
β-(R)-羟基丁酸含有一个手性中心及两个容易被修饰的功能基团(-OH和-COOH)，可以作为手性源来进行精细合成，如合成抗生素、维生素、芳香化合物、生物信息素等(Seebach.1986；Seebach和Zuger，1982)。目前较多的研究集中于短链羟基脂肪酸，特别是β-(R))-羟基丁酸及其衍生物。
β-(R)-羟基丁酸的主要用途是作为药物合成途径中的手性中间体。它可用于多种药物的合成，如氟西汀，卡尼丁(胥波和程国侯，2000)，碳青霉烯(刘浚等，1997)，另外它还能很方便的转化为另一种有用的中间体R-1，3-丁二醇(Matsuyamav等，2001)。表1列出了可用β-(R)-羟基丁酸作为合成中间体的部分药物(芮耀诚，1999)。
表1以β-(R)-羟基丁酸为合成中间体的部分药物
| 中文名 | 英文名 | 用途 |
| 氟西汀 | Fluoxetine | 选择性抑制5羟色胺自突触前膜再摄取。用于治疗抑郁症，综合症，睡眠障碍，神经性贪食和肥胖症。 |
| 碳青霉烯 | Carapenem | 抑制细菌细胞壁的形成，迅速杀灭细菌。结构与青霉素类似，但对酶的稳定性和抗菌谱相去甚远，为一类新的抗生素，其疗效卓越，但价格昂贵。 |
| 卡尼丁 | Carnitine chloride | 促进人体消化液的分泌，增强消化酶的活性。并有调整胃肠功能的作用。参与脂肪代谢。用于胃酸缺乏症，消化不良，食欲减退。对高血脂症也有一定疗效。 |
常规生产β-(R)羟基丁酸的方法是化学合成(Fishman和Eroshov，2001)，合成法生产单一手性的β-(R)-羟基丁酸其难点在于手性对映体的分离，还需要昂贵的手性催化剂。不仅工艺复杂而且不经济。另外还有一些其它的方法，如微生物手性氧化1，3二丁醇法(Hasegawa等，1982)，微生物和酶还原烷基3酮丁酸法(Mochizuki等，1994；Kawai等，1994)，微生物烯酰基-CoA水合酶转化异丁酸法(孙万儒，1995)。使用这些方法生产β-(R)-羟基丁酸不仅产物光学纯度低，而且还需要使用大量溶剂致使产物浓度降低，同时还需要使用大量的酶。这些都对生产很不利。
另一种生产手性β-(R)羟基丁酸的方法为聚合物降解。聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一种自然界中普遍存在的生物聚合物，微生物常将其作为一种能源和碳源的贮藏物储存于胞内(Anderson和Dawes，1990；Dowes和Senior，1973)。由于PHA合成微生物可以将带官能团的羟基脂肪酸插入到PHA中，因此可以利用这些微生物通过设计培养基的底物来设计所需要的手性分子。到1998年已经有125中PHA被报道并还不断增加(Rehm和Steinbüchel，1999；Chen等，2000a和b)。聚合物的降解包括微生物降解和化学降解。Lee等作出了很多有关β-(R)-羟基丁酸单体生产的研究，利用微生物积累PHA，然后采用酶解胞内PHA的方法(Lee等，1999)和PHA醇解的方法(Lee等，2000)来生产β-(R)-羟基丁酸，他们的工作为β-(R)-羟基丁酸获取开辟了新的途径。
化学工业一直是产生“废气、废水、废渣”的“三废”大户。虽然采用了许多新的生产技术，但生产工艺复杂，产品收率低，所使用的原材料中有很多是有毒有害或易燃易爆的物质，而且反应也常在高温高压的条件下进行，这些特点决定了化工行业是一个高污染，高能耗的行业。
由于纯光学活性药物降低了药物对人体的毒害，提高了疗效，病人乐意接受，从而提高了市场需求率。这也是制药公司热衷于开发手性药物的原因。正因为如此，近几年单一异构体药物数量的年增长率已经超过20％，有人预测，到2005年全球约有60％的上市新药为光学纯药物(蒋光主，1997)。传统的化工生产制备单一手性分子的方法不外忽两种1.不对称合成，2.拆分消旋体，不仅工艺复杂，成本较高，而且往往涉及一些毒性物质，存在着化学工业难以避免的弊端。
如前文所述，β-(R)-羟基丁酸具有许多的生理功能和医疗价值(Van Hove等，2001；Kashiwaya等，2002a；Kashiwaya等，200b)，以及可以作为中间体合成新的手性化合物。毫无疑问，通过生物技术合成β-(R)-羟基丁酸比化学合成具有许多优点，但从报道来看仅为Lee(1999；2000)等不多的研究者在进行这样的工作。本发明通过基因工程手段，以葡萄糖为出发原料利用重组微生物直接合成β-(R)-羟基丁酸，避免了化工合成的对环境的污染，同时为手性药物的开发提供有益的参考。
发明内容 本发明的目的在于为克服已有技术的不足之处提出采用重组大肠杆菌生产手性β-(R)-羟基丁酸的方法，通过构建带有phbA和phbB基因的质粒并用此质粒转化得到重组大肠杆菌，用该大肠杆菌进行发酵得到β-(R)-羟基丁酸。具有生产工艺简化，生产污染低，产品成本低的优点。
本发明提出一种生产β-(R)-羟基丁酸的方法，由构建的带有phbA和phbB基因的质粒并用此质粒转化得到重组大肠杆菌和发酵该重组大肠杆菌生产β-(R)-羟基丁酸组成，其特征在于所说的发酵过程包括：(1)将基因phbA和phbB克隆到质粒中构建出新质粒。(2)将构建质粒转到大肠杆菌中。(3)发酵该重组大肠杆菌获取β-(R)-羟基丁酸。
本发明方法所说的质粒构建与传统的质粒构建方法相同，包括：将含基因phbA和phbB的DNA片段和所用的质粒进行相关酶切；利用连接酶进行连接；利用常规转化手段进行质粒转化及筛选。筛选出的含连接好的质粒的菌株即为所需发酵用的菌株。
本发明所用的发酵方法为常规的工业发酵方法，均可采用传统微生物发酵的工艺设备。
本发明利用的是基因重组大肠杆菌直接发酵生产β-(R)-羟基丁酸，简化了传统化学合成对设备的复杂要求和工艺流程的繁琐。省去了手性分离的复杂过程，并降低了由于化学合成和手性分离带来的环境损害。并可能实现生产成本降低。
具体实施方式 实施例：用重组大肠杆菌发酵生产β-(R)-羟基丁酸
菌种：大肠杆菌E.coli HB101
基因来源：phbA和phbB来自菌种Ralstonia eutropha的基因组，基因片段连接在质粒pBHR68上。
(1)质粒构建：用限制性内切酶Pst I酶切质粒pBHR68得到基因phbB和phbA。并将其插入到质粒pUC18的Pst I酶切位点。所得到的质粒pUCAB含有位于启动子lac下游的基因phbB和phbA。
(2)质粒转化：用电转化将质粒转到菌株E.coli HB101中。筛选出的含连接好的质粒的菌株即为所需发酵用的重组大肠杆菌菌株。
(3)发酵培养：利用所得的基因重组菌发酵培养36-48小时后离心(4000g)得上清液，浓缩干燥后以气相色谱检测β-(R)-羟基丁酸，产量为1.2g/l。
培养基为：0.5g/L硫酸铵，0.2g/L硫酸镁，9.65g/L十二水磷酸氢二钠，2.65g/L磷酸二氢钾，60mg/L氨卞青霉素，50g/L葡萄糖和1ml/L微量元素。总体积约3L。
微量元素的配制：1升1mol/L盐酸中(g)：20六水氯化铁，10氯化钙，0.03五水硫酸铜，0.05四水氯化锰，0.1七水硫酸锌，pH6.8。
Claims (1)
1、一种采用重组大肠杆菌生产手性β-(R)-羟基丁酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将合成聚-β-(R)-羟基丁酸(PHB)的前体基因phbA和phbB克隆到质粒载体中构建出重组质粒；
(2)将将含phbA和phbB基因的重组质粒转到大肠杆菌中获得重组大肠杆菌；
(3)对该重组大肠杆菌发酵获取β-(R)-羟基丁酸。
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