CN1900302A - 阿斯巴甜生物合成的方法 - Google Patents

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梁智群
吴满刚
陈桂光
张云开
黄时海
李楠
陈山岭
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Abstract

本发明是在生物法合成阿斯巴甜的基础上，采用一步酶法合成阿斯巴甜的工艺，具体方法是用菌株发酵得到酶，再以天冬氨酸、苯丙氨酸和甲醇为底物直接合成阿斯巴甜。本发明反应过程无需用化学法进行苯丙氨酸的甲酯化，无需天冬氨酸的氨基保护，使得苯丙氨酸甲酯化、二肽的合成在微生物酶的作用下一步合成，减少了反应步骤，简化了生产工艺，降低了生产成本。

Description

阿斯巴甜生物合成的方法
技术领域
本发明涉及一种甜味剂的合成方法，特别是阿斯巴甜生物合成的一种新方法。
背景技术
阿斯巴甜是一种新型高效的甜味剂，其甜度约为蔗糖的200倍，热量仅为蔗糖的1/200。常食不产生龋齿，不影响血糖，不引起肥胖、高血压、冠心病。联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)对其的评价为安全可靠，并被联合国食品添加剂联席委员会(JECFA)确定为国际A(I)级甜味剂。目前该甜味剂已在130多个国家和地区获准使用，广泛用于9000多种饮料、食品及医药等产品中。至今自然界中尚未发现天然的阿斯巴甜，其生产均采用人工合成法，合成方法大体可分为两种：化学合成法和生物合成法。目前阿斯巴甜的工业化生产国内外大部分是通过化学法合成的。它是以L-天门冬氨酸与L-苯丙氨酸为主要原料，通过氨基保护、内酐、缩合、水解、酯化、中和等反应步骤来合成。而各种化学合成法区别在于：L-天门冬氨酸中氨基的保护基团不同；甲酯化次序不同等。化学合成法反应步骤多、产率低、反应选择性差、产物需要多步分离等不足；因此，生物酶法合成相对化学合成法专一性强、反应转化率高、条件温和而成为一些科研工作者研究的重点，特别是通过一步酶法以天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯为反应底物通过菌种筛选直接合成阿斯巴甜的研究已被许多科研工作者所注意。
经过检索，我们查到公开文献有关合成阿斯巴甜的报道如下：
1、【题名】阿斯巴甜的生物合成【作者】林应锐【刊名】微生物学通报。1992，19(4).-226-229【文摘】通常化学合成包括五步。1.将天冬氨酸的氨基保护起来，并制成酸酐。2，苯丙氨酸酯化成苯丙氨酸甲酯。3.将带保护基的天冬氨酸酐和苯丙氨酸甲酯缩合成带保护基的阿斯巴甜(无甜昧)。4.脱除保护基制得阿斯巴甜的盐。5，中和析出阿斯巴甜除去-APM杂质。目前文献介绍有少量非合成肽键的酶反应研究工作。如利用枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin)，有选择的只催化酯化天冬氨酰苯丙氨酸中苯丙氨酸上的羧基成为甲酯，生成阿斯巴甜。在有机溶剂中能起作用的脂肪酶(lipase)，能专一地水解除去阿斯巴甜甲酯(即MAPM)上天冬氨酸羧端上的甲酯基，使其成为阿斯巴甜(APM)。青霉素酰化酶(Penicillin acylase)可水解除去苯乙酰基阿斯巴甜上的苯乙酰基。
2、【题名】阿斯巴甜合成的研究【作者】冯海峰 钟洁明【机构】郑州粮食学院食品工程系【刊名】郑州粮食学院学报。1998，19(2).-15-23【文摘】研究了以L-天门冬氨酸和L-苯丙氨酸为主要原料，合成低热卡高甜度营养型甜味剂阿斯甜的生产工艺，通过正交试验的方法探讨了反应物量、温度、PH值、反应时间等诸因素对合成中各步骤结果的影响。从而了合成各步骤结果的影响，从而确立了合成阿斯巴甜的最佳工艺流程和最佳生产工艺条件。
3、【题名】L-苯丙氨酸高速高效制造法【作者】陈曾三【机构】中国食协发酵工程研究会，【刊名】发酵科技通讯。2001，30(2).-44-48【文摘】L-苯丙氨酸是一种必须氨基酸，在营养和医疗上都有重要利用价值，而且是人工甜味剂α-L-天门冬酰胺-L-苯丙氨酸甲酯(阿斯巴甜，比蔗糖甜100-200倍)，近年来其市场优势越来越受到国内外重视，对其研究开发也不断进展而获得不少有意义的成果。
4、【题名】苯丙氨酸的应用与生产【作者】方岩雄 张维刚等【机构】广东工业大学轻工化工学院，【刊名】广州化工。2000，28(4).-134-135，111【文摘】综述了苯丙氨酸的性质及应用。苯丙氨酸既可以直接用作医药产品、食品添加剂和饮料添加剂，又可以作制备抗癌药物的中间体和阿斯巴甜的原料，其市场需求量逐年增加。还综述了15种生产方法的特点，指出苯胺路线是一种植得发展的合成路线。
5、中国专利【名称】阿斯巴甜的制备方法【申请(专利)号】200410065783.8【申请(专利权)人】常州市牛塘化工厂【地址】213163江苏省常州市武进区牛塘镇延政路51号【摘要】本发明涉及化学合成法制备阿斯巴甜。采用硫酰化剂作为保护剂，对L-天门冬氨酸的氨基和α-羧基进行保护和活化，制得L-天门冬氨酸的酰化物，然后加入成环试剂发生成环反应生成环合物，环合物再经过缩合而得到阿斯巴甜产品。其中，硫酰化剂与L-天门冬氨酸反应生成酰化物过程中选择性高，副反应少，得到的酰化物反应较为彻底、杂质含量少；酰化、成环、缩合三步主要反应都属于均相反应过程，且在低温下进行，易于操作控制，反应后的产物易于分离、提纯；可以用甲醇、醋酸乙酯等常规有机物作为反应溶剂，加工成本低，对环境的污染相对较小，后处理及回用较为方便；制得的阿斯巴甜产品纯度高、收率高。
上述公开文献报道的阿斯巴甜的合成方法是通过以天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯为反应底物
有的比较复杂，生产成本较高，有的阿斯巴甜实验室结果还可以，但扩大生产后工艺参数不稳定，得率不高。
发明内容
本发明人经过研究和探索，找到了一种新的合成阿斯巴甜的方法。这就是采用一步酶法，由天冬氨酸、苯丙氨酸和甲醇三种物质次序发生反应直接合成阿斯巴甜。以往的合成法是以天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯为反应底物。本方法无需天冬氨酸的氨基保护，也无需事先用化学法或其他方法将苯丙氨酸转化为苯丙氨酸甲酯，而且减少了反应步骤，简化了生产工艺，降低了生产成本。
本发明是指在微生物酶的作用下，由天冬氨酸、苯丙氨酸和甲醇直接合成阿斯巴甜。
本发明是这样实现的：先将所筛选的菌株在培养基中进行发酵产酶，再将所产酶液与天冬氨酸、苯丙氨酸和甲醇的混合液进行酶促反应。天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇在20～65℃、pH值为2.5～9.5的条件下直接合成阿斯巴甜，酶促反应的时间为2～24小时，其中天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇每种物质的重量按分子量计算出具体含量。
上面所述的菌株有：犁头霉菌(Absidia spp)、裂褶菌(Schizophyllum commune Fr.)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、短小杆菌(Bacilluspumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和毕赤酵母(P.pastoris)，可以从微生物中心购买，也可以自己培养。
上面所述的菌种培养基为麸皮、玉米粉、淀粉、蛋白胨、豆饼粉、葡萄糖、麦芽糖、土豆汁的其中之一或者它们的混合物。具体是：菌种培养基(重量百分含量)为麸皮、玉米粉、淀粉、蛋白胨或豆饼粉，5～40％，蔗糖、葡萄糖、麦芽糖或土豆汁2～30％，KH2PO4 0.05％～1.00％，MgSO4 0.01％～0.7％，FeCl3 0.0005％～0.005％，酵母膏(粉)0.01％～1.5％，(NH4)2SO40.01％～1.2％。菌株在培养基中发酵的条件是：温度25～45℃，压力0.03～0.12Mpa，风量1∶0.1～1∶1，PH5.5～9.5，转速250～550r.p.m，培养时间2～4天。合成阿斯巴甜合成的反应条件为：温度20～65℃，pH值为2.5～9.5，反应时间为2～24小时。
本发明与现有技术区别之处是反应时将天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇三种物质一起混合在酶液中，在微生物酶的作用下合成阿斯巴甜的，本发明无需天冬氨酸的氨基保护，使得苯丙氨酸甲酯化、二肽的合成次序进行，减少了反应步骤，简化了生产工艺，降低了生产成本。
本发明与现有技术相比，其实质性特点和进步之处在于：
①反应过程无需用化学法进行苯丙氨酸的甲酯化，只需要苯丙氨酸和甲醇与天冬氨酸进行反应，直接由微生物酶体系催化合成阿斯巴甜，简化了生产工艺，降低了生产成本。
②反应的选择性较高，几乎不产生阿斯巴甜的β-异构体，简化了下游的分离纯化步骤，减少了其分离纯化费用。
③采用的是一步酶法合成阿斯巴甜，与以往的化学合成法相比，它无需天冬氨酸的氨基保护，天冬氨酸无需以内酐或内酯的形式进行反应，减少了反应步骤，简化了生产工艺。
具体实施方式
实施实例一：
菌种发酵培养基(重量百分含量)为麸皮、玉米粉、淀粉、蛋白胨或豆饼粉：5～40％，蔗糖、葡萄糖、麦芽糖或土豆汁2～30％，KH2PO4 0.05％～1.00％，MgSO4 0.01％～0.7％，FeCl30.0005％～0.005％，酵母膏(粉)0.01％～1.5％，(NH4)2SO4 0.01％～1.2％。犁头霉菌(Absidia spp)菌株在培养基中发酵的条件是：温度25～45℃，压力0.03～0.12Mpa，风量1∶0.1～1∶1，PH5.5～9.5，转速250～550r.p.m，培养时间2～4天。将上述发酵得到的酶液与天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的混合液体积比设定为1∶1，在20～65℃、pH值为2.5～9.5的条件下合成阿斯巴甜，酶促反应的时间为2～24小时，其中天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的每种物质重量按分子量计算出具体含量，
实施实例二：
菌种发酵培养基(重量百分含量)为麸皮、玉米粉、淀粉、蛋白胨或豆饼粉：5～40％，蔗糖、葡萄糖、麦芽糖或土豆汁2～30％，KH2PO4 0.05％～1.00％，MgSO4 0.01％～0.7％，FeCl30.0005％～0.005％，酵母膏(粉)0.01％～1.5％，(NH4)2SO4 0.01％～1.2％。裂褶菌(Schizophyllumcommune Fr.)菌株在培养基中发酵的条件是：温度25～45℃，压力0.03～0.12Mpa，风量1∶0.1～1∶1，PH5.5～9.5，转速250～550r.p.m，培养时间2～4天。将上述发酵得到的酶液与天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的混合液体积比设定为1∶1，在20～65℃、pH值为2.5～9.5的条件下合成阿斯巴甜，酶促反应的时间为2～24小时，其中天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的每种物质重量按分子量计算出具体含量，
实施实例三：
菌种发酵培养基(重量百分含量)为麸皮、玉米粉、淀粉、蛋白胨或豆饼粉：5～40％，蔗糖、葡萄糖、麦芽糖或土豆汁2～30％，KH2PO4 0.05％～1.00％，MgSO4 0.01％～0.7％，FeCl30.0005％～0.005％，酵母膏(粉)0.01％～1.5％，(NH4)2SO4 0.01％～1.2％。铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株在培养基中发酵的条件是：温度25～45℃，压力0.03～0.12Mpa，风量1∶0.1～1∶1，PH5.5～9.5，转速250～550r.p.m，培养时间2～4天。将上述发酵得到的酶液与天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的混合液体积比设定为1∶1，在20～65℃、pH值为2.5～9.5的条件下合成阿斯巴甜，酶促反应的时间为2～24小时，其中天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的每种物质重量按分子量计算出具体含量，
实施实例四：
菌种发酵培养基(重量百分含量)为麸皮、玉米粉、淀粉、蛋白胨或豆饼粉：5～40％，蔗糖、葡萄糖、麦芽糖或土豆汁2～30％，KH2PO4 0.05％～1.00％，MgSO4 0.01％～0.7％，FeCl30.0005％～0.005％，酵母膏(粉)0.01％～1.5％，(NH4)2SO4 0.01％～1.2％。短小杆菌(Bacilluspumilus)菌株在培养基中发酵的条件是：温度25～45℃，压力0.03～0.12Mpa，风量1∶0.1～1∶1，PH5.5～9.5，转速250～550r.p.m，培养时间2～4天。将上述发酵得到的酶液与天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的混合液体积比设定为1∶1，在20～65℃、pH值为2.5～9.5的条件下合成阿斯巴甜，酶促反应的时间为2～24小时，其中天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的每种物质重量按分子量计算出具体含量，
实施实例五：
菌种发酵培养基(重量百分含量)为麸皮、玉米粉、淀粉、蛋白胨或豆饼粉：5～40％，蔗糖、葡萄糖、麦芽糖或土豆汁2～30％，KH2PO4 0.05％～1.00％，MgSO4 0.01％～0.7％，FeCl30.0005％～0.005％，酵母膏(粉)0.01％～1.5％，(NH4)2SO4 0.01％～1.2％。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株在培养基中发酵的条件是：温度25～45℃，压力0.03～0.12Mpa，风量1∶0.1～1∶1，PH5.5～9.5，转速250～550r.p.m，培养时间2～4天。将上述发酵得到的酶液与天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的混合液体积比设定为1∶1，在20～65℃、pH值为2.5～9.5的条件下合成阿斯巴甜，酶促反应的时间为2～24小时，其中天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的每种物质重量按分子量计算出具体含量，
实施实例六：
菌种发酵培养基(重量百分含量)为麸皮、玉米粉、淀粉、蛋白胨或豆饼粉：5～40％，蔗糖、葡萄糖、麦芽糖或土豆汁2～30％，KH2PO4 0.05％～1.00％，MgSO4 0.01％～0.7％，FeCl30.0005％～0.005％，酵母膏(粉)0.01％～1.5％，(NH4)2SO4 0.01％～1.2％。毕赤酵母(P.pastoris)菌株在培养基中发酵的条件是：温度25～45℃，压力0.03～0.12Mpa，风量1∶0.1～1∶1，PH5.5～9.5，转速250～550r.p.m，培养时间2～4天。将上述发酵得到的酶液与天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的混合液体积比设定为1∶1，在20～65℃、pH值为2.5～9.5的条件下合成阿斯巴甜，酶促反应的时间为2～24小时，其中天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的每种物质重量按分子量计算出具体含量。

Claims (3)

1、一种阿斯巴甜生物合成的方法，其特征在于：微生物发酵所得到的发酵液以天冬氨酸、苯丙氨酸和甲醇为底物直接合成阿斯巴甜，具体工艺是：先将所筛选微生物菌株在培养基中进行发酵产酶，再将所产酶液与天冬氨酸、苯丙氨酸和甲醇的混合液进行酶促反应，天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇在20～65℃、pH值为2.5～9.5的条件下直接合成阿斯巴甜，酶促反应的时间为2～24小时，其中天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇每种物质的重量按分子量计算出具体含量；
所述的产生发酵酶液的微生物是犁头霉菌(Absidia spp)、裂褶菌(Schizophyllumcommune Fr.)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、短小杆菌(Bacilluspumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、毕赤酵母(P.pastoris)。
2、根据权利要求1所述的阿斯巴甜生物合成的方法，其特征在于：所述的菌种培养基为麸皮、玉米粉、淀粉、蛋白胨、豆饼粉、葡萄糖、麦芽糖、土豆汁的其中之一或者它们的混合物，具体的成分和重量百分含量是：菌种培养基为麸皮、玉米粉、淀粉、蛋白胨或豆饼粉：5～40％，蔗糖、葡萄糖、麦芽糖或土豆汁2～30％，KH2PO4 0.05％～1.00％，MgSO4 0.01％～0.7％，FeCl3 0.0005％～0.005％，酵母膏或酵母粉0.01％～1.5％，(NH4)2SO4 0.01％～1.2％。
3、根据权利要求1所述的阿斯巴甜生物合成的方法，其特征在于：菌株在培养基中发酵的条件是：温度25～45℃，压力0.03～0.12Mpa，风量1∶0.1～1∶1，PH5.5～7.5，转速250～550r.p.m，培养时间2～4天；合成阿斯巴甜合成的反应条件为：温度20～65℃，pH值为2.5～9.5，反应时间为2～24小时。
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