CN101555505B - 门多萨假单胞菌nk-01用于生产褐藻寡糖的用途和方法 - Google Patents
门多萨假单胞菌nk-01用于生产褐藻寡糖的用途和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了门多萨假单胞菌NK-01用于生产褐藻寡糖的用途和方法。该方法包括以下步骤：首先将该菌在含有5ml LB培养基的L管中进行活化培养，然后将活化的菌种接种到发酵培养基上培养，发酵结束以后离心除去菌体，上清液用3倍体积的无水乙醇沉淀，去上清后沉淀用水溶解，然后用定性滤纸过滤，之后滤液进行冷冻干燥，得产物褐藻寡糖。它可以广泛应用于食品、制药、化工等多个领域。本方法克服了通常制备褐藻寡糖所用化学法需要多重基团保护和去保护步骤、操作复杂及酶法易失活、价格昂贵的缺点。利用本发明的生产方法，工艺简单，发酵周期短，而且发酵条件和过程使其大规模工业化生产成为可能。
Description
技术领域
本发明涉及门多萨假单胞菌用于生产多糖类生物降解高分子，特别是利用门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)NK-01CCTCC M 208005(简称门多萨假单胞菌NK-01)生产褐藻寡糖的用途和方法。
背景技术
褐藻寡糖是褐藻多糖的寡聚物，是聚合度小于20的褐藻多糖。褐藻多糖是由海藻和细菌合成的一种多糖，在海藻中褐藻多糖主要起骨架作用，而在细菌中的褐藻多糖是细胞壁的一种成分，阻止抗生素进入细胞内，有的细菌则将合成的褐藻多糖分泌到细胞外。海藻酸钠或褐藻酸钠是由褐藻多糖链上糖醛酸的羧基氢被钠取代的产物，它们又名藻酸盐。
来自海藻的褐藻多糖是由β-D甘露糖醛酸、α-L-古洛糖醛酸通过β-(1→4)/α-(1→4)键连接而成的无支化线性多糖。其中β-D甘露糖醛酸中的C5被差向异构化即是α-L-古洛糖醛酸。褐藻多糖中有三种类型的链段(Block structure)，其一是完全由β-D甘露糖醛酸按照β-(1→4)键结合的M-M型；其二是完全由α-L-古洛糖醛酸按α-(1→4)键结合的G-G型；其三是由β-D甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸混合交替结合的M-G型。来自细菌的褐藻多糖和来自海藻的褐藻多糖具有相同的基本结构，差别仅在于细菌褐藻多糖中C2和/或C3羟基常常不同程度地被乙酰化，乙酰化程度因菌株及生长条件的不同而有明显的不同。而褐藻寡糖和褐藻多糖的区别在于，褐藻寡糖是聚合度小于20的褐藻多糖。
褐藻寡糖产物有诸多用途。例如，有报道称，饲料中添加少量褐藻寡糖，能改变动物消化道微生物菌相，提高动物日增重，提高饲料吸收利用率，降低消化道和畜产品中大肠杆菌、沙门氏菌等病原菌数。另有报道，褐藻寡糖还具有促进植物生长作用。据报道寡糖能够诱导植物抗病性，提高植物抗逆能力及调节植物生长从而对改进作物的品质，在增加作物的产量方面具有重要意义。因此，褐藻寡糖可以广泛应用于食品、制药、化工等多个领域，具有广阔的开发前景。
化学合成法主要缺点是需要多重基团保护和去保护步骤，产量低，大量合成复杂的化合物不能通过常规的化学法得到，因而没有实际的工业价值。用酶法制备褐藻寡糖，多是先分离纯化得到褐藻寡糖裂解酶后再制备褐藻寡糖系列产物，但酶的分离纯化比较繁琐，且在这一过程中酶也容易失活，酶法合成的价格也比较昂贵。本发明用微生物合成褐藻寡糖属液体发酵，工艺简单，发酵周期短，适合大规模工业化生产。
本发明用于生产褐藻寡糖的门多萨假单胞菌NK-01，自天津市西青区付村的大田土壤中分离得到，已于2008年1月7日保藏在中国典型培养物保藏中心(中国湖北武汉武昌珞珈山，武汉大学内)，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC M 208005。
该菌具有利用碳水化合物产酸的特性，可在Luria-Bertani(LB)(成分：10g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，5g/L氯化钠)培养基上生长，呈浅黄色，圆形菌落，边缘整齐，生长快。其16S rRNA基因的核苷酸序列长度为1454bp，在GenBank中的登录号为DQ641475。使用BLAST对NK-01菌株的16S rRNA基因和GenBank中已登录的细菌的16S rRNA基因做同源性比较，结果显示这个核苷酸序列与假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的多种细菌具有很高的同源性，且与已经报道的Pseudomonas mendocina ymp ctg68菌株的16S rRNA序列相似性最高。从GenBank里得到与门多萨假单胞菌NK-01菌株的16S rRNA基因序列相近的序列，利用DNA star软件与NK-01菌株的16S rRNA基因序列作比较后，建立了门多萨假单胞菌NK-01基于16S rRNA基因的系统进化树。
发明内容
本发明的目的是提供门多萨假单胞菌NK-01用于生产褐藻寡糖的用途以及提供利用上述门多萨假单胞菌NK-01低成本生产褐藻寡糖的方法。
为实现这一目的，本发明采用以下技术方案：利用门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)NK-01 CCTCC M 208005生产褐藻寡糖的方法，包括以下几个步骤：首先将该菌在含有5ml LB培养基的L管中进行活化培养，然后将活化的菌种接种到发酵培养基上培养，发酵结束以后离心除去菌体，上清液用3倍体积的无水乙醇沉淀，去上清后沉淀用水溶解，然后用定性滤纸过滤，之后滤液进行冷冻干燥，得产物褐藻寡糖。
本发明所述发酵培养基的碳源包括葡萄糖或糖蜜或它们的混合物；氮源包括氯化铵或硫酸铵或硝酸铵或三者的任意混合物；最适碳源浓度为5-10g/L，氮源浓度为0-1g/L；所述菌体培养和发酵培养的最适温度均为28-35℃；培养过程中的pH值为6.0-8.0；菌体活化培养时间为8-12h；发酵培养时间为36-72h；发酵后上清液用无水乙醇沉淀时间为12h以上。
与现有技术相比，本发明突出优点在于：避免化学法合成需要多重基团保护和去保护步骤，条件苛刻，操作复杂，产量低，反应速度慢的缺点；也克服了酶法合成中酶的分离纯化繁琐，酶容易失活，以及酶法合成成本高的缺点。利用本发明的生产方法，得到生物可降解高分子褐藻寡糖，工艺简单，发酵周期短，而且发酵条件和过程使其大规模工业化生产成为可能。
附图说明
图1是组成褐藻寡糖的六种单体结构。
下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明。
具体实施方式
在下面的实施例中，所用的菌种均为门多萨假单胞菌NK-01CCTCC M 208005，实施例中所用的磷酸盐缓冲液和不同培养基配方如下：
LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，5g/L氯化钠，pH为7.0。
培养基1：Na2HPO4 3.8g，KH2PO4 2.65g，MgSO4 0.2g，葡萄糖5g，NH4Cl 0.36g，微量元素液1ml/L(微量元素液：0.1MHCl 1000ml，CoCl2·6H2O 0.218g，CaCl2 7.8g，CrCl3·6H2O0.105g，NiCl2 0.118g，CuSO4·5H2O 0.156g，FeCl3 9.7g)，蒸馏水1000ml，调pH为7.0。
培养基2：Na2HPO4 3.8g，KH2PO4 2.65g，MgSO4 0.2g，葡萄糖5g，微量元素液1ml/L(微量元素液：0.1MHCl 1000ml，CoCl2·6H2O 0.218g，CaCl2 7.8g，CrCl3·6H2O 0.105g，NiCl20.118g，CuSO4·5H2O 0.156g，FeCl3 9.7g)，蒸馏水1000ml，调pH为7.0。
培养基3：Na2HPO4 3.8g，KH2PO4 2.65g，MgSO4 0.2g，糖蜜7g，NH4Cl 0.36g，微量元素液1ml/L(微量元素液：0.1MHCl 1000ml，CoCl2·6H2O 0.218g，CaCl2 7.8g，CrCl3·6H2O0.105g，NiCl2 0.118g，CuSO4·5H2O 0.156g，FeCl3 9.7g)，蒸馏水1000ml，调pH为6.0。
培养基4：Na2HPO4 3.8g，KH2PO4 2.65g，MgSO4 0.2g，糖蜜5g，葡萄糖2g，NH4Cl 0.36g，微量元素液1ml/L(微量元素液：0.1MHCl 1000ml，CoCl2·6H2O 0.218g，CaCl2 7.8g，CrCl3·6H2O0.105g，NiCl2 0.118g，CuSO4·5H2O 0.156g，FeCl3 9.7g)，蒸馏水1000ml，调pH为8.0。
磷酸盐缓冲液：Na2HPO4·12H2O 8.95g/L，KH2PO4 1.5g/L，pH为7.0。
实施例1、一步法发酵制备褐藻寡糖(低碳低氮条件下的发酵)
前培养是在L-试管中，以无菌操作加入5ml LB培养基，以无菌牙签接入NK-01菌株的单菌落，30℃120rpm培养12h。将前培养物0.5ml接种至含有100ml LB培养基的500ml三角瓶中，30℃150rpm震荡培养24h。4℃，6000g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，再次在4℃，6000g无菌离心12min，弃上清。将不含LB培养基的菌体无菌接入可控氧搅拌式1升发酵装置中，装置内含有1升培养基1(pH7)，30℃，通气培养48h。发酵结束后，离心除去菌体，然后用3倍体积的无水乙醇沉淀过夜，去上清后沉淀用水溶解后用定性滤纸过滤，之后滤液进行冷冻干燥。利用核磁共振、傅丽叶红外光谱、紫外分光光度计，检测聚合物的单体结构为β-D甘露糖醛酸、2-乙酰-β-D甘露糖醛酸、3-乙酰-β-D甘露糖醛酸、α-L-古洛糖醛酸、2-乙酰-α-L-古洛糖醛酸、3-乙酰-α-L-古洛糖醛酸。组成褐藻寡糖的六种单体结构如说明书附图1所示。
实施例2、两步法发酵制备褐藻寡糖(低碳无氮条件下的发酵)
前培养是在L-试管中，以无菌操作加入5ml LB培养基，以无菌牙签接入NK-01菌株的单菌落，30℃120rpm培养12h。将前培养物0.5ml接种至含有100ml LB培养基的500ml三角瓶中，28℃150rpm振荡培养24h。4℃，6000g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，再次在4℃，6000g无菌离心12min，弃上清。分别将不含LB培养基的菌体无菌接入10瓶含有100ml培养基2(pH7)的500ml三角瓶中，30℃，150rpm振荡培养。48小时后结束发酵，以下步骤同实施例1。
实施例3、一步法发酵制备褐藻寡糖(低碳低氮条件下的发酵)
前培养是在L-试管中，以无菌操作加入5ml LB培养基，以无菌牙签接入NK-01菌株的单菌落，30℃120rpm培养12h。将前培养物0.5ml接种至含有100ml LB培养基的500ml三角瓶中，30℃150rpm震荡培养24h。4℃，6000g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，再次在4℃，6000g无菌离心12min，弃上清。将不含LB培养基的菌体无菌接入可控氧搅拌式1升发酵装置中，装置内含有1升培养基3(pH6)，28℃，通气培养60h。以下步骤同实施例1。
实施例4、一步法发酵制备褐藻寡糖(低碳低氮条件下的发酵)
前培养是在L-试管中，以无菌操作加入5ml LB培养基，以无菌牙签接入NK-01菌株的单菌落，30℃120rpm培养12h。将前培养物0.5ml接种至含有100ml LB培养基的500ml三角瓶中，30℃150rpm震荡培养24h。4℃，6000g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，再次在4℃，6000g无菌离心12min，弃上清。将不含LB培养基的菌体无菌接入可控氧搅拌式1升发酵装置中，装置内含有1升培养基4(pH8)，35℃，通气培养60h。以下步骤同实施例1。
Claims (7)
1.利用门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)NK-01 CCTCC M 208005生产褐藻寡糖的用途。
2.利用门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)NK-01 CCTCC M 208005生产褐藻寡糖的方法，包括以下步骤：首先将该菌在含有5ml LB培养基的L管中进行活化培养，然后将活化的菌种接种到发酵培养基上培养，发酵结束以后离心除去菌体，上清液用3倍体积的无水乙醇沉淀，去上清后沉淀用水溶解，然后用定性滤纸过滤，之后滤液进行冷冻干燥，得产物褐藻寡糖。
3.根据权利要求2所述的一种生产褐藻寡糖的方法，其特征在于：所述发酵培养基的碳源包括葡萄糖或糖蜜或它们的混合物；氮源包括氯化铵或硫酸铵或硝酸铵或三者的任意混合物。
4.根据权利要求2或3所述的一种生产褐藻寡糖的方法，其特征在于：所述发酵培养过程中碳源浓度为5-10g/L，氮源浓度为0-1g/L。
5.根据权利要求2所述的一种生产褐藻寡糖的方法，其特征在于：所述菌体培养和发酵培养温度均为：28-35℃。
6.根据权利要求2所述的一种生产褐藻寡糖的方法，其特征在于：所述培养过程中的pH值为6.0-8.0。
7.根据权利要求2所述的一种生产褐藻寡糖的方法，其特征在于：所述菌体活化培养时间为8-12h；发酵培养时间为36-72h；发酵后上清液用无水乙醇沉淀时间为12h以上。
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